MRSA 耐性克服剤 cyslabdan の発見から 作用機序解析まで

抄録

1. 諸言

　近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）は、院内感染の原因菌として社会問題となっている。感染症の中でも、先進諸国では死亡率が非常に高い疾患であり有効な薬剤がほとんどないことから新たな抗 MRSA 剤の開発が強く求められている。このような背景のもと、我々の研究グループでは、臨床上重要な b-lactam 薬imipenem の抗MRSA 活性を回復させる物質を微生物資源より探索するという独自のアイデアに基づき研究を展開してきた。その過程において、放線菌 “Streptomyces cyslabdanicus” K04-0144 株の培養液中より、細胞壁をターゲットとする新しい作用機序を有する抗 MRSA 剤 cyslabdan を発見した。本討論会では、その発見に至る経緯から作用機序の解析について報告する。

2.Imipenem活性増強物質のスクリーニング¹⁾

　2 種類の培地（Mueller-Hinton 寒天平板培地と MRSA の生育に影響しない濃度 10 μg/mL のimipenem を含有するMueller-Hinton 寒天平板培地）の表面に、MRSA 菌液（1.0 x 10⁸ CFU/mL）を滅菌綿棒で塗抹し、37℃、20 時間培養後、ペーパーディスク法により、imipenem 含有培地でのみ阻止円を示す物質を検索した。放線菌や真菌を中心とする微生物培養抽出液（約 20,000 サンプル）について調べた結果、沖縄県石垣島の土壌より分離した放線菌 “S.cyslabdanicus” K04-0144 株の培養液中に強い活性を確認した。

3.放線菌 “S. cyslabdanicus” K04-0144 株の培養及び cyslabdan の単離精製及び構造解析¹⁾

　放線菌 “S. cyslabdanicus”K04-0144 株（Fig. 1）を種培養後、50 L の生産培地（主成分：各 1.0 % の oatmeal と Pharmamedia）に 1.0 % 植菌し、90 L Jar タンク培養装置を用いて、27℃、6 日間通気攪拌培養を行った。その培養液を遠心分離し、上清を合成吸着剤 Diaion HP-20 カラムに吸着後、水洗に続いてメタノールで活性物質を回収し、褐色油状物質（32 g）を得た。次に、これを蒸留水に溶解後、酢酸エチルで分配することで夾雑物を除去した後、減圧乾固することで褐色物質（27 g）を得た。続いて、このサンプルを ODS カラムにアプライした後、40 %~100% MeOH 水溶液を用いて精製し、活性を示す 80 % MeOH 画分を減圧乾固することで褐色物質（268 mg）を得た。続いて、これを分取 HPLC（カラム：PEGASIL ODS 4.6 x 250 mm、溶媒：0.05 % H₃PO₄を含有する 60 % CH₃CN 水溶液、流速：8 mL/min、検出：UV 210 nm）により最終精製した。保持時間 32 min の peak を繰り返し分取し、減圧濃縮後、Diaion HP-20 カラムで脱塩、さらに減圧乾固することで白色粉末の cyslabdan を収量 34 mgで得た。

　Cyslabdan は、UV 波長 232 nm に極大吸収を示し、IR スペクトル解析から、3427 cm^-1の吸収から水酸基の存在が示唆された。また高分解能 FAB-MS 測定から、その分子式を C₂₅H₄₁NO₅S と決定した。さらに、各種 NMR スペクトル解析の結果（Table １）から、labdan 型 diterpene を基本骨格とし、thioether を介して N-acetylcysteine 残基が連結した構造を有する新規物質であると決定した（Fig. 2）。さらに、labdan 型 diterpene 部分の立体化学については、NOE スペクトル解析の結果（Fig. 3）、 その相

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