[背景・目的]
テトロドトキシン (tetrodotoxin, TTX, 1) は、電位依存性ナトリウムチャネルを強力かつ選択的に阻害する神経毒であり、致死性の食中毒を引き起こす。TTXはフグ、巻貝、カニなどの海洋生物、および陸棲の両生類であるイモリやカエルに含まれ、世界中に分布する。この特異な構造が自然界でどのように構築されるかは予測が困難であり、TTXの生合成経路は未だ解明されていない。既に我々も含めた複数の研究グループが海洋由来のバクテリアによるTTXの生産を報告しており1)、TTXは食物連鎖により海洋生物へと蓄積されると考えている。一方、陸上におけるTTXの生産生物は未同定である。唯一のラベル化合物の投与実験として、清水らによるイモリへのarginine, acetate等の投与例があるがTTXはラベル化されず2)、遺伝子解析からTTXの生合成経路に言及した研究もこれまでない。そこで我々は、TTX類縁体の化学構造が生合成経路を反映していると考え、新規TTX類縁体（生合成中間体）を得るために質量分析器を駆使した網羅的な探索を実施してきた3)。そして最近、有毒のオキナワシリケンイモリ (Cynops ensicauda popei) から、TTXのC5-C10が直接炭素-炭素結合した10-hemiketal-typeの類縁体の4,9-anhydro-10-hemiketal-5-deoxyTTX (2) を発見した。化合物2は国内外の複数の有毒イモリに共通して存在していたため生合成中間体であると考え、2の特徴的な骨格構造からモノテルペンを出発物とする新たな生合成経路の可能性を考えた (Fig. 1)4)。本研究では、推定した経路を基に更なる生合成中間体を探索したので報告する。また未解明であるイモリにおけるTTXの起源を追及した。
Figure 1. Proposed biosynthetic pathway towards TTX based on the structure of 2.4)
1. 新規環状グアニジン化合物群とTTX生合成経路の考察
質量分析器を用いて推定した生合成経路における中間体を探索した。これまで我々は水溶性の高いTTX類縁体の探索法として、希酢酸加熱抽出、活性炭による前処理、HILIC-LC-MS/MS3c, 5)による解析を行ってきた。しかし、本研究のターゲットとなる生合成中間体はTTX類縁体よりも親水性が低いことが予想されたので、探索のステップをそれぞれメタノール抽出、ODSによる前処理、逆相カラムによるLC-MSへと変更し、より初期の生合成中間体に焦点を当てた探索法を新たに構築した。この疎水性化合物用の探索法と従来の親水性化合物用の探索法の二つの方法で予想生合成中間体の発見を目指した。
1-1. Cep-210, Cep-212の構造解析
疎水性化合物の探索では、C. e. popeiのメタノール抽出物から[M+H]+ m/z 210.1606 (C11H20N3O, err. 2.2 ppm, ESI-TOF-MS) の微量新規成分 (Cep-210, 3) を検出した。その分子式から、化合物3は予想生合成中間体に相当する可能性が考えられたため、大量抽出および単離・構造決定を試みた。化合物3をC. e. popeiの身体組織 (415 g、約70匹) からメタノールで抽出して分配操作を行った後、数種の逆相カラムと弱酸性陽イオン交換カラムを用いて単離した。得られた3（69 nmol、マレイン酸を内部標準として1H NMRの積分値より算出）をCD
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[背景・目的]
テトロドトキシン (tetrodotoxin, TTX, 1) は、電位依存性ナトリウムチャネルを強力かつ選択的に阻害する神経毒であり、致死性の食中毒を引き起こす。TTXはフグ、巻貝、カニなどの海洋生物、および陸棲の両生類であるイモリやカエルに含まれ、世界中に分布する。この特異な構造が自然界でどのように構築されるかは予測が困難であり、TTXの生合成経路は未だ解明されていない。既に我々も含めた複数の研究グループが海洋由来のバクテリアによるTTXの生産を報告しており1)、TTXは食物連鎖により海洋生物へと蓄積されると考えている。一方、陸上におけるTTXの生産生物は未同定である。唯一のラベル化合物の投与実験として、清水らによるイモリへのarginine, acetate等の投与例があるがTTXはラベル化されず2)、遺伝子解析からTTXの生合成経路に言及した研究もこれまでない。そこで我々は、TTX類縁体の化学構造が生合成経路を反映していると考え、新規TTX類縁体（生合成中間体）を得るために質量分析器を駆使した網羅的な探索を実施してきた3)。そして最近、有毒のオキナワシリケンイモリ (Cynops ensicauda popei) から、TTXのC5-C10が直接炭素-炭素結合した10-hemiketal-typeの類縁体の4,9-anhydro-10-hemiketal-5-deoxyTTX (2) を発見した。化合物2は国内外の複数の有毒イモリに共通して存在していたため生合成中間体であると考え、2の特徴的な骨格構造からモノテルペンを出発物とする新たな生合成経路の可能性を考えた (Fig. 1)4)。本研究では、推定した経路を基に更なる生合成中間体を探索したので報告する。また未解明であるイモリにおけるTTXの起源を追及した。
Figure 1. Proposed biosynthetic pathway towards TTX based on the structure of 2.4)
1. 新規環状グアニジン化合物群とTTX生合成経路の考察
質量分析器を用いて推定した生合成経路における中間体を探索した。これまで我々は水溶性の高いTTX類縁体の探索法として、希酢酸加熱抽出、活性炭による前処理、HILIC-LC-MS/MS3c, 5)による解析を行ってきた。しかし、本研究のターゲットとなる生合成中間体はTTX類縁体よりも親水性が低いことが予想されたので、探索のステップをそれぞれメタノール抽出、ODSによる前処理、逆相カラムによるLC-MSへと変更し、より初期の生合成中間体に焦点を当てた探索法を新たに構築した。この疎水性化合物用の探索法と従来の親水性化合物用の探索法の二つの方法で予想生合成中間体の発見を目指した。
1-1. Cep-210, Cep-212の構造解析
疎水性化合物の探索では、C. e. popeiのメタノール抽出物から[M+H]+ m/z 210.1606 (C11H20N3O, err. 2.2 ppm, ESI-TOF-MS) の微量新規成分 (Cep-210, 3) を検出した。その分子式から、化合物3は予想生合成中間体に相当する可能性が考えられたため、大量抽出および単離・構造決定を試みた。化合物3をC. e. popeiの身体組織 (415 g、約70匹) からメタノールで抽出して分配操作を行った後、数種の逆相カラムと弱酸性陽イオン交換カラムを用いて単離した。得られた3（69 nmol、マレイン酸を内部標準として1H NMRの積分値より算出）をCD3ODに溶解させ、各種NMR (600 MHz) に供し、構造を解析した。化合物3は極めて微量であったが、交換性プロトンを除く全てのプロトンシグナルおよび、HSQC, HMBCを用いて全てのカーボンシグナルを帰属した。4つの四級炭素はそれぞれグアニジン基のC2 (dC 154.8 ppm)、アルケンのC5 (dC 136.3 ppm), C6 (dC 132.6 ppm)、グアニジンに隣接するC8a (dC 60.0 ppm) と帰属でき、化合物3を含グアニジン6員環と5員環が縮環した二環性の化合物だと推定した。COSYではH4/H4a, H9/H10の相関の他、H10/11-CH3との間でアリル位のlong-range couplingが見られた。また、NOESY1DにおいてH4aと8-CH3の間で相互にNOEが観測されたことからシス型に縮環していると考えられ、更にH10と11-CH3の間では相互にNOEが見られ、H4aに照射した際にH7とのNOEも見られたことからexo位の二重結合はZ体だと推定した (Fig. 2)。
Figure 2. The planner structures and 2D NMR correlations of the novel cyclic guanidine compounds, 3 and 4, and their proposed stereochemistry with key NOEs.
同様の探索法で、[M+H]+ m/z 212.1757 (C11H22N3O, err. 0.3 ppm, ESI-TOF-MS) の新規成分 (Cep-212, 4) を得た。化合物4を3とほぼ同様の方法で精製し、各種NMRで構造解析したところ3と同じ骨格構造を持つ化合物と推定された (Fig. 2)。収量が少なくC2/H4の相関をHMBCで見ることが出来なかったため、グアニジン炭素のC2のケミカルシフトのみ未決定だが、陽イオン交換カラムに保持される特徴とC4 (dC 40.1 ppm), C8a (dC 62.2 ppm) のケミカルシフトが3と類似していること (C4: 40.7 ppm, C8a: 60.0 ppm in 3)、さらにMS/MSスペクトルのフラグメンテーションパターンからグアニジン基の存在が強く示唆された。NOESY1DではH4aと8-CH3、H4aと7-CH3、H4aと11-CH3の間で相互にNOEが観測され、H4aとH5の間でNOEが見られないことなどから、相対立体配置をFig. 2のように推定している。
1-2. Cep-242, Cep-242-hemiketalの構造解析
従来の親水性化合物用の探索法でも新規環状グアニジン化合物を発見した。C. e. popeiの希酢酸抽出物をHILIC-LC-MSにて精査したところ、[M+H]+ m/z 242.1500 (C11H20N3O3, err. 0.2 ppm, ESI-TOF-MS) の新規成分 (5) が検出された。化合物5をC. e. popeiの身体組織 (235 g) から希酢酸で加熱抽出し、活性炭カラム、数種の弱酸性陽イオン交換カラム、およびHILICカラムを用いて精製した。得られた5 (2.2 μmol) をNMRに供したところ (600 MHz, CD3COOD-D2O 4:96, v/v, 20°C)、二成分の混合物(Cep-242 (5a), Cep-242-hemiketal (5b), 5a:5b approximately 8:3) であることが示された。化合物5aは各種NMRの解析から含グアニジン6員環と7員環がシス型に縮環した構造と推定され、5bは5aと類似のNMRスペクトルを与えたものの、C6, C9のケミカルシフトがそれぞれdC 84.9 ppm, 105.4 ppmと 5aのC6, C9のケミカルシフト (dC 75.2 ppm, 210.8 ppm) と大きく異なる値を与えており、9位ケトンと6位ヒドロキシ基でhemiketalを形成したと考えられた (Fig. 3)。更に、同タイプの化合物2種を有毒イモリから得ており、詳細な解析を進めている。
Figure 3. The planner structures and 2D NMR correlations of the novel cyclic guanidine compounds, 5a and 5b, and their proposed stereochemistry with key NOEs.
1-3. 生合成経路の考察
得られた新規環状グアニジン化合物群と生合成経路の関連を考察するために3−5の分布を調査した。各種イモリをLC-MSで分析したところ、いずれの化合物も国内外に生息するCynops, Taricha, Notophthalmus属の多種の有毒イモリから検出された。その一方で、TTXを持たない、あるいは極微量にしか含まないイモリからは3−5は検出されず、化合物3−5が有毒イモリに共通かつ特異的な成分だと示された。しかし、化合物3, 4は有毒イモリに含まれるTTXの0.3 – 3%程度と微量にしか存在せず、自然界には生合成過程における初期段階の中間体として痕跡量程度に存在すると推察された。
我々は出発物質であるゲラニル二リン酸に対するにアミノ化、アミジノ基の転移を経てグアニジン基が導入され、geranyl guanidineが生成すると予想しているが、3, 4はgeranyl guanidineが環化・酸化することで生成した化合物として妥当な構造を有している (Fig. 4)。更に5についてもTTXや予想していた生合成中間体とは異なる骨格構造ではあったが、N1-C8a, C4a-C7間でgeranyl guanidineが環化した化合物だと考えており、副生成物に相当すると推定している (Fig. 4)。化合物3, 4が真にTTXの生合成中間体であるどうかは現状判断しきれないが、化合物3−5の化学構造と有毒イモリにのみ広範に分布する特徴から、これらはTTXの関連物である可能性が高く、我々の提唱するモノテルペン説が支持されたと捉えている。これまで当研究グループでは様々な類縁体を報告してきたが、8位ヒドロキシ基が還元された類縁体は天然には存在しないため、C7-C8の結合・環化にはC8の酸化が必須だと想定している。また、我々はイモリに特異的な成分として6-epi体、8-epi体のTTX類縁体を報告したが3b)、環化の際にこれらのエピマーが生成すると考えている。今後、更なる生合成中間体の同定、並びに関連が推測される生合成酵素を指標として生合成遺伝子を探索し、生合成経路の全貌解明を目指す。
Figure 4. The possible biosynthetic routes of the novel cyclic guanidine compounds obtained from the toxic newts.
2. イモリにおけるTTXの起源
TTXの起源同定は生合成経路の解明において重要な課題であるが、イモリの毒の起源は内因性か外因性か長年議論されており、不明なままだった。そこで日本に生息する有毒種のアカハライモリ (C. pyrrhogaster) の受精卵を研究室で孵化させ、得られた幼生、変態後の幼体を無毒の餌で70週齢になるまで飼育し、毒の含有量をHILIC-LC-MSで調べた (TTX: [M+H]+ m/z 320.1088)。70週齢まで飼育した全てのイモリで毒が検出されない一方で (TTX: <15.2 ng/g, n = 10)、同サイズ、同地域に由来する野生の幼体イモリはいずれもTTXとその類縁体を保持しており (TTX: 1250 – 13800 ng/g, n = 5)、イモリが人工飼育下で毒の生産能を持たないことが示された (Fig. 5A, B)6)。さらに、飼育した無毒イモリに単離したTTXを餌と共に経口投与し、一か月後にその毒量を調べると、イモリの身体組織へのTTXの蓄積が確認された (Fig. 5C)。また、生合成中間体だと考えている2 ([M+H]+ m/z 286.1034) を無毒イモリに経口投与させた場合にも、2の蓄積が確認でき (Fig. 5D)、イモリがTTXとその類縁体をそれぞれ区別なく蓄積することが考えられた。投与したTTXは平衡関係にある4-epiTTX, 4,9-anhydroTTXに変換されたが、他の既知TTX類縁体への変換は一切認められず、2に関してもTTXや他の類縁体に変換されなかった。これらの結果は、イモリは供給されたTTXおよび類縁体（推定生合成中間体）を単に蓄積する能力しか持たないこと、つまり毒が外因性であることを強く支持している。今後、陸上における真のTTX生産生物の同定を目指す。
Figure 5. The LC-MS chromatograms of the extract of the Cynops pyrrhogaster, (A) wild-caught juvenile newt, (B) 70-week-old captive-reared newt, (C) newt orally administrated TTX, (D) newt orally administrated compound 2.
[謝辞]
日本学術振興会より最先端・次世代研究開発支援プログラム (LS012)、科学研究費 (no. 26292057) および特別研究員制度 (DC1) の助成を得た。貴重なサンプルをご提供頂いた安元 健 東北大学名誉教授 (日本食品分析センター) とProf. Dietrich Mebs (University of Frankfurt, Germany) に深謝いたします。
[文献]
1) Yasumoto, T. et al. Agric. Biol. Chem. 1986, 50, 793-795.
2) Shimizu, Y. and Kobayashi, M. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 1983, 31, 3625-3631.
3) a) Yotsu-Yamashita, M. J. Toxicol. Toxin Rev. 2001, 20, 51-66. b) Kudo, Y. et al. Mar. Drugs 2012, 10, 655-667. c) Yotsu-Yamashita, M. et al. Mar. Drugs 2013, 10, 2799-2813. d) Kudo, Y. et al, J. Nat. Prod. 2014, 50, 1000-1004.
4) Kudo, Y. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 14546-14549.
5) Yotsu-Yamashita, M. et al. Forensic Toxicol. 2011, 29, 61-64.
6) Kudo, Y. et al. Toxicon 2015, 101, 101-105.
