天然有機化合物討論会講演要旨集
Online ISSN : 2433-1856
58
会議情報

シアリダーゼの機能解析を志向した3位修飾型シアル酸誘導体の合成と活性評価
深澤 亮平井 剛加藤 麻理依大沼 可奈越野 広雪袖岡 幹子
著者情報
会議録・要旨集 フリー HTML

p. Oral12-

詳細
シアリダーゼの機能解析を志向した3位修飾型シアル酸誘導体の合成と活性評価

【背景・目的】

シアリダーゼ(ノイラミニダーゼ)は、複合糖質の非還元末端からシアル酸を除去する酵素である。ウイルスやバクテリアのシアリダーゼは感染・増殖に深く関与していることから、これらに対する阻害剤が多数開発されてきた。そのほとんどは、加水分解の遷移状態構造を模倣したDANA(1、Figure 1)を起点として開発されており1)、Zanamivir(リレンザ)1a)やLaninamivir(イナビル)1b)などが代表例である。

しかしながら、阻害剤だけでは生物現象とシアリダーゼ機能を分子レベルで議論することは困難である。シアル酸は、糖タンパク質、糖脂質(ガングリオシド)の両方に存在し、またその構造はガラクトースとの連結様式だけで2,6-と2,3-の2パターンが知られている。シアリダーゼの基質選択性が厳密ではないので、酵素-基質の組み合わせは複数の可能性を考える必要がある。我々は、“どのシアリダーゼがどのシアロ糖鎖からシアル酸を切断したか”を解析できれば、基質も含めたシアリダーゼの機能解明に繋がると考えた。そこで本研究では、これを実現できるSubstrate-Specific Metabolism Monitoring(SMM)プローブの開発を目標とした。

SMMプローブに求められる性質は、①興味対象のシアロ糖鎖と同様の構造を有し、②これがシアリダーゼによって基質として認識され、③分解される際にシアリダーゼと共有結合を形成する、ことである。似たようなプローブとして、3位にF原子を持つシアル酸単糖構造の2が挙げられる2)。2はシアリダーゼの基質となるものの、カチオン性中間体3がF原子の電子求引性により不安定化されるため、シアリダーゼと共有結合を形成した複合体4の寿命が長くなる。これを検出することで“どのシアリダーゼが活性を持っていたか”を解析できるactivity-based probeとして、利用できる可能性が示唆されている3)。しかしながら、2の基質としての反応性がF原子によって低下するため、XにはF原子などの脱離基が必須であり、糖質構造を導入すること、すなわち上記の①の性質を持たせることができなかった。そこで本研究では、SMMプローブとなりうる新しいシアロ糖鎖アナログを考案し、その合成法開発と機能解析に取り組んだ。

Figure 1. SMMプローブとシアリダーゼ阻害剤及び機能解析プローブ

【分子設計】

今回先に示した要件をすべて満たすシアリダーゼのSMMプローブとして、3位にメチレン基を導入したシアロ糖鎖誘導体5を設計した。5は、電子求引基を持たず、また3位sp2炭素によって遷移状態様のコンホメーションに歪むことが予想される。このことで、シアリダーゼに対する親和性と基質としての反応性を低下させず、むしろ向上させることができ、Rに糖鎖構造を導入可能と期待した。さらに5がシアリダーゼの基質になると6を生成する。6は活性化されたMichael受容体と見ることができ、近傍の求核性アミノ酸と反応して、シアリダーゼと共有結合を形成できると考えた。今回我々は、アルキル基やアリール基を有する単糖型の5a-b、および二糖型の5c-dの合成を目指した(Figure 2)。

Figure 2. SMM(Substrate-Specific Me

(View PDFfor the rest of the abstract.)

【背景・目的】

シアリダーゼ(ノイラミニダーゼ)は、複合糖質の非還元末端からシアル酸を除去する酵素である。ウイルスやバクテリアのシアリダーゼは感染・増殖に深く関与していることから、これらに対する阻害剤が多数開発されてきた。そのほとんどは、加水分解の遷移状態構造を模倣したDANA(1Figure 1)を起点として開発されており1)、Zanamivir(リレンザ)1a)やLaninamivir(イナビル)1b)などが代表例である。

しかしながら、阻害剤だけでは生物現象とシアリダーゼ機能を分子レベルで議論することは困難である。シアル酸は、糖タンパク質、糖脂質(ガングリオシド)の両方に存在し、またその構造はガラクトースとの連結様式だけで2,6-と2,3-の2パターンが知られている。シアリダーゼの基質選択性が厳密ではないので、酵素-基質の組み合わせは複数の可能性を考える必要がある。我々は、“どのシアリダーゼがどのシアロ糖鎖からシアル酸を切断したか”を解析できれば、基質も含めたシアリダーゼの機能解明に繋がると考えた。そこで本研究では、これを実現できるSubstrate-Specific Metabolism Monitoring(SMM)プローブの開発を目標とした。

SMMプローブに求められる性質は、①興味対象のシアロ糖鎖と同様の構造を有し、②これがシアリダーゼによって基質として認識され、③分解される際にシアリダーゼと共有結合を形成する、ことである。似たようなプローブとして、3位にF原子を持つシアル酸単糖構造の2が挙げられる2)2はシアリダーゼの基質となるものの、カチオン性中間体3がF原子の電子求引性により不安定化されるため、シアリダーゼと共有結合を形成した複合体4の寿命が長くなる。これを検出することで“どのシアリダーゼが活性を持っていたか”を解析できるactivity-based probeとして、利用できる可能性が示唆されている3)。しかしながら、2の基質としての反応性がF原子によって低下するため、XにはF原子などの脱離基が必須であり、糖質構造を導入すること、すなわち上記の①の性質を持たせることができなかった。そこで本研究では、SMMプローブとなりうる新しいシアロ糖鎖アナログを考案し、その合成法開発と機能解析に取り組んだ。

Figure 1. SMMプローブとシアリダーゼ阻害剤及び機能解析プローブ

【分子設計】

今回先に示した要件をすべて満たすシアリダーゼのSMMプローブとして、3位にメチレン基を導入したシアロ糖鎖誘導体5を設計した。5は、電子求引基を持たず、また3位sp2炭素によって遷移状態様のコンホメーションに歪むことが予想される。このことで、シアリダーゼに対する親和性と基質としての反応性を低下させず、むしろ向上させることができ、Rに糖鎖構造を導入可能と期待した。さらに5がシアリダーゼの基質になると6を生成する。6は活性化されたMichael受容体と見ることができ、近傍の求核性アミノ酸と反応して、シアリダーゼと共有結合を形成できると考えた。今回我々は、アルキル基やアリール基を有する単糖型の5a-b、および二糖型の5c-dの合成を目指した(Figure 2)。

Figure 2. SMM(Substrate-Specific Metabolism Monitoring)プローブの設計

3位ケト体を経由した合成の試み】

3-ケトシアル酸合成の試み

3位に炭素置換基を有するシアル酸誘導体の合成例は1例のみ報告されており4)、またエキソメチレン体の例はなかった。我々は当初、化合物5を単純な官能基変換反応、すなわち3位ケト体のメチレン化反応で合成可能と考えていた。まずアノマー位にp-ニトロフェノキシ基を有する5bを標的分子とし、7段階で文献既知の85)を調製した。3位水酸基の酸化を種々検討したが、3位の水酸基の反応性は低く、ほとんどの条件で原料を回収するのみであった。1-Me-AZADO6)を用いると8が消費されたものの、望む9は全く生成せず、複雑な混合物を与えた(Scheme 1)。9は歪んだ6員環とβ-ケトエステル構造を持つことから、9はretro-Claisen反応によって分解したと考えた。これを防げば3-ケト体が安定化すると考え、1位を還元した10からメチレン体11を合成し、酸化して5を得ようと考えた。

Scheme 1. 3-ケト体10を経由した合成計画

3-ケト体のメチレン化の試み

Ac基を有する8の水酸基をTriBOT-PM7)を用いてMPM化し12を得た(Scheme 2)。すべてのAc基をTES基に変更し13とした後、LiBH4で1位を還元した8)。生じた水酸基をPiv基で保護し14を得た後、3位MPM基をDDQ酸化により除去しアルコール15へと導いた。15の水酸基を先と同様1-Me-AZADOで酸化すると、期待通り3位ケト体16を64%の収率で得ることに成功した。これをTebbe試薬で処理したところ、望むメチレン体17を与えず、エノン体18が生成した。18のケトンが反応条件下エノール化し、シリルエノールエーテルとなった後、TES基の転位とp-ニトロフェノールのβ脱離を経て18を与えたと考えられる。その他、メチレン化を種々検討したが、17を得ることは出来なかった。

Scheme 2. 3-ケト体16の合成とメチレン化の検討

Au錯体を利用したグリコシル化反応によるSMMプローブ合成】

3-ケト体からの合成は困難と考え、2位4置換炭素と3位エキソメチレン基を同時に構築できる新たな合成法を立案した(Scheme 3)。DANAの3位を1炭素増炭した19をグリコシルドナーとして用い、LGを活性化することで、オキソニウム種20が生じる。アクセプターが3’位ではなく、2位と選択的に反応すれば、望む21を合成できると考えた。ポイントは、位置および立体選択性の制御であるが、適切な脱離基LGと活性化法の選択も重要と考えた。すなわち、より不安定と推測される21を再活性化させず、19を選択的に活性化する必要があると考えられた。

Scheme 3. Au錯体を利用したグリコシル化反応を基盤とする合成計画

シアル酸3位メチレン基導入法の開発

今回脱離基LGとしてo-アルキニルベンゾエートを導入した27を前駆体と設定し、金錯体による活性化法9)を利用することを計画した(Scheme 4)。前駆体27の合成を目指し、3位への直接1炭素ユニット導入を種々検討したが、良い結果を与えなかった。そこで、報告されている3位アリル体224)から2炭素減炭することを考えた。まず22をBr化によって23とした後、DBUで処理しジエン24に変換した。2重結合を酸化開裂してアルデヒド25とし、これをアリルアルコール26に還元した。26は容易にラクトン化してしまうため、即座に脱離基を導入し27を得た。

Scheme 4. グリコシルドナー35の合成

1級アルコール31aをアクセプターとするグリコシル化反応を検討した(Figure 3)。ドナー2731aをPh3PAuNTf2で処理すると、望まない3’位付加体29a(44%)や脱離基が3’位に付加した30が副生(12%)したものの、望む2位付加体28aを立体異性体の混合物として得ることに成功した(44%、α:β = 1:1)。そこで、p-ニトロフェニル体5bや2糖型5c-dの合成を狙い、31b-dとのグリコシル化を検討した。しかしながら、2位付加体28をほとんど与えず、1級水酸基を求核剤とする31cとの反応でも、望まないβ面から付加したβ-28cしか生成しなかった。2位のα面からの接近は立体的に不利であり、2930の生成が優先したと考えられた。

Figure 3. グリコシルドナー35用いたグリコシル化反応の検討

位置及び立体選択的グリコシル化と二糖型プローブの合成

C2位α面からのアクセプターの接近を促進するため、7位にピコロイル(Pico)基を有するドナー36を設計した10)Scheme 5)。36から生じる中間体37において、アクセプター水酸基(HOR)がPico基と水素結合を形成すれば、近接場効果によって位置および立体選択的にグリコシル化反応が進行すると考えた。ドナー36は、先の中間体24より7工程で合成した。

Scheme 5. 7位にPico基を持つグリコシルドナー36の合成

ドナー36とアクセプター31a-d’ の反応を先と同様の条件で検討した(Scheme 6)。いずれの場合も、収率は中程度に留まったものの、反応の位置及び立体選択性が劇的に改善され、生成物38 a-d’ を選択的に得ることに成功した。38bからの保護基の除去は出来なかったが、他の生成物は問題なく5a5c5dに誘導でき、設計したSMMプローブの合成を達成した。

Scheme 6. 位置及び立体選択的なグリコシル化反応とプローブ合成

【プローブの1次評価:シアリダーゼ阻害活性】

購入可能なシアリダーゼに対する5a5c5dの活性を評価したところ、シアリダーゼ阻害活性が確認された。

【謝辞】

本研究に対しご助言を頂きました、宮城妙子先生(宮城県立がんセンター研究所)、高橋耕太博士(東北薬科大学)、シアル酸をご恵与くださいました伊藤幸成先生(理研)に深謝いたします。本研究の一部は、JSPS科研費中分子戦略(JP16H01167)、挑戦的萌芽研究(JP15K12760)による助成を受けて遂行したものです。

【参考文献】

1) a) von Itzstein, M.; Wu, W. Y.; Kok, G. B.; Pegg, M. S.; Dyason J. C.; Jin, B.; Van Phan, T. Smythe M. L.; White, H. F.; Oliver, S. W.; Colman, J. N.; Varghese, J. N.; Ryan, D. M.; Woods, J. M.; Bethell, R. C.; Hotham, V. J.; Cameron, J. M.; Penn, C. R. Nature 1993, 363, 418-423. b) Yamashita M.; Tomozawa, T.; Kakuta, M.;Tokumitsu, A. ; Nasu, H.; Kubo, S. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 186-192.

2) a) Withers, S. G.; Street, I. P.; Bird, P.; Dolphin, D. H. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7530; b) Kim, J.-H.; Resende, R.; Wennekes, T.; Chen, H. -M.; Bance, N.; Buchini, S.; Watts, A. G.; Pilling, P.; Streltsov, V. A.; Niikura, M.; Withers, S. G. Science. 2013, 340, 71-75.

3) Tsai, C.-S.; Yen, H.-Y.; Lin, M.-I.; Tsai, T.-I.; Wang, S.-Y.; Huang, W.-I.; Hsu, T.-L.; Cheng, Y.-S., E.; Fang, J.-M.; Wong, C.-H.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013, 110, 2466-2471.

4) Rudrawar, S.; Pascolutti, M.; Bhatt, B.; Thomson, R. J.; von Itzstein, M. Tetrahedron. Lett. 2013, 54, 1198-1201.

5) Sun, X. -L.; Kanie, Y.; Guo, C. -T.; Kanie, O.; Suzuki, Y.; Wong, C.-H. Eur. J. Org. Chem. 2000, 2643-2653.

6) Shibuya, M.; Tomizawa, M.; Suzuki, I.; Iwabuchi, Y. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 8412-8413.

7) Yamada, K.; Fujita, H.; Kitamura, M.; Kunishima, M. Synthesis 2013, 45, 2989-2997.

8) Ye, X.-S.; Huang, X.; Wong, C.-H. Chem. Commun., 2001, 974-975.

9) a) Li, Y.; Yang, X.; Zhu, C.; Yu, B. Chem. Eur. J. 2010, 16, 1871-1882; b) Kashyap. S.; Vidadala, S. R.; Hotha, S.; Tetrahedron. Lett. 2007, 48, 8960-8962; c) Mallick, A.; Mallikharjunarao, Y.; Rajasekaran, P.; Roy, R.; Vankar, Y. D.; Eur. J. Org. Chem. 2016, 579-588.

10) Yasomanee, J. P.; Demchenko A. V. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 20097-20102.

 
© 2016 天然有機化合物討論会電子化委員会
feedback
Top