天然有機化合物討論会講演要旨集
Online ISSN : 2433-1856
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非リボソーム性ペプチド合成酵素の選択的ラベル化技術の開発と迅速機能解析システムの構築
石川 文洋今野 翔笠井 昭太鈴木 健裕堂前 直掛谷 秀昭
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p. Oral38-

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抄録

【序論】

微生物が産生するペプチド性天然有機化合物 (cyclosporin、vancomycin、bleomycinなど) は、構造上、極めて多様性に富み強力な生理活性を有することから、将来にわたる医薬品の探索・供給源として有望視されている。しかしながら、容易に獲得できる資源は枯渇しつつあるといっても過言ではない。今後の医薬資源の開発において、多様性に富む化合物群を効率的に創出 (非天然型化合物ライブラリーの構築) し、迅速な構造活性相関研究を進め、創薬シーズとして提供できるかが鍵となる。ペプチド性天然化合物の多くは、非リボソーム性ペプチド合成酵素 (NRPS) と呼ばれる酵素群により合成される。NRPSはadenylation (A)、thiolation (T)、condensation (C) domainを基本構成単位として有している。A-domainは、非常に厳密な基質特異性を有し、20種類の天然アミノ酸や非天然アミノ酸の生体内プールから特異的に1つをアミノアシル-AMPに活性化する(Figure 1)。すなわち、A-domainはペプチド性天然化合物合成における ”gatekeeper” としての役割を担っている。そのため、非天然型化合物創出へ向けたprecursor-directed biosynthesis (PDB)、mutasynthesis、進化分子工学の標的タンパク質となっている1)。多様性に富む非天然型化合物の合理的設計・創出には、A-domainの酵素システムを理解することに加えて、迅速、簡便、網羅的な機能解析法が必要不可欠である。我々は、厳密な基質特異性を有するA-domainの酵素的性質を利用することにより、テーラーメイドなA-domainのラベル化技術を開発してきた2)-4)。本発表では、1) A-domain選択的ラベル化技術、2) 迅速かつ網羅的機能解析技術について報告する。

Figure 1. NRPS A-domainの触媒機構。

【A-domain選択的ラベル化技術の開発】

放線菌から単離された核酸系抗生物質ascamycinの脱クロロ誘導体5′-O-N-(L-alanyl)sulfamoyl adenosine (L-Ala-AMS) が、アラニルtRNA合成酵素によるアミノアシル化反応の高反応性中間体であるL-Ala-adenosine monophosphate (AMP)の生物学的等価体であることが示された (Figure 2a)5)。その後、aminoacyl-AMSは、種々のtRNA合成酵素のX線結晶構造解析を行うためのリガンド分子として用いられてきた6)。そのため、aminoacyl-AMS はtRNA合成酵素と同様の反応を触媒するNRPS A-domainのリガンドに応用できると期待した。さらに、種々のアミノ酸に入れ替えることによって、個々のA-domainに対する選択性を付与できると期待した。そこで、1. aminoacyl-AMSリガンド、2. 近傍の標的タンパク質と光化学反応により共有結合形成可能なベンゾフェノン、3. クリックケミストリーにより、蛍光標識あるいはビオチン官能基を導入可能なアルキンからなるA-domain選択的ラベル化剤 (aminoacyl-AMS-BPyne) の設計を行った (Figure 2a)。また、多くのA-domainはアデノシン骨格の2′-OH基への化学修飾に寛容であるため7)、2′-OH基にBPyneリンカーを導入した。続いて、L-Phe、L-Pro、L-Val、L-Orn、L-Leuをリガンド部に有するA-domaimラベル化剤の合成を行った。環状ペプチド性抗生物質であるgramicidin Sは、Aneurinibacillus migulanusにより産生される。そこで、内在性gramicidin S NRPS [GrsA (127 kDa): APhe-T-epimerase (E)、GrsB (508 kDa): C-AP

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© 2016 天然有機化合物討論会電子化委員会
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