天然有機化合物討論会講演要旨集
Online ISSN : 2433-1856
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ジテルペン環化酵素が触媒する多段階反応機構の解明
寺本 和矢目黒 亜由子本吉 祐大佐藤 玄増本 優衣手塚 則亨坂井 健太上田 翔太遠塚 悠輔安藤 祐美富田 武郎金 承栄木村 智之五十嵐 雅之澤 竜一
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p. Oral40-

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抄録

 テルペノイドは最大の天然有機化合物群であり,多様な構造と生理活性を有することから医薬品だけでなく添加物や工業原料として様々な場面で利用されている。その生合成は,基質であるイソプレニル二リン酸の合成,テルペン環化酵素による環状骨格の形成,水酸化酵素や糖転移酵素等による修飾の各段階からなる。なかでもテルペン環化酵素が担う骨格形成反応は,単独の酵素による分子内カチオン転位反応によって複雑な多環式化合物を立体選択的に一挙に作り出すことから,テルペノイドにおける構造多様性を生み出す鍵反応であるとともに,その反応は厳密な制御下で進行すると推察される。我々はこのテルペン環化酵素の反応制御機構を明らかにすることで,複雑な骨格構造を有するテルペン化合物を合成する新たな生体触媒を開発できることを期待している。

 本討論会で我々は,放線菌の生産するジテルペン化合物cyclooctatin1 の各生合成段階を担う酵素の同定と機能解析に関して報告する。特に環状骨格形成段階を担うジテルペン環化酵素CotB2の反応機構について,安定同位体で標識した各種基質を用いたin vivoとin vitro実験により反応機構の解析を行うとともに,量子化学計算を用いて実験的には捕捉が困難なカチオン中間体や遷移状態の知見を得ることで,環状骨格構造の変化を伴わない炭素−炭素結合の組換えという特異な環化反応過程の詳細を明らかにした。

1, cyclooctatin生合成遺伝子クラスターの同定

 放線菌Streptomyces melanosporofaciens MI614-43F2が生産するcyclooctatinは,lysophospholipidを加水分解するlysophospholipaseの阻害活性を示し,抗炎症作用を示すリード化合物のスクリーニングにより同定された1。我々は,研究開始当時,二リン酸基の脱離により反応を開始するclass Iジテルペン環化酵素に関する細菌からの報告例がなかったこと,またcyclooctatinが5-8-5員環の縮合した特徴的な三環式骨格を有することからその詳細な生合成機構の解明を目指した。

 まず我々はS. melanosporofaciens MI612-43F2ゲノムのコスミドライブラリーを作製し,その中からGGDP合成酵素 (CotB1),ジテルペン環化酵素 (CotB2),2つのシトクロムP450 (CotB3, CotB4)をコードするcyclooctatin生合成遺伝子クラスターを見出した (Fig. 1a)。このクラスターのクローニングと遺伝子破壊実験から,CotB1がdimethylallyl diphosphate (DMAPP) 1分子とisopentenyl diphosphate (IPP) 3分子から炭素数20のgeranylgeranyl diphosphate (GGDP) (1)を合成した後に,CotB2が三環式生合成中間体cyclooctat-9-en-7-ol (2)を合成し,続いてCotB3, CotB4の順に5位, 18位に水酸基を導入することでcyclooctatinが生合成されることを明らかにした (Fig. 1b)2

2, [U-13C6]glucoseを用いたin vivo取り込み実験

 cyclooctatin生合成においてCotB2は,不斉点を持たない非環状化合物GGDPを基質として6つの不斉点を持ち三環が縮合した (2R,3R,6R,7S,11R,14R)-cyclooctat-9-en-

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