天然有機化合物討論会講演要旨集
Online ISSN : 2433-1856
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ネオマクロフォリン類の単離・構造決定及び生理活性
橋本 勝廣瀬 あかね本村 優奈日下部 一晃上杉 祥太殿内 暁夫前多 隼人根平 達夫木村 賢一
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ネオマクロフォリン類の単離・構造決定及び生理活性

白神山地は1993年に登録されたUNESCO世界自然遺産として知られている。報告者らはこの地域の微生物を遺伝子資源ととらえ、有用二次代謝物の探索研究を展開、これまで複数の新規天然物を単離してきた。今回、弘前大学白神自然観察園で採取したDaedaleopsis tricolor(チャカイガラタケ)に寄生するTrichodermasp. 1212-03の培養液から新規ドリマン型ジテルペンであるネオマクロフォリン I-VI (1-6)、及びその生合成前駆体と考えられるプレマクロフォリン (7)を単離した1

【単離と構造決定】

Trichodermasp. 1212-03培養液の酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーなどを用いてこれら化合物を精製した。まず、ネオマクロフォリンI (1) の構造を解析した。ESIMSスペクトルはプロトン化した分子イオンをm/z477.2493に与えたことから分子式C26H36O8を推定、さらにNMR解析により3-位にアクシアル水酸基を有するドリマン誘導体であると決定した。H-9はH-5’との間に明確なNOEを与えたが、分子モデリングの結果、(9S*,5’R*)-異性体では、安定配座(図1)においてH‑9/H‑5’間距離は近く観測したNOEを説明できるが、その異性体の安定配座ではこれを説明出来ないことから、ドリマン環部とエポキシキノン環部との相対立体配置を決定した。

側鎖のC-4”メチル基は19.51 ppmに観測された。複数の2,3-ジヒドロキシブタン酸エステルの文献値を調査したところ、threo-体の場合4-位メチル基は19.5 ppm付近に、erythro-体のそれは17.5 ppm付近に普遍的に現れることを見出し、threo-体と決定した。また、プロトン非デカップリング13Cスペクトル等より3JCH, 3JHH値(3JC-1”/H-3” = ca 1 Hz, 3JH-2”/H-3” = 2.3 H, 3JH-3”/C-4” = 2.0 Hz)を帰属したところ、図2のような関係を帰属し、先の相対配置に矛盾しないことを確認した。

2では13C NMRカルボニルシグナルが1個減少した。NMRの解析により、2は1の4’-位アルコール体であると結論した。JH-4’/H’-5は0.9 Hzであり二面角H‑C4’‑C5’‑H90°が示唆された。分子モデリング等によりトランス配置と推定したが、シス異性体でも対応する二面角は約60°であり、観測したスピン結合を完全に否定できるものではなかった。最終的には後述するECDによる絶対配置の議論の中で確定した。3, 4はそれぞれ2, 1の2”-位についてのデオキシ体であることが判明した。側鎖3”-位水酸基の立体化学はメタノリシスにより3-ヒドロキシブタン酸メチルとした後、キラルGCにより標品と比較することにより絶対配置として(3”S)-配置を決定した。5, 6は1”-4”側鎖を持たないC7’アルコール体であることが判明した。さらに培養液を検索したところ、ドリマン部が環化していない7を単離し、これをプレマクロフォリンと命名した。このものでは、7’-位も酸化されておらずメチル基のままである。

ドリマン骨格では両鏡像体の天然物が知られていることから、他のマクロフォリン類の報告などから一意的に決定す

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白神山地は1993年に登録されたUNESCO世界自然遺産として知られている。報告者らはこの地域の微生物を遺伝子資源ととらえ、有用二次代謝物の探索研究を展開、これまで複数の新規天然物を単離してきた。今回、弘前大学白神自然観察園で採取したDaedaleopsis tricolor(チャカイガラタケ)に寄生するTrichodermasp. 1212-03の培養液から新規ドリマン型ジテルペンであるネオマクロフォリン I-VI (1-6)、及びその生合成前駆体と考えられるプレマクロフォリン (7)を単離した1

【単離と構造決定】

Trichodermasp. 1212-03培養液の酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーなどを用いてこれら化合物を精製した。まず、ネオマクロフォリンI (1) の構造を解析した。ESIMSスペクトルはプロトン化した分子イオンをm/z477.2493に与えたことから分子式C26H36O8を推定、さらにNMR解析により3-位にアクシアル水酸基を有するドリマン誘導体であると決定した。H-9はH-5’との間に明確なNOEを与えたが、分子モデリングの結果、(9S*,5’R*)-異性体では、安定配座(1)においてH‑9/H‑5’間距離は近く観測したNOEを説明できるが、その異性体の安定配座ではこれを説明出来ないことから、ドリマン環部とエポキシキノン環部との相対立体配置を決定した。

側鎖のC-4”メチル基は19.51 ppmに観測された。複数の2,3-ジヒドロキシブタン酸エステルの文献値を調査したところ、threo-体の場合4-位メチル基は19.5 ppm付近に、erythro-体のそれは17.5 ppm付近に普遍的に現れることを見出し、threo-体と決定した。また、プロトン非デカップリング13Cスペクトル等より3JCH, 3JHH値(3JC-1”/H-3” = ca 1 Hz, 3JH-2”/H-3” = 2.3 H, 3JH-3”/C-4” = 2.0 Hz)を帰属したところ、図2のような関係を帰属し、先の相対配置に矛盾しないことを確認した。

2では13C NMRカルボニルシグナルが1個減少した。NMRの解析により、21の4’-位アルコール体であると結論した。JH-4’/H’-5は0.9 Hzであり二面角H‑C4’‑C5’‑H90°が示唆された。分子モデリング等によりトランス配置と推定したが、シス異性体でも対応する二面角は約60°であり、観測したスピン結合を完全に否定できるものではなかった。最終的には後述するECDによる絶対配置の議論の中で確定した。3, 4はそれぞれ2, 1の2”-位についてのデオキシ体であることが判明した。側鎖3”-位水酸基の立体化学はメタノリシスにより3-ヒドロキシブタン酸メチルとした後、キラルGCにより標品と比較することにより絶対配置として(3”S)-配置を決定した。5, 6は1”-4”側鎖を持たないC7’アルコール体であることが判明した。さらに培養液を検索したところ、ドリマン部が環化していない7を単離し、これをプレマクロフォリンと命名した。このものでは、7’-位も酸化されておらずメチル基のままである。

ドリマン骨格では両鏡像体の天然物が知られていることから、他のマクロフォリン類の報告などから一意的に決定することは危険である。我々はECD解析によりこれを議論することとした。1のECDスペクトル[386 nm (De -0.64), 261 nm (De +2.89), 238 nm (De -2.16), 228 nm (De -0.16), 214 nm (De -5.04), 図3]は、既知物質マクロフォリンDの文献値2とほぼ対称であった。これらのコットン効果は、その波長からUV吸収のほとんど無いドリマン部の不斉が影響したとは考えにくい。したがって、これらはUV吸収を示すエポキシキノン構造に起因するとして、マクロフォリンD のエポキシキノン部とは鏡像関係の(5’S,6’S)-配置と予想した。2のECDスペクトルは1のそれとは大きく異なり、338 nm (R-帯, n→p*遷移)および243 nm (K-帯, p→p*遷移)に特徴的な二つの負のコットン効果を観測した。Sekiguchiらはエポキシドンはじめ多くの類縁体ECDスペクトルを解析しており、R-帯のコットン効果は、エポキシドの配置を逆オクタント則で説明でき、K-帯のコットン効果はエポキシセミキノールの水酸基絶対配置とそれぞれが独立して反映されると結論している3。これを参考にエポキシセミキノール部の絶対配置を(5’R,6’S)-配置と推定した。更に、2の1”-4”側鎖を省略したモデル化合物を用いて時間依存密度汎関数(TD-DFT)分子起動計算[①配座解析(MMFF)、②構造最適化(EDF2/6-31G*)、③ECD計算(def2-B3LYP等)]よりスペクトルを再現してこれを確認した。推定した1, 2の5’/6’-エポキシド部について、IUPAC法ではRS表記が異なるが同じキラリティーである。また、これを手がかりにドリマン部の絶対配置も同時に導くことができたが、全て同一のキラリティーとなり、生合成的にも矛盾はない。3, 5, 7及び4, 6のECDスペクトルはそれぞれ2及び1のそれらとほぼ同一であり、ほぼ同様な議論及び生合成を考慮することにより決定した。

最後に1の2,3-ジヒドロキシブタン酸エステル側鎖について、ベンゾイル化後にECDスペクトルを測定して決定した。2”,3”-O-ジベンゾアート誘導体のECDスペクトルは、負の分裂型コットン効果を示した。ベンゾイル化反応時に同時に生成した3”-O-モノベンゾアート体では、このようなコットン効果は観測されない。したがって、導入したベンゾイル基同士の相互作用、即ち励起子キラリティー法が適用可能である4。2”,3”-O-ジベンゾアート体の3JH-2”/H-3”は3.4 Hzであり、両プロトンがゴーシュの関係であるconformation A及びBが考慮すべき配座で、conformation Cは無視することができる(3)。また、conformation Bの場合、ベンゾイル基同士がアンチ、即ち発色団間にキラルなねじれが消失するのでECDへの寄与は小さいと考えるべきである。したがって、conformation Aのみを考慮すればよく、(2”R,3”S)-配置と帰属することができた。3”位のキラリティーは全て共通であり、生合成的にも矛盾しない。

【生物活性】

COLO 201細胞を用いた実験では1に弱い細胞毒性を観察した(IC50: 97 mM)。一方、ヒト急性前骨髄性白血病HL60細胞に対しては、比較的強い細胞毒性を示し、1, 3, 4, 5のIC50はそれぞれ2.1、11.3、0.9、23.0 μMであった。また、これらはいずれもHL60に対してDNA断片化とcaspase-3切断を起こしたことから、アポトーシスを誘導することが示された。そこで、ネオマクロフォリン類の標的分子について解析した。類似骨格を有するエポキシフォマリン類がタンパク質分解酵素複合体プロテアソームを阻害することを参考にし、ネオマクロフォリン類のプロテアソームに対する作用を検討した5。ヒト赤血球由来20Sプロテアソームと、プロテアソームの3種のプロテアーゼ活性(chymotrypsin様活性、trypsin様活性、caspase様活性)に対する各蛍光基質を用いて活性を測定した。その結果、1, 3, 4はプロテアソームのchymotrypsin様活性とcaspase様活性を酵素レベルで濃度依存的に阻害するが、5は100 μMでも全く阻害しないことが判明した(1)。ユビキチン・プロテアソーム系は、主要な細胞内タンパク質分解システムであり、その阻害剤はユビキチン化タンパク質の細胞内蓄積を引き起こす。そこで、ネオマクロフォリン類で処理したHL60細胞の全タンパク質について、抗ユビキチン抗体を用いたwestern blottingによりユビキチン化タンパク質を検出した。その結果、細胞毒性並びにプロテアソーム阻害活性がともに強かった14は、ユビキチン化タンパク質を顕著に蓄積させ、3もわずかに蓄積させたため、細胞レベルでもプロテアソームを阻害していることが示された。これらの結果から、ネオマクロフォリン類の標的分子の1つがプロテアソームであることを明らかにし、さらに構造活性相関として、5のみが100 μMでも阻害活性を示さないためその活性には1”-4”位側鎖が重要であり、さらに3と比較して14の活性が著しく強いことからキノン型であることが阻害活性に大きく寄与することが示唆された。

前述したようにこれら化合物の生産菌は、Daedaleopsis tricolor(チャカイガラタケ)に菌寄生する。現在、菌寄生の関連を現在検討している。

文献

1. Hirose, A.; Maeda, H.; Tonouchi, A.; Nehira, T.; Hashimoto, M. Tetrahedron 2014, 70, 1458.

2. Fujimoto, H.; Nakamura, E.; Kim, Y.-P.; Okuyama, E.; Ishibashi, M.; Sassa, T., J. Nat. Prod. 2001, 64, 1234.

3. Sekiguchi, J.; Gaucher, G. M. Biochemistry 1978, 17, 1785.

4. Harada, N.; Nakanishi, K., Acc. Chem. Res. 1972, 5, 257-263, Harada, N. Enantiomer, 1996, 1, 196.

5. Mohamed, I. E.; Kehraus, S.; Krick, A.; Konig, G. M.; Kelter, G.; Maier, A.; Fiebig, H.-H.; Kalesse, M.; Malek, N. P.; Gross, H. J. Nat. Prod. 2010, 73, 2053-2056.

 
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