日本薬理学雑誌
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129 巻 , 5 号
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特集:遺伝子改変マウスの作製法
  • 鈴木 操
    2007 年 129 巻 5 号 p. 320-324
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    遺伝子改変マウス(トランスジェニックマウス,ノックアウトマウス)の作製および使用は,遺伝子組換え実験(注1)の動物使用実験(動物作成実験)に該当するので,「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」(注2)(以下,カルタヘナ法)が適用される.このカルタヘナ法は「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティーに関するカルタヘナ議定書」(注3)(以下,カルタヘナ議定書)の的確かつ円滑な実施を確保することを目的としている.すなわち,遺伝子改変マウスの作製および使用は,生物多様性への悪影響を防止するために,環境中への拡散を防止しつつ行われなければならない.具体的なルールは「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」(注4)(以下,研究開発二種省令)などに規定されている.遺伝子組換え実験の手続きは,実験責任者が,執るべき拡散防止措置があらかじめ定められているかどうかを確認の上,実験計画書(機関内実験)または大臣確認申請書(大臣確認実験)を作成し,所属機関内の遺伝子組換え実験安全委員会等に申請して,承認または確認を得なければならない.カルタヘナ法に違反した場合には,最も重いもので,1年以内の懲役もしくは100万円以内の罰金またはこれの併科とされているので,実験者は,事前にカルタヘナ法を熟知して実験を行わなければならない. 注1)遺伝子組換え実験:遺伝子組換え技術により得られた核酸またはその複製物(組換え核酸)を有する遺伝子組換え生物等の使用等をいう. 注2)遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 注3)生物の多様性に関する条約のバイオセーフティーに関するカルタヘナ議定書 注4)研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令 注1,2,3,4)の詳細は,文部科学省ホームページを参照. http://www.lifescience-mext.jp/bioethics/anzen.html#kumikae
  • 鈴木 操
    2007 年 129 巻 5 号 p. 325-329
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    ヒトゲノムの解読が終了し,遺伝子の存在は塩基配列から予測できるようになった.しかしながら,遺伝子の機能を塩基配列のみから予測することは困難である.そこで,遺伝子の機能を個体レベルで解析する技術として,マウス個体へ遺伝子を導入する遺伝子改変マウス作製技術が有効である.遺伝子改変マウスは,その作製方法によって,トランスジェニックマウス(外来遺伝子導入マウス,以下,Tgマウス)と遺伝子ターゲッティングマウスに分類される.Tgマウスは目的のタンパク質をコードする遺伝子,またはそのcDNAを含む外来遺伝子をマウスの受精卵に注入して作製され,個体での外来遺伝子の機能解析を目的としている.一方,遺伝子ターゲッティングマウスは,遺伝子ターゲッティングにより胚性幹細胞を用いたキメラマウス作製により作製されるマウスで,特定の内在性遺伝子を外来性のDNA断片で置換することにより,もとの遺伝子の機能を欠失または変異させる.遺伝子の機能を欠失したマウスをノックアウトマウス(以下,KOマウス)という.本稿では,Tgマウスの作製技術について解説する.Tgマウスの作製は,マウスには本来存在していない外来遺伝子の導入により発現を付与する,機能付与型である.現在,Tgマウス作製は,前核期受精卵への外来遺伝子のマイクロインジェクションによる方法が最も一般的に使用されている.なお,Tgマウス作製技術には,受精卵の体外培養,受精卵の卵管内移植および体外受精などの発生工学的基盤技術が不可欠である.Tgマウス作製技術は,現在,遺伝子の機能解析のみならず,疾患モデル動物として病態解析や治療薬開発などに応用され,生物学・医学・薬学を含む多くの分野で最も基礎的,かつ重要不可欠な技術となっており,今後も発展し続けるものと期待される.
  • 竹田 直樹
    2007 年 129 巻 5 号 p. 330-336
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    今日,遺伝子改変マウスは個体における遺伝子の機能を解析する上で必要不可欠な材料となっている.ES細胞を用いた相同組換え法による遺伝子破壊マウス作製法は既に確立されており,如何により効率よく確実にそれをおこなうかが求められる.LIFの発見などで培養条件が確立されつつあるとはいえ,ES細胞を生殖細胞系列への分化能を喪失しないように培養するには未だ注意を要する.またES細胞からのキメラマウス作製には高度な技術的習得が必要である.しかし最も問題となるのは遺伝子を破壊する方法であり,組換え頻度や表現型はベクターの構造に左右されると言っても過言ではない.本稿ではこれから遺伝子破壊マウスを作製する研究者に向けて,相同組換え頻度の高いターゲティングベクター構築法と,確実な相同組換え体の単離同定法について主に述べる.どちらも原理は単純である.ターゲティングベクターでは相同領域を長く設定する事で最大の効果が得られ,時間はかかるが構築は難くない.また相同組換え体の単離同定法では適切なプローブで明確なサザンができれば良い.しかし多くのトラブルや挫折は主にPCRやサザンスクリーニングで生じているのが現状である.これらを回避するためにPCRスクリーニングにおいては,PCR検定用ベクターにて事前に条件検討をおこなう.またサザンスクリーニングでは余剰なバンドを生じない適切なプローブを準備しておく他に,ターゲティングベクター外に設定したプローブを用いることで相同組換え体候補を選別し,その後にコピー数の検討など確定作業をおこなう.最終的には複数の相同組換え体クローンからキメラマウスを作製し,見出された表現型が標的遺伝子を破壊した結果であることを確認する.
  • 山村 研一
    2007 年 129 巻 5 号 p. 337-342
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    ヒトゲノムプロジェクトの進展により種々の生物のゲノムの塩基配列は明らかとなったが,塩基配列のみでは,遺伝子およびコード領域以外の部分がどのような機能を持っているのか推定すらできないし,また遺伝子自身の機能に関する情報も不十分である.このため全長cDNA配列の決定,DNAチップによる発現パターンの解析,タンパクの構造解析,タンパクに対する抗体作製等の機能解析系が必要であるといわれている.しかし,これらは重要ではあるが,あくまで機能を同定するための状況証拠を提供するにすぎないとみるべきである.具体例を一つあげれば,Cbfa1は,リンパ球で発現する遺伝子の転写因子として発見されたが,その破壊マウスでは骨形成がみられず,骨形成のマスター遺伝子であることが分かった.このことは,構造や発現パターンからだけでは,必ずしも機能は推測できないことを示唆している.そこで,遺伝子改変マウスを用いたin vivoの解析の重要性が再認識され,欧米でノックアウトマウスプロジェクトが始まり,合計すれば年間約40億円に達する金額が投じられることとなった.その内容は,遺伝子トラップ法や相同組換え法を用いてほぼ網羅的にノックアウトESクローンを取るプロジェクトであるが,当面は129系統由来のES細胞を用い,やがて確立されればC57BL/6由来のES細胞を用いて行うというものである.筆者らは網羅的遺伝子破壊を目指して,可変型遺伝子トラップ法を開発した.この方法により,第1段階で完全破壊が,第2段階でトラップベクター内のマーカー遺伝子を,別の遺伝子で置換,第3段階で条件的遺伝子破壊が可能となった.やがて,遺伝子破壊されたES細胞が全世界に配られ,遺伝子破壊マウスが多量に作製され,保存される時が来る.熊本大学生命資源研究支援センターでは,世界の主要なリソースセンターが参加し,保存と供給の支援を行うFIMRe(Federation of International Mouse Resources)にも創立メンバーとして参加し,また,アジアにおけるミュータジェネシスとリソースセンターの連合体であるAMMRA(Asian Mouse Mutagenesis and Resource Association)も立ち上げ,今後の対応も視野にいれた活動を行っている.
  • 中潟 直己
    2007 年 129 巻 5 号 p. 343-348
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    爆発的に増え続けるミュータントマウスに対して,国内外でマウスバンクが次々と設立され,それらマウスバンクの世界的な組織,Federation of International Mouse Resources(FIMRe)が2005年に発足した.一方,2006年にはアジアにおいて,遺伝子改変マウスの作製と保存に関するコンソーシアム,AMMRA(Asian Mouse Mutagenesis and Resource Association)が設立された.我が国の代表的なマウスバンクとしては,熊本大学CARD(Center for Animal Resources & Development)および理研BRC(Bio Resource Center)があるが,本項では,熊本大学CARDを紹介する.CARDのバンクシステムには,以下の2つがある.すなわち,一方は,マウスの寄託を受け,保存された系統について情報を公開し,第三者へ広く供給するものである.この場合の料金は,マウスのCARDへの輸送や凍結保存経費など,寄託に関する一切の経費は無料であるが,供給に関しては,有料(実費)である.他方は,有料にてマウス胚/精子の凍結保存サービスを行うもので,保存したマウスを第三者へ分与しない,また,そのマウスの情報を公開しないという条件で実施している.前者は年間100~150系統の寄託があり,年々,寄託保存系統数が増えていると同時に,海外からの供給依頼も増えている.後者は2006年4月から開始したばかりであるが,すでに80系統以上の凍結保存の依頼が入っており,着実にその成果を上げている.
受賞者講演
  • 津田 誠
    2007 年 129 巻 5 号 p. 349-353
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    神経因性疼痛は,神経系の損傷や機能不全による難治性疼痛で,触覚刺激で激烈な痛みを誘発するアロディニア(異痛症とも呼ぶ)が特徴的である.この病的な痛みには,今現在も有効な治療法は確立されていない.近年,痛み情報の受容や伝達に関わる分子が次々と明らかにされてきている.その中の一つがATP受容体である.神経を損傷した神経因性疼痛モデルにおいて出現するアロディニアは,イオンチャネル型ATP受容体(P2X)の拮抗薬およびP2X4受容体アンチセンスオリゴの脊髄内投与で抑制される.脊髄内におけるP2X4受容体の発現は,ミクログリア細胞特異的に著しく増加する.ミクログリアにおけるP2X4受容体の過剰発現には,フィブロネクチンのβ1インテグリンを介したシグナルが関与している.P2X4受容体が刺激されたミクログリアは,脳由来栄養因子BDNFを放出する.BDNFは,脊髄後角ニューロンの陰イオンに対する逆転電位を脱分極側へ移行させ,抑制性伝達物質のGABAにより脱分極が誘発される.従来までは,神経因性疼痛の原因として,痛覚伝導系路における神経細胞での変化のみに注目が集まっていたが,以上のようにP2X4受容体の役割から得られた知見は,脊髄ミクログリアを介在するシグナリングの重要性を示し,新しい神経因性疼痛メカニズムを明らかにした.この新しいメカニズムは,難治性疼痛発症機序の解明と今後の治療薬開発に大きく貢献する可能性がある.
  • 永井 拓
    2007 年 129 巻 5 号 p. 354-359
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    薬物依存(精神依存)はある薬物の精神的効果(快感)を体験するためにその薬物の摂取を強迫的に欲求している精神的・身体的状態である.中脳腹側被蓋野から側坐核に投射する中脳辺縁系ドパミン作動性神経系は報酬回路を構成する重要な神経系の一つである.これまでの研究により,依存性薬物の乱用により報酬回路の異常興奮が長期間持続すると,報酬回路に病的な可塑的変化が生じ,渇望を伴う依存状態になると考えられている.我々は,薬理作用としては中枢抑制と興奮と全く逆の作用を示す麻薬および覚醒剤による薬物依存症に共通して関連する生体分子を同定するために,DNAマイクロアレイを用いて麻薬(モルヒネ)および覚醒剤(メタンフェタミン)依存動物の脳内に発現する遺伝子を解析し,両薬物の依存症を悪化させる分子の一つとして組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を同定した.さらに,tPAはプラスミンを介してプロテアーゼ活性化受容体-1を活性化し,ドパミン遊離を促進することにより麻薬(モルヒネ)およびタバコ(ニコチン)依存症を悪化させることを見出した.一方,依存性薬物の使用により統合失調症に類似した精神病が誘発され,その精神症状は長期間持続することが知られている.我々は,低用量のメタンフェタミンをマウスに反復投与し,メタンフェタミン休薬後も長期間にわたり記憶障害を呈するメタンフェタミン誘発性記憶障害モデルマウスを作製した.さらに,記憶の長期固定には前頭前皮質におけるドパミンD1受容体の刺激と下流に存在するextracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)の活性化を介したタンパク合成が重要であること,メタンフェタミンの連続投与によるドパミンD1受容体/ERK1/2の機能不全が記憶障害に関与していること見出した.本総説では,我々の知見から得られた依存性薬物による精神障害の分子機序を概説し,従来にない新しい治療薬の薬理学的コンセプトとなりうる可能性について述べる.
治療薬シリーズ(15)
  • 増田 典之, 鈴木 雅徳
    2007 年 129 巻 5 号 p. 361-367
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    現在,注目されている下部尿路機能障害を有する疾患として,過活動膀胱,前立腺肥大症,腹圧性尿失禁,低活動膀胱,間質性膀胱炎等が挙げられる.1980年代から下部尿路機能障害に対する創薬研究が活発になり,過活動膀胱治療薬としてムスカリン受容体拮抗薬が,前立腺肥大症治療薬としてα1受容体拮抗薬が上市されてきた.これら治療薬の上市に伴い下部尿路機能障害に対する患者および研究者の関心や理解も高まってきている.20年前と比較すると本領域の基礎研究を行う機関や研究者も増加し,下部尿路系における様々な新知見が得られている.しかしながら,過活動膀胱や前立腺肥大症の治療においても現在用いることができる薬剤の多様性は少ない.そのために,作用機序に基づく副作用の発現や現時点で使用しうる既存薬では満足な治療効果が得られない患者が認められることも事実である.したがって,下部尿路機能障害の治療において新規な作用機序を有する薬剤を創製することは今後も必要であると考えられる.この報告では,既存薬に加え新規治療薬を目指した創薬研究が近年話題となっている過活動膀胱や前立腺肥大症,および今後治療薬の創製が望まれる疾患である腹圧性尿失禁に焦点をあて,新規作用機序に基づく創薬および現在開発中の化合物の特徴を述べた.過活動膀胱の治療薬としては,β3受容体刺激による膀胱平滑筋の弛緩に加え,膀胱求心性神経の抑制を介した尿意切迫感の抑制および排尿筋過活動の改善が創薬コンセプトとして注目されている.また,前立腺肥大症に対しては前立腺を増殖させる因子のひとつである男性ホルモンの作用を抑制する薬剤の研究および臨床開発がトレンドとなるとともに,尿道抵抗の低下を目指したα1受容体以外の機序としてホスホジエステラーゼ阻害薬の可能性が模索されている.さらに,十分な治療効果を発揮し得る薬剤が未だ存在しない腹圧性尿失禁に対しても排尿反射を調節することによる禁制維持を目指した薬剤の研究・開発が進められている.一方,それぞれの疾患・症状の評価に用いられている病態動物モデルに関する知見についても,すでに臨床で使用されている薬剤の研究成績とともに紹介し,これら病態動物モデルを用いた研究における臨床予測性を考察した.
  • 関 成人
    2007 年 129 巻 5 号 p. 368-373
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    排尿障害は蓄尿(尿をためる)障害と排出(尿を出す)障害に大別される.蓄尿障害には排尿筋の収縮を抑制する薬物(抗コリン薬や平滑筋弛緩薬)あるいは膀胱出口部抵抗を増強する薬物(α1およびβ2受容体作動薬)が用いられ,排出障害には排尿筋収縮を増強する薬物(コリンエステラーゼ阻害薬など)ないし膀胱出口部抵抗を減弱させる薬物(α1遮断薬や抗男性ホルモン薬)が適用される.しかし閉塞性疾患(前立腺肥大症など)と合併する過活動膀胱に代表される,蓄尿および排出障害が混在する病態における抗コリン薬の有用性は十分確立されておらず,その使用は慎重に行う必要がある.排尿障害の薬物治療における問題点としては,排尿筋収縮力障害に対する有効な薬物に乏しいことと,有病率の高い過活動膀胱に対する第一選択薬である抗コリン薬の有害事象が挙げられ,抗コリン作用とは異なる作用機序を有する治療薬物の臨床応用や開発が進められている.
新薬紹介総説
  • 渡邉 雅一, 石塚 啓司, 池元 敏雄
    2007 年 129 巻 5 号 p. 375-385
    発行日: 2007年
    公開日: 2007/05/14
    ジャーナル フリー
    ベガモックスTM点眼液 0.5%は第四世代のキノロン薬(1)といわれる塩酸モキシフロキサシン(MFLX)を主成分とする抗菌点眼液で,各種眼感染症の起炎菌に対して強い抗菌活性を示す.また,ベガモックス点眼液は眼内移行性に優れた点眼液であるため,涙液中,房水中へ高濃度に移行し(2,3),外眼部細菌性感染症,術後眼内炎の予防に有用と考えられる.MFLXは外眼部細菌性感染症由来の臨床分離株を用いた薬剤感受性試験において,グラム陽性球菌に対し,従来のキノロン薬に比して同等~16倍の抗菌活性を示した.また,当該疾患患者に対する臨床効果において,有効率(「著効」および「有効」)は94.8%(368/388例)であった.眼科周術期の無菌化療法試験における無菌化率は85.0%(68/80例)であり,臨床試験におけるベガモックス点眼液の有効性が確認された.臨床試験で発現した副作用は,眼痛(しみる,18/586例,3.1%),味覚異常(点眼時の苦味,8/586例,1.4%)が主なものであり,本点眼液の安全性は良好と思われた.また,41日齢以上,12歳未満の小児42例においても副作用発現は同様であり,本点眼液は小児に対しても安全性が高い点眼液であることが示唆された.
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