Candida albicansの主要抗原活性物質であるマンナン(化学的組成はホスホマンナン-タンパク質複合体)のエピトープの化学構造決定を目的とする免疫化学的研究を次の順序に従って試みた.1.初期のC.albicansマンナンの構造研究.2.C.albicansマンナンにおけるβ-1,2結合マンノピラノース基の検出.3.C.albicansマンナンのβ-1,2結合を含むエピトープの構造解析.4.C.albicansマンナンの化学構造ならびにβ-1,2結合マンノピラノース基を含む抗原因子エピトープの化学構造との関連.5.結論および将来の課題.

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塩基性蛋白は侵入菌に対して生体が防御物質として活性を有する物質の一つであって,あるものは好中球やマクロファージの顆粒中にあって運搬され,あるものは既に組織に備わっていて(tissue-bound),組織の破壊と共に活性を現わすものと考えられる.われわれはモルモット表皮抽出物中にかかる抗真菌活性物質を見出し,研究中であるので,その現在に至る過程を述べ,同時に皮膚以外にも存在の報告されている類似物質の存在臓器について総説的に述べる.これらの物質はtissue-boundとして,他の殺菌活性物質と共同で生体の防御に当ると考えられ,且つ下等動物に類似物質が存在することから,動物界において,極めて汎在的性格を有する防御物質と考えられる.

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Immunopharmacological activities of fungal β-glucans are well recognized to be useful for the medical treatment of cancer and infectious diseases. These (1-3)-β-D-glucans possess several conformers, such as sol (random coil), gel (single and triple helixes), and insoluble. In this review, structure-activity relationships of these conformers were summarized. The glucans having appropriate branches showed significant antitumor activity in all conformers tested. However, activation of Mφ (in vivo and in vitro) and of complement by gel and insoluble conformers were significantly stronger than sol conformer. In the gel conformer, the triple helix conformer was a stronger activator of alternative pathway of complement and the single helix conformer was a stronger activator of classical pathway of complement. Activation of limulus lysates was also dependent on the molecular weight, branch and conformation. Considering these facts, it is suggested that β-glucans would be recognized by several distinct ways in the host immune system.

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We have established an antigenic formula for two serotypes and three subtypes of Saccharomyces cerevisiae by agglutination system with adsorption experiments. This antigenic formulation identifies five distinct antigenic factors or determinants that are found on various serotypes of S. cerevisiae. Serotype Ia and Ib have antigenic factors 1, 10, 18 and 18a and 1, 10, 18 and p, respectively. Serotype Iab has both antigenic factors 18a and p in addition to the common antigenic factors 1, 10 and 18. Serotype II has only the common antigenic factors 1 and 10. ¹H-n. m. r. spectrum (H-1 region) of the mannan of serotype Ia, almost free from phosphate, was characterized by the signal at δ5.127 which corresponded to the H-1 of 3-O-substituted α-D-Manp residue adjacent to terminal α (1-3) linkage of mannopentaose side chain, for the specific determinant of antigenic factor 18a. In contrast, phosphodiester mannan from serotype Ib released mannose and α-(1-3)-linked mannobiose by mild acid hydrolysis. The signals at δ5.422-5.461 and 5.284 disappeared, and the signal at δ5.160 was diminished in phosphomonoester mannan treated by mild acid hydrolysis. An immunochemical characterization of the antigenic factor p using agglutination inhibition test between factor p serum and serotype Ib cell ssuggests that the α-(1-3)-linked mannobiosyl-1-phosphate group is a part of the antigenic determinant for the factor p.

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酵母Saccharomyces cerevisiaeの糖外鎖付加を阻害する温度感受性変異株och1を相補するOCH1遺伝子を単離し塩基配列を決定した結果,480アミノ酸残基(分子量55155Da)からなり,N末端付近に膜貫通可能な疎水領域を1ヶ所持ち,アスパラギン結合型糖鎖の付加可能な部位を4ヶ所持つ蛋白質をコードする領域があった.蛋白質合成と膜透過の系を用いたin vitroの実験及びウエスタンブロッティングによる酵母細胞内での局在性の実験の結果,この蛋白質(OCH1蛋白質)は膜画分に存在し,ERコア型と類似の長さの糖鎖が付いた蛋白質であることが分かった.och1変異遺伝子をギャップリペア法を用いて回収し,変異点を調べた結果,翻訳開始コドン(ATG)より548番目のGがAに変化をしていた.これにより,タンパク質の183残基目のGlyがAspに変化していることが分かった.また,種々の糖鎖を受容体基質としてマンノース転移酵素の活性を測定した結果,OCH1蛋白質は基質特異性の高いマンノース転移酵素であることが分かった.

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パン酵母細胞壁成分である,マンナン(WNM)及びキチンのオリゴ糖N-acetylchitohexaose(NACOS-6)はマウスに対し,様々な生理活性,特に強い免疫賦活作用を有し,マウス同系移植腫瘍に対し増殖抑制作用を発揮する.又,細菌並びに真菌などの微生物感染に対しても感染宿主の防御効果を増強することにより延命効果を示す.そこでWNM及びNACOS-6の網内系細胞に及ぼす影響をfluorescence activated cell sorter (FACS)により検討した.その結果WNM投与マウスにおいてはI-A^d陽性細胞の増加が認められた.一方,NACOS-6投与担癌マウスにおいてはLyt-2,L3T4陽性細胞の分布比が担癌マウスのそれに比べ増加し,Lyt-2,L3T4陽性細胞の活性を測定したところ担癌状態下で低下した細胞性免疫がNACOS-6の投与によって正常レベルにまで回復する事が明らかとなった.WNM-マイトマイシンC複合体はマウス同系移植腫瘍に対し1mg/kgで抗腫瘍効果を示した.又,ブレオマイシン複合体は肺癌移植マウスの転移抑制ならびに延命効果を示した.一方,NACOS-6-マイトマイシンC複合体はMH134Yヘパトーマに対して増殖抑制効果を示したが,この効果は腫瘍細胞に対する標的指向性によることが明らかとなった.

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NND-318前塗布による感染予防効果をpolyethylene glycol 300 (PEG 300)溶液および臨床試験用クリーム製剤を用いてclotrimazoleおよびbifonazoleのPEG 300溶液,ならびに市販クリーム製剤と比較した.各薬剤塗布1-4日後モルモット背部皮膚にTrichophyton mentagrophytesを接種し,薬剤による感染予防効果の持続性を感染成立数および感染部位の菌陽性率を指標に検討した.NND-318の1%溶液0.1mlを菌接種の1,2,3および4日前に1回塗布しておいた群では,感染成立数は12例中それぞれ0,1,0および2例,菌陽性率はそれぞれ3,7,8および21%であり,いずれの指標においてもclotrimazoleあるいはbifonazoleの1%溶液を塗布した群と比較して有意に低い値であった.NND-318の0.5%および1%クリーム製剤を1-4日前に1回塗布した群でも菌接種までの日数に応じて,感染成立数は12例中それぞれ1-8例および0例,菌陽性率はそれぞれ26-59%および0-13%の値を示し,clotrimazoleあるいはbifonazoleの1%市販クリーム製剤を前塗布したいずれの群と比較しても有意に,又は低い傾向にあった.以上の成績から,NND-318はPEG 300溶液およびクリーム製剤ともに対照薬に勝る感染予防効果を示し,薬効を発揮するのに充分なNND-318が皮膚に貯留していることが示唆された.

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新しい抗真菌剤NND-318のin vitro抗真菌活性を既存のイミダゾール系薬剤と比較検討した.NND-318の抗真菌スペクトルは広範囲にわたり,皮膚糸状菌,酵母状真菌,黒色真菌,二形性真菌,Aspergillus属およびPenicillium属の各種病原性真菌に対して活性を示した.なかでも皮膚糸状菌を含む糸状菌および二形性真菌に対する抗真菌活性は,clotrimazoleのそれに比し1～64倍以上強いものであった.NND-318の活性は,clotrimazoleおよびbifonazoleと同様に,接種菌量の増大および血清添加により低下したが,培地の種類および培地のpHの変化に対してはNND-318の活性は比較的影響されなかった.また対照薬剤と同様に尿素との併用によりその活性は増強された.

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MJR-1762, a gel formulation of miconazole newly developed for oral mycosis, was mycologically and histopathologically evaluated for experimental oral Candidosis in rats.
Sprague-Dawley rats receiving tetracycline in drinking water (TC-receiving rats) or rats of the same strain receiving subcutaneous cortisone acetate concomitant with tetracycline in drinking water (immunosuppressed rats) were orally infected with Candida albicans. Daily oral treatments with MJR-1762 containing 2% miconazole significantly reduced the average numbers of C. albicans (p<0.01) in the oral cavities of both TC-receiving and immunosuppressed rats. MJR-1762 at the same content of miconazole also reduced the average number of C. albicans (p<0.05) in the feces of TC-receiving rats after 1-week therapy. Mycelial penetration of C. albicans and inflammatory cell infiltration in the tongue epithelium were observed only in the immunosuppressed rats, and MJR-1762 containing 2% miconazole markedly prevented the penetration. Furthermore, miconazole was found to inhibit the germ tube formation of C. albicans enhanced in the presence of human saliva in vitro, and this was thought to be one of the therapeutic mechanisms of MJR-1762.

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Trichophyton mentagrophytesの形態および微細構造に及ぼすNND-318の影響を走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて観察した.段階的濃度の薬剤を含む培地にT.mentagrophytes分生子を接種し,27℃で60時間スライド培養した.薬剤無添加では菌糸はほぼ直線状に伸長していたが,NND-318 0.08～0.4ng/ml添加では菌糸の屈曲,過剰分岐,菌糸幅の不均一化および皺襞形成等の形態変化が認められた.菌糸細胞内では,細胞壁の肥厚および壁内の顆粒状構造物出現,ならびに細胞質内の脂肪滴の増加が薬剤濃度の上昇に伴い認められた.0.8～1.6ng/mlでは菌糸の皺襞は更に明瞭となり,伸長は著しく阻害されていた.4.0ng/ml以上の濃度では菌糸形成は認められず分生子の形態を留めていた.比較対照のために用いたbifonazoleもまたより高濃度域ではあるがNND-318と同質の形態異常を引き起こすことが観察された.
以上の結果からNND-318は従来のイミダゾール剤よりも著しく低濃度でT.mentagrophytes分生子の発芽ならびに菌糸の伸長発育を阻害すること,および発育を阻止された菌糸細胞においては細胞質内への脂肪滴の蓄積,細胞壁の肥厚,細胞壁内の顆粒状構造物形成促進などの超微形態学的変化が引き起こされることが示された.

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To clarify the mode of antifungal action of NND-318, a new imidazole antimycotic, the effect of the agent on ergosterol synthesis in Trichophyton mentagrophytes and Candida albicans was examined, and compared to that of bifonazole.
NND-318 was found to interfere with ergosterol biosynthesis by inhibition of sterol C-14 demethylation. In terms of drug concentrations exerting 50% inhibition of ergosterol biosynthesis, NND-318 was ≥25 times stronger than bifonazole.

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The in vitro postantifungal effect (PAFE) following exposure of Candia albicans to cispentacin and pradimicin (BMY-28864) for short periods of time was investigated. A turbidometric method was used to measure cell regrowth following exposure to different concentrations (0.313 to 20μ/ml) of the two drugs for 0.5, 1 and 2hr at 30°C and 37°C. The PAFE was determined by the difference in time (hr) required for growth of the control and test cultures to reach the 0.5 absorbance level after removal of the drug by dilution. The length of the PAFE was dependent upon the drug concentration, exposure time and temperature and the strain of C. albicans being assayed. Optimal PAFEs ranged from 3.7 to >17.0hr with cispentacin and from 1.7 to >21.0hr with pradimicin (BMY-28864).

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足白癬患者から新鮮分離したTrichophyton mentagrophytes 62株,Trichophyton rubrum 47株,Microsporum canis 2株,Epidermophyton floccosum 1株,合計112株および皮膚カンジダ症患者から新鮮分離したCandida albicans 40株に対する新規抗真菌剤NND-318のin vitro抗真菌活性について既存のイミダゾール系抗真菌剤bifonazole(BFZ)と比較検討した.その結果,これらの臨床分離株のうち皮膚糸状菌4菌種112株に対するNND-318のMIC値は≦0.0012～0.04μg/mlの範囲内に分布し,対照薬剤のBFZ(MIC:0.01～2.5μg/ml)よりも強い抗真菌活性を示した.C.albicans 40株に対するNND-318のMIC値の範囲(0.63～20μg/ml)は幅広く,BFZ(MIC:1.25～20μg/ml)とほぼ同様であった.
以上のようにNND-318の皮膚糸状菌臨床分離株に対する抗真菌活性はBFZよりすぐれ,C.albicans臨床分離株に対してはほぼ同程度であった.

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近年,白血病や癌の化学療法の結果発症する白血球減少症にrhG-CSF(G-CSF)を投与して白血球数の回復や感染症の予防に対する効果が検討されている.本報告では特に白血病治療により白血球減少を来した症例についてG-CSF投与による血中Candida抗原,糞便中のCandida数の変動をしらべCandida呼吸器感染症との関係について検討した.G-CSF投与により,Candida抗原陽性9例中5例は陰性化し(抗原価は有意に低下),糞便中のCandida数も有意(p<0.02)に減少し,Candida数の減少と共にCandida呼吸器感染症も改善した.またG-CSF投与により,好中球数の増加例においてCandida呼吸器感染症も有意(p<0.01)に改善した.
血中Candida抗原の検査はCandida感染症診断のための一つの指標であり,また糞便中Candida数の増加もCandida感染症のrisk factorの一つとなるため,これらの検査所見がG-CSF投与により,白血球数,好中球数の増加と同じく改善されたことは,G-CSFの投与効果の判定にはこれらの検査も有用であることが認められた.

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Entomophthora exitialis 1菌株およびその人工変異株1菌株の安全性について,正常マウスおよび糖尿マウスを用いてその病原性を検討した.その際,比較のために非病原性菌であるConidiobolus heterosporus 1菌株,病原性菌であるBasidiobolus haptosporus 2菌株についても同時に実験を行った.1群17匹からなるマウスの尾静脈内に上記菌株の胞子を含む菌液を接種し,一定期間後,マウスを犠牲死させ,各種臓器の一部を培養すると共に病理組織標本を作製した.臓器培養の結果はE. exitialis ATCC 32890およびその人工変異株No. 1, B. haptosporus MMC 68およびMMC 69は正常群および糖尿群共に肺においてのみ陽性となり,その他の臓器ではほとんど陰性であった.C. heterosporus ATCC 12941では両群共に臓器培養の結果はすべて陰性であった.病理組織学的検索の結果でもすべての菌株について肺を除いた他の臓器での所見は認められなかった.一部の菌株について菌接種後のはじめの段階で肺組織に小化膿巣が,またそれにつづき小肉芽腫巣などが認められたが,全般的にこれらの菌種の胞子は肺組織内では孤立して存在することが多く,細胞反応は極めて弱いか全くなく,発芽管や菌糸を伸ばすことも皆無であった.以上の結果からこれらの菌株のマウスに対する病原性はまったく無いか極めて弱いものと推定された.本実験では病原性菌であるB.haptosporus 2菌株については感染不成立に終わったがその理由について考察した.

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61歳の主婦.交通事故による脳挫傷のため入院中の患者で,意識不明のまま仰臥し,発熱が続き,発汗が多かった.連日,抗生物質とコルチコイド剤の注射を受けていた.入院後10日目,背部に紅暈を伴った膿疱と痂皮の集まりが認められた.痂皮のKOH・パーカーインキ標本に,隔壁のない分岐性菌糸が多数存在した.膿疱の組織像では,真皮内に,半ば壊れた毛包を中心に膿瘍が形成され,菌糸の,中空にみえる横断面または斜断面が膿瘍内に多数見出された.痂皮および生検材料からともにRhizopus arrhizusが分離された.ビフォナゾール外用で皮疹は軽快したが,入院後16日目に,患者は呼吸不全で死亡した.剖検は出来なかった.本例は原発性皮膚ムーコル症と思われるが,発病の仕方ならびに臨床像において「原発性膿皮症様アスペルギルス症(primary pyoderma-like aspergillosis)」に類似したところがあった.

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A turbidometric method was used to evaluate Candida albicans yeast cell growth and to quantitate the in vitro postantifungal effect (PAFE) after exposure to various concentrations of cispentacin and pradimicin (BMY-28864), alone and in combination with flucytosine, for 2hr at 30°C and 37°C. Initial MIC and FIC (fractional inhibitory concentration) assays were made to determine approximate drug concentrations to use in the PAFE studies. The PAFE was calculated by the difference in time (hr) required for growth of the control and test cultures to reach the 0.5 absorbance level following removal of the drug by dilution. A synergistic PAFE was evidenced with both cispentacin and pradimicin (BMY-28864) when combined with flucytosine. Optimal PAFEs ranging from 5.7 to 18.5hr were induced by concentrations of cispentacin (0.078 to 0.313μ/ml) and flucytosine (0.049-0.098μg/ml) and from 3.3 to 11.7hr with pradimicin (BMY-28864) (0.078 to 0.313μg/ml) and flucytosine (0.049-0.098μg/ml). The PAFEs persisted for 1.9 to 4.8hr (cispentacin+flucytosine) and for 0.3 to 2.9hr (pradimicin-BMY-28864+flucytosine) longer than those achieved with either agent alone.

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