ウシ培養胚 (16細胞期から胚盤胞期) について、接合装置の状態を電顕的に、また、アクチンとサイトケラチンの局在を組織化学的にそれぞれ観察した。16細胞胚と桑実胚では、割球問にギャップ結合が稀にみられた。初期胚盤胞では、栄養膜細胞同士の間には閉鎖帯、デスモソーム前駆体およびギャップ結合が観察されたが、栄養膜細胞と内細胞塊細胞の間および内細胞塊細胞同士の間にはギャップ結合がみられる程度であった。拡張胚盤胞では、栄養膜細胞同士の間には閉鎖帯、接着帯およびデスモソームが、栄養膜細胞と内細胞塊細胞の間および内細胞塊細胞同士の間にはデスモソーム前駆体がそれぞれ認められた。また拡張胚盤胞では、すべての細胞間にギャップ結合がみられた。一方、アクチンとサイトケラチンの存在を示す蛍光は、観察したすべての時期の胚の細胞質にみられ、胚盤胞の栄養膜細胞では強くなって細胞膜直下に局在していた。

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Cynomolgus monkey oocytes were collected from the ovarian follicles of females that died from accidents, diseases of respiratory and digestive organs, or sacrificed for the other experiment. Immature oocytes were collected from 10 females aged 1 to 18 years except 1 female aged 19 days and they were cultured for 24 h in TCM 199 medium supplemented with 10 % FCS and 10 IU/ml PMSG. The 11.9 % oocytes extruded the first polar body and some of them were further used for in vitro fertilization. In two cases, we could observe the presence of male and female pronudei and the second polar body. The ovaries were histlogically different with regard to the number of primordial follicles and the vesicular follicles between sexually immature and mature females. This study suggests that the ovarian oocytes collected from dead animals are useful for the embryological studies in nonhuman primates, and this procedure is applicable to gene banking for individuals died accidentally.

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器官培養マウス卵巣内で発育した卵母細胞の成熟能力について検討した。培養に用いた4日齢のマウス卵巣内には、多くの発育開始前と考えられる直径10-19μmの卵母細胞とともに、少数の発育初期の卵母細胞 (直径20-39μm) が存在していた。培養20日後、大部分の卵母細胞は未発育のままであったが、一部は直径60-75μmへと発育していた。卵巣の組織染色標本を作製し、培養後の卵胞の形態を観察した。その結果、発育卵母細胞を包む顆粒膜細胞は1-3層であり、生体内で認められるような顆粒膜細胞の著しい重層化は認められなかった。器官培養卵巣内で発育した卵母細胞を裸化し、さらに24時間培養して成熟を誘起した。その結果、直径60μm以上の卵母細胞において卵核胞の崩壊が認められ、その割合は卵母細胞の直径の増大とともに増加した。さらに直径70μm以上の卵母細胞では、11%において第1極体の放出が認められた。一方、培養卵巣内および成熟培養中に退行する卵母細胞も多数認められた。

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直径4-6mmのブタ卵胞から壁穎粒膜細胞の一部が付着した状態で卵子-卵丘細胞複合体を採取し, 卵胞膜とともに振盪培養して, 体外成熟過程を調べた。さらに成熟培養時間および媒精後の精子との共培養時間が卵子の受精および発生に及ぼす影響について検討した。培養24時間後, すべての卵子が第1減数分裂中期へ, 培養33時間後には91%の卵子が第II減数分裂中期に達した。成熟培養30, 36, 42, 48および54時間に媒精し, その12時間後における受精状況を調べた。各区間で精子侵入卵子率に差は認められなかったが, 雄性前核形成率は成熟培養36および42時間後に媒精した卵子で有意に高い値を示した。36時間成熟培養した卵子に媒精し, 3, 6, 9および12時間後に回収して受精状況を調べるとともに, その後の発生状況を観察した。精子侵入卵子率および雄性前核形成率は媒精9から12時間後にかけて増加した。また, 2細胞期以降への発生率は, 媒精9時間後に発生培地へ移したときに57%と最も高かった。以上の結果から, 本培養条件下では成熟培養時間を36時間とし, 媒精後の精子との共培養時間を9時間とした場合に, 最高の正常受精卵子率が得られることが知られた。

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妊娠5日目のラットの子宮から採取した胚盤胞を用いEthylene glycol (EG), Polyethylene glycol (PEG) 及びSucroseを凍結保護物質として, 簡易・迅速なガラス化凍結保存法について検討した. その結果, 40%EG, 51%PEG, 0.5M Sucroseを含むガラス化溶液に胚を浸漬し, 氷上 (3-4C) で2分間平衝させた場合に最も高い生存胚率が得られた. また, この方法によって得られた生存胚を雌ラットの子宮に移植して胎児が得られたが, 発育ならびに成熟後の繁殖能力は正常のラットと同様であった.

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Effects of leukemia inhibitory factor (LIF) on the developmental ability of mouse 8-cell embryos in vitro and in vivo were examined.(1) Eight-cell embryos were cultured with M16+LIF medium in vitro to examine the development to blastocysts and the attachment to culture dish.(2) Blastocysts were transferred to recipient mice following the injection of LIF into the uterine lumen to examine the number of live youngs on Day 17. The results obtained were as follows.(1) When embryos were cultured in a medium supplemented with LIF, the proportion of embryos developed to hatched blastocysts was increased. Blastocysts cultured in the presence of LIF and 10% FCS attached to the surface of the culture dish at a significantly higher frequency than control blastocysts (42vs71-90%).(2) The proportion of embryos that developed into live young was significantly increased, when the LIF was directly injected into the uterine lumen, compared with the control group (15 vs 35%).

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Development of chimeric mouse embryos cultured in a Brinster's medium and a Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) was examined in an attempt to produce chimeric mouse using 8-16-cell stage aggregated embryos. Growth of chimeric mouse embryos cultured in a Brinster's medium or DMEM in vitro was slower than that of normal embryos in vivo. Both Brinster's Medium and DMEM were slightly modified by addition of glucose (0.2% concentration). When modified Brinster's medium and modified DMEM were used to culture aggregated chimeric embryos, growth of aggregated chimeric embryos were faster than aggregated chimeric embryos cultured in several basic media that containing 0.1% glucose. Furthermore, modified Brinster's medium and modified DMEM were incubated with ovaries for 2 hour in advance. When modified and conditioned Brinster's medium and modified and conditioned DMEM were used to culture aggregated chimeric embryos, growth of aggregated chimeric embryos were faster than aggregated chimeric embryos cultured in several modified and not conditioned media that containing 0.2% glucose. Transfer of aggregated chimeric embryos cultured in modified and conditioned Brinster's medium to recipients resulted in live pups.

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Mouse eggs, freed from cumulus cells and zona pellucida, were inseminated at various sperm concentrations in vitro. The fertilization rates of these eggs were in direct proportion to the logarithm of sperm concentration. Sperm concentration for 50% fertilization rate in the zona-free eggs was about 1/25 of that for cumulus-free eggs. Frequency of the number of penetrating sperm in zona-free eggs closely fitted Poisson distribution at low sperm concentration (≤0.9 calls/μl) suggesting that the fertilization was dependent on the random collision of an egg and a fertile spermatozoon. At higher sperm concentrations, however, incidence of monospermic fertilization was significantly higher than that expected from Poisson distribution, showing the vitelline block in these zona-free eggs. When zona-free eggs were coincubated with sperm for restricted periods, sperm attachment started in almost all eggs with 30 sec and eggs with binding sperm reached 87%at 3 min. But these binding sperm were not able to penetrate into cytoplasm immediately and sperm exposure time for more than 30 min was requred to obtain high (>90%) fertilization rate. Increase in total sperm number in the fertilization medium resulted in a significant increase in the fertilization rate at a fix sperm concentration (10 sperms/μl). These result indicate that in vitro frtilization of zona-free mouse eggs is dependent on sperm: egg ratio in the fertilization medium.

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マウスA3-1胚性幹細胞 (A3-1 ES細胞) と透明帯除去胚の共培養によってキメラマウスの作出が可能であるかどうかをいくつかの条件下で検討した。5%牛胎児血清 (FCS) と23mM乳酸ナトリウムを含むDulbecco改変Eagle培地 (DMEM) と10%FCSを含むWhitten培地 (WM) において2種類の濃度 (0.5×10⁶, 1.0×10⁶ cells/ml) のA3-1 ES細胞を8細胞期または桑実期の透明帯除去胚と共培養し、3時間後細胞が接着した胚をWMで胚盤胞まで発生させた。それらの胚を偽妊娠雌マウスに移植し分娩予定日にキメラ個体を含む産仔を得たが、0.5×10⁶cens/mlの濃度のES細胞と桑実胚を共培養した場合、最も高いキメラ産出率 (5.4%) を得た。従って共培養によるキメラ作出法がA3-1 ES細胞にも有効であること及び共培養中に用いる胚のステージはキメラマウス作出の効率に影響することが示された。

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