ヒト乳酸脱水素酵素 (LDH) A (M), B (H) サブユニットの遺伝子変異例について総括した。19例の症例解析により13種の変異 (Aサブユニット4種とBサブユニット9種) が同定された。4種のLDH欠損変異の原因となるミスセンス変異は, LDH分子の機能に重要な保存された配列に生じていた。一方, 2例の電気泳動度に変化を及ぼすミスセンス変異は, サブユニット分子表面に位置していた。これらの点変異の位置, 機能を, タンパクの立体構造に基づいたコンピュータモデルによって解析した。2種のナンセンス変異, 2種の重複変異, 2種の欠落変異は未熟終了をひきおこし, タンパクとして不完全になるため, 合成されても速やかに代謝, 分解されるために, 欠損として発現するものと考えられた。
複数例が同じ変異であったのは2種にすぎず, 他はみな個々に異なっていた。したがって, LDHの遺伝子変異は, かなり多様性のあるものと考えられた。

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Polyclonal and monoclonal antibodies to porcine elastase were produced and characterized. Production of monoclonal antibodies was performed by somatic cell fusion. Titers and cross reactivites of the antibodies were studied by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Each of these polyclonal (R90-03, R90-04) and monoclonal (MAb653F2) antibodies reacted in dose-dependent fashion with porcine elastase. The affinities, as estimated by cross-reactivities of polyclonal antibodies, were highest for porcine elastase and low for human elastase and trypsin. On the other hand, the affinity of the monoclonal antibody was highest for porcine elastase, intermediate for human elastase and lowest for trypsin. Using ELISA methods, with the antibody capture assay, the quantitative determination of porcine elastase was possible using polyclonal antibodies between the range from 0.8 to 80 ng/ml. The quantitative determination of human elastase by antibody capture assay was also possible with use of the monoclonal antibody between the range from 4 to 80 ng/ml. In addition, the presence of elastase in vascular wall smooth muscle cells was demonstrated and the secretion of smooth muscle cell-derived elastase in normal and arteriosclerotic conditions was studied with fluorescent antibody methods using one of the polyclonal antibodies (R90-04). Findings suggested that the secretion of elastase was markedly reduced in intimal smooth muscle cells in arteriosclerotic lesions. The antibodies produced and characterized in the present study may be useful for future pathophysiological investigation of elastase.

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Elastin peptides (α-elastin and elastase-solubilized elastin Peptide) were prenared from insoluble elastin extracted from normal human aorta. Rabbits were immunized with these elastin peptides. We obtained two antibodies, one each to a -elastin and elastase-solubilized elastin peptide. Using these antibodies, an enzyme immunoassay system for the measurement of elastin peptide was devised, and the competitive binding curve obtained with its use was found to be similar to that obtained for radioimmunoassay. Anti-a-elastin antibody recoanized larger and hydrophobic peptides, whereas anti-elastase-solubilized elastin peptide antibody (anti-elastin peptide antibody) recognized smaller and hydrophilic peptides. The enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) using anti-α-elastin antibody was found to be superior to that using anti-elastin peptide antibody for measurement of urinary elastin peptides. The urinar excretion of elastin peptide recognized by anti-α-elastin antibody reflected decree of smokina: the content of elastin peptide in the urine of light smokers (39±22 ng/mg creatinine) was sianificantly less than that in the urine of heavy smokers (188±24 ng/mg creatinine). However, the level of elastin peptide in the urine of light smokers (8.30±0.9μg/mg creatinine) as measured using anti-elastin peptide antibody was not significantly different from that in the urine of heav smokers (7.42±0.95g/mg creatinine). The ELISA for the detection of elastin peptide in human urine using anti-α-elastin antibody described here may be useful for monitoring of elastin metabolism in patients with a variety of connective tissue abnormalities.

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Purification of a recombinant human thyroid-stimulating hormone (rhTSH) was carried out, which was produced in Chinese hamster ovary cells by co-expression of complementary deoxyribonucleic acid for human chorionic gonadotropin (hCG) α and hTSH β subunit as previously described. The cell culture medium was treated by successive chromatographies on S-Sepharose, DEAE-Sepharose, concanavalin-A Sepharose, TSK-G2000SW, and Bio-Gel P-30. Each separation step was monitored by immunoradiometric assay for hTSH. A unique property of rhTSH was observed in the size exclusion chromatography using TSKG2000SW with its flow grossly retarded in the gel. But at the final step by Bio-Gel P-30 column, a single peak of rhTSH with 95% purity was obtained at a position corresponding to the molecular size of pituitary derived authentic hTSH. The overall recovery rate of hTSH immunoreactivity was 10%.
On Western blotting, bands of both the purified rhTSH and a pituitary-derived reference hTSH migrated to the position twice of their molecular weight, showing their tendency of aggregation under a non-reducing condition.
The purification procedures for rhTSH reported here will be applicable to a larger scale production because of its relative simplicity and practical yield.

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In order to establish a speedy and convenient assay of serum CA 19-9, we developed a latex photometric immunoassay of the antigen. Latex reagent was prepared by physical binding of F (ab) 2 fragment of murine monoclonal antibody (1116 NS 19-9) onto latex particles. Latex reagent showed dose-dependent agglutination after being mixed with CA 19-9 antigen. The latex assay required only 10 minutes and could be automated by using conventional clinical chemistry analyzer, COBAS MIRA. Intensity of signal of the reaction could be adjusted by modifying the concentration of reaction accelerating polymer, polyvinyl pyrrolidone K90 (PVP K90). When we used the assay buffer containing 2 g/l of PVP K90, minimum detection dosage was 2 units/ml and measuring range was up to 400 units/ml; they were similar to those of radioimmunoassav (RIA) and enzyme immunoassay (EIA). Within and between assay precisions were both about 5% in coefficient of variation CVI at normal ranae and about 1-2% in CV at increased level. Correlation versus commercially available EIA was y (Latex assay) =1.08x (EIA) +3.41, r=0.981 (n=101). Prozone phenomenon could be detected by utilizing mechanism of the instrument. These results indicate that this assay can be applied to daily analysis in clinical laboratories as a speedy and convenient substitute of RIA and.EIA.

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ビリルビンのジアゾカップリング反応で生成する反応中間体の再結合によるビリルビンの生成について検討した。クロロホルムで抽出された420nm付近に吸収ピークをもつ反応中間体は4℃で1-2週間の保存中に450nm付近に吸収ピークを有する物質に変化した。保存前の反応中間体は酸化により無色物質になったが, 保存により生成した物質は酸化によりビリルビンの酸化で生成するビリベルジンと吸収スペクトルが同じである緑色物質を生成した。また, この物質はジアゾニウム塩と反応し, 紫色の発色体を生成したが, 反応初期の吸収スペクトルには反応中間体の生成を示すと考えられる吸収ピークが420nm付近に観測された。保存により生成した物質を薄層クロマトグラフィで展開したところ, 3種の黄色物質が分離された。これらの物質のRf値は対照として展開したビリルビンIIIα, IXαおよびXIIIαのRf値と一致した。分離した3種の物質は酸化によりビリベルジン, ジアゾニウム塩との反応で紫色のアゾ色素を生成した。これらの結果から, ビリルビンのジアゾカップリング反応で生成する反応中間体は保存中に2分子が再結合し, ビリルビンIIIα, IXαおよびXIIIαを生成したものと考えられた。

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妊婦尿中エストロゲンの簡便な蛍光定量法を酵素加水分解およびKober反応を応用して考案した。本法は, 妊婦尿中エストロゲンの主成分であるエストリオール抱合体の加水分解をリンゴ貝由来のβ-グルクロニダーゼを用いて5分間で完結させ, 遊離したエストロゲンをジクロロメタンで抽出乾固, キノール硫酸液で反応後, 生成物質を抽出し, エストリオールを標準としてエストロゲンの蛍光定量を行うものである。
本法の回収率, 同時再現性, 直線性および他法との相関は良好な結果となり, 臨床検査に有用であると考えられた。

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酸化剤にバナジン酸を使用したビリルビンの新規定量法について検討した。総ビリルビンの測定には間接ビリルビンの反応促進剤としてカチオン型界面活性剤臭化セチルトリメチルアンモニウム, 直接ビリルビンの測定には反応抑制剤として還元剤であるヒドロキシルアミンを含むpH3のクエン酸, または酒石酸緩衝液を第一試薬に用い, エチレンジアミン四酢酸 (ethylenediamine tetraacetic acid: EDTA) またはヒドロキシエタンジホスホン酸を含むpH7の4mmol/lバナジン酸溶液を第二試薬として, 2ポイント測定法で酸化前後の吸光度差を求めてビリルビン濃度を算出した。本条件下で反応は第二試薬添加後2-3分でほぼ終了し, 検量範囲, 同時再現性, ジアゾ法との相関性など必要な基本性能を備え, 血清共存物質の影響もほとんど回避できた。また試薬はいずれも調製が不要な液状であり, 日差変動の是正や検査の省力化に寄与できる。

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腎尿細管の傷害度を知る目的のため, peroxisome顆粒中に多く存在するとされるD-アミノ酸酸化酵素 (DAO) の尿中濃度の測定方法を開発し, 基礎的検討ならびに臨床的応用についての検討を行った。
その結果, 検量線, 再現性, 添加回収試験において十分満足すべき結果が得られた。また尿中DAOの日内変動および年齢間での差はそれぞれ認められず, 基準値は10.0μg/g・Cr以下であった。
本法を用いて糖尿病患者ならびに腎障害患者の尿中DAOを測定した結果, 尿中の微量アルブミン (ALB) やくN-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) などと比べ鋭敏な動きを示し, 早期腎障害の有用な検出マーカーであることが示唆された。

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