蛋白分解酵素は, 触媒残基の種類により, serine-, cysteine-, metallo-, carboxyl-proteinaseの4種類に分類される.人起源の蛋白分解酵素阻害物質の中で, これら4種に分類される, proteinase群の複数を阻害する物質は, α2-macroglobulin, anti-thrombin III以外に知られていない.今回, 人血漿中より, 極めて低分子量であり, かつpapain (cysteine proteinase) , trypsin (serine proteinase) 両者の活性を阻害する物質を見出し, papainをmarker enzymeとして抽出した.
papain, trypsinの阻害活性測定法は, Inhibitor溶液と両酵素をそれぞれpreincubateしたのち, 最大速度の合成基質 (papain-BANA, trypsin-BAPNA) を加え, 反応後分光光度計にて測定した.
Inhibitorの精製は正常人血漿をAmicon YM 5膜により限外瀉過し, 濾液をAmincon YM 2膜により濃縮した.濃縮試料をSephadex G-25によりgel濾過し, 阻害活性の認められた分画を集め, pH 7.2で平衡化したCM cellulofineを通過させた.このelutionをpH 7.2で平衡化したDEAE cellulo丘neに吸着させその後, 0~0.2MNaC1を含む28 mMリン酸緩衝液 (pH 7.2) にてlinear gradientに溶出させた.この試料を再びAmicon YM 2膜により濃縮し, Sephadex G-25によるge1濾過を施し精製した.Cymotrypsinogen A, myoglobin, DNP-L-alaninをマーカーとして, gel濾過法で求めた本inhibitorの分子量は, 約3, 200と測定された.精製過程のyieldは約14%であり, おおよそ14倍に精製された.
精製された5figのinhibitorは5μgのpapain, trypsin活性をそれぞれ50%阻害した.ディスク電気泳動上 (15%gel, pH 9.4) 単一バンドに染色された.同時に電気泳動を施した未染色のgelを2mm間隔で細切し, 0.1M TrisHCl緩衝液, pH 7.2を加え, 一晩抽出したところpapain, triypsinに対する阻害活性がほぼバンド部に一致して証明された.
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