根は水分屈性を発現する能力を有するが、地球上では重力屈性が水分屈性をマスクする。エンドウやキュウリの根では、したがって、突然変異、クリノスタット、宇宙実験などで重力屈性を消去させることによって水分屈性を発現させることができる。一方、われわれは、最近シロイヌナズナやダイコンの根が水分勾配の存在下で水分屈性を強く発現させるのは、水ストレスがコルメラ細胞中のデンプンを分解し、重力応答性を低下させるためであることを明らかにした。シロイヌナズナの根は、重力屈性や水分屈性だけでなく光屈性をも発現させる。そこで本研究では、シロイヌナズナの根における光屈性と重力屈性の相互作用をコルメラ細胞内デンプン量の変化に注目して解析した。その結果、コルメラ細胞のデンプン量が、光屈性に先立って有意に減少することを見出した。すなわち、根は、白色光および青色光の一方向照射によって負の光屈性を、赤色光の一方向照射によって正の光屈性を示した。この光屈性を誘導する一方向照射によってコルメラ細胞中のデンプン量は減少したが、同軸上双方向照射では光屈性が誘導されず、デンプン量も減少しなかった。これらのことから、シロイヌナズナの根は、水分屈性だけでなく光屈性を発現させる場合にも、コルメラ細胞中のデンプン量を減少させることによって重力感受性を低下させ、重力屈性による干渉を小さくする機構を持つものと考えられる。

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　宇宙実験の結果から，微小重力下で生育したキュウリ芽ばえは，2個のペグを対称的に形成し，地上における芽ばえでは，本来，上側で発達可能な1個のペグ形成が重力によって，ネガティブに抑制されることが示された。さらに我々は，オーキシン誘導性遺伝子CS-IAA1の発現解析およびオーキシンの定量実験から，ペグ形成の抑制には，オーキシン濃度の局所的な減少が関与する可能性を示した。
　そこで本研究では，ペグ形成部位におけるオーキシン輸送・蓄積機構を明らかにするために，キュウリから単離したオーキシンInfluxキャリアCS-AUX1およびEffluxキャリアCS-PIN1に対する抗体を作成し，ペグ形成におけるオーキシンキャリアタンパク質の発現および局在を解析した。その結果，CS-AUX1タンパク質は，維管束組織以外の細胞に局在し，ペグ形成の抑制される部位に比較して，ペグの発達する部位で顕著な発現がみとめられた。一方，CS-PIN1タンパク質は，維管束組織・表皮・皮層細胞に局在し，ペグの形成される部位に比較して，ペグ形成の抑制される部位で，その発現が多いことが明らかになった。これらの結果から，オーキシン流出入の2つのキャリア（CS-AUX1およびCS-PIN1）の不均等な発現および局在によって，細胞内オーキシン濃度が変化し，ペグ形成が制御されている可能性が示唆された。

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キュウリの種子を水平に発芽させると，胚軸と幼根の境界領域（TR領域）で彎曲し，その内側に突起状のペグが発達する。われわれは，ペグ形成開始時のTR領域において，重力がオーキシン誘導性遺伝子(CS-IAA1)の偏差的な発現を誘導することを示してきた。そこで，重力によるオーキシンを介した転写制御機構の解明を目的とし，キュウリ由来のAuxin Response Factor (CS-ARFs)の重力応答時のmRNAの局在を解析し，CS-IAA1 mRNAの局在と比較した．その結果，4種のCS-ARFsのうち，CS-ARF2については，ペグ形成開始前の吸水18時間齢の芽ばえ，ならびにペグ形成が開始される吸水24時間齢の芽ばえにおいて，表皮，皮層，維管束組織を含むTR領域全域で顕著なシグナルが検出され，CS-IAA1と発現組織が類似していた．また，解析した全てのCS-ARFsは重力に依存した偏差的な発現ならびにオーキシン応答性を示さないことから，CS-ARFsの発現する組織・細胞はオーキシン・重力刺激とは独立に制御されていると考えられた。CS-ARF2は，構造的特徴から正の転写因子であると予想され，ペグ形成開始前のTR領域においてCS-IAA1を含むオーキシン誘導性遺伝子の転写を活性化し，その活性はペグ形成開始時にオーキシン勾配により変化し，オーキシン誘導性遺伝子の偏差的発現を誘導するものと推測された．

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　宇宙微小重力環境下でエンドウ（Pisum sativum L. cv. Alaska）を発芽，生育させると，黄化芽生え上胚軸は子葉から離れる方向に傾斜した伸長（いわゆる自発的形態形成）を示すと共に，オーキシン極性移動能が著しく低下する．この様な自発的形態形成は，3次元クリノスタットにより作出された疑似微小重力環境および1g下におけるオーキシン極性移動阻害剤の投与により模写できることから，自発的形態形成におけるオーキシン極性移動の関与が示唆された．オーキシン極性移動には，原形質膜に存在するefflux 及びinflux carrierタンパク質が重要な役割を果たしている．本研究では黄化エンドウ芽生えを対象に，オーキシン極性移動システムの構築を分子レベルで解析し，自発的形態形成との関係を解明することを目的とした．黄化エンドウ芽生えにおいてオーキシン極性移動関連遺伝子と推定されるPsPIN1及びPsAUX1の存在を確認した．PsPIN1 cDNAをクローニング後，塩基配列を決定した結果，シロイヌナズナAtPIN遺伝子群との間に高い相同性を認めた．また，黄化芽生えの各器官及び各生育段階においてPsPIN1及びPsAUX1の発現が認められた．これらの遺伝子発現に対する疑似微小重力およびオーキシン極性移動阻害剤の影響を調べ，オーキシン極性移動と自発的形態形成との関係を考察したい．

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当研究室において、疑似微小重力環境を作出する三次元(3D)クリノスタット上で培養したヤマザクラ幼植物は、地上植物と比べて、その茎の支持機能の発達が著しく抑えられることを明らかにしてきた。そこで本研究では、3D上植物の光合成活性について検討したので報告する。ヤマザクラ幼植物を材料とし、地上および3Dクリノスタット上で4週間培養した。光合成活性はLI6400 portable photosynthesis meter (LI-COR, Inc., USA)を使用して測定し、クロロフィルはaおよびbの量を測定した。また葉、茎および根は、各器官に分けて凍結乾燥し、その重量を測定した。3D上植物および地上植物の光合成活性は約3μmol CO₂ m^-2 s^-1、クロロフィル含量は約0.34 g m^-2、クロロフィルa/bは約3、気孔密度は240～250 mm^-2であり、両者間に相違は認められなかった。一方、個体あたりの葉面積および葉の乾燥重量は3D上植物の方が地上植物よりも大きかった。本研究により、3D上植物の光合成活性は地上植物と同等であり、光合成活性は重力環境の変化には影響されないことが、樹木において初めて明らかとなった。さらに、3D上植物において増加した光合成産物は、主に光合成器官である葉の成長に用いられ、支持機能を担う茎や根への分配率が減少する傾向が認められた。

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地球上には多種多様な生物が生存し、互いに作用し合い何らかの影響を受け合っている。この現象はアレロパシー（他感作用、生物間相互作用）として2000年以上の古来より観察がなされてきている。アレロパシーは地球において、長い年月をかけて自然生態系内で作り上げられてきた作用の一つである。このようなアレロパシーに関与する物質の生合成や放出・輸送、およびアレロパシー物質への感作過程が、微小重力環境において変化するかいなかについて、強い阻害的アレロパシー活性を示すムクナを植物材料とし、その原因物質の一つであるL-爪―パを指標として研究した。微小重力環境は3D-クリノスタットを用いて擬似的に生成した。滅菌した市販のポットに0.8%の低温ゲル化寒天を注ぎ、ムクナ幼植物を植えた。検定植物としてレタスとシロイヌナズナをムクナの周りに播種した。3D-クリノスタットによる微小重力実験群では、地上対照群に比べてアレロパシー活性が低い傾向にあった。ムクナの代わりにL-ドーパを寒天培地に与えた場合には、微小重力環境下でもレタス、シロイヌナズナともに地上対照群と同じく著しい成長阻害が認められたことから、L-ドーパを含むアレロパシーに関与する物質のムクナでの生合成が微小重力環境で減少するか、生体内での循環が減少している等の可能性が示唆された。放出後のアレロパシー物質の拡散輸送過程の寄与なども詳細に検討している。

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ダイズ種子貯蔵タンパク質βコングリシニンのβサブユニットをコードする遺伝子は、硫黄栄養により転写レベルで制御される。この遺伝子の硫黄応答領域235bpをカリフラワーモザイクウィルス35SRNAプロモーターに挿入することにより、本葉でもこの遺伝子の硫黄応答を観察できるようになった (Awazuhara et al. 2002)。また、上記キメラプロモーターにGFP遺伝子を繋いで形質転換したシロイヌナズナNOB株では、硫黄欠乏によりGFPの蛍光強度が増加した (Ohkama et al. 2002)。本研究では、NOB株の種子をEMS処理した後代から，GFP蛍光強度を指標にして変異株を単離した。約4万株のスクリーニングにより25株の変異株候補を得た。戻し交雑で1遺伝子変異と確認され、さらに、GFPの蛍光強度とmRNA量に相関のあった株について解析を行っている。
このうち，nbm1-1 (NOB mutant)は、培地の硫黄濃度に関わらずGFP蛍光が親株であるNOB株よりも強い。内在性の硫黄応答性遺伝子Sultr2;2, APR1. SAT1（いずれも硫黄代謝系の酵素の遺伝子）の発現も強くなっていた。また、硫黄欠乏のシグナルとされているO-アセチルセリン濃度が高かった。nbm1-1変異の原因遺伝子は、5番染色体上腕にあると分った。Awazuhara et a l. (2002) Plant Sci. 163: 75-82 Ohkama et al. (2002) Plant Cell Physiol. 43: 1266-1275

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ダイズ種子貯蔵タンパク質βコングリシニンのβサブユニットをコードする遺伝子の発現は、硫黄欠乏（ΔS）により転写レベルで増加する。βサブユニット遺伝子のプロモーターの硫黄栄養応答領域をカリフラワーモザイクウィルス35S RNAプロモーターに挿入しGFP遺伝子に繋いだコンストラクトを導入した形質転換シロイヌナズナであるNOB株は、ΔSでGFP蛍光を増した（Ohkama et al. 2002）。NOB株をEMSで処理したM2植物から、GFP蛍光の強度が変化したものを選抜し、その解析を行っている。nbm2-1は通常及びΔS条件で2週間栽培した植物において蛍光強度が強くなった。植物体のサイズは小さかった。また、通常の条件で2週間栽培したこの変異株では硫黄欠乏のシグナル物質であるO-アセチル-L-セリン(OAS)と硫黄充分のシグナル物質であるグルタチオン(GSH)の両方の濃度が増加していた。他に、システインの濃度が増加し、硫酸イオンと硝酸イオンの濃度は減少した。また、ΔSで誘導されることが知られている硫黄代謝関連遺伝子であるSultr2;2、APR1、SAT1のmRNA量が増加していた。現在この変異株の原因遺伝子の同定と生理的解析を行っている。
Ohkama, N. et al., Plant and Cell Physiology 43(11): 1266-1275 (2002)

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植物が硫黄欠乏にさらされると、硫黄同化系で働くいくつかの酵素の活性および遺伝子発現が上昇する。シロイヌナズナでは14種の硫酸イオントランスポーター(Sultr)が存在しており、このうちSultr2;1を含むいくつかのSultrのmRNAは、シロイヌナズナの地下部において硫酸イオン濃度の減少に応答して蓄積する。現在までに植物体内外の硫黄濃度の感知機構、硫黄栄養に応答した遺伝子発現の調節機構についてはほとんど知られておらず、SultrのmRNA蓄積機構を明らかにすることで、植物の硫黄栄養条件に対する適応機構に迫りたいと考えている。各種阻害剤を用いた解析から、硫黄欠乏時のSultr2;1 mRNAの蓄積は転写後制御によっていることが示唆された。Sultr2;1は根においては内鞘細胞と木部柔細胞で発現が認められる。Sultr2;1について5'領域::Luc::3'領域を導入した形質転換植物を作製し、硫黄欠乏時のレポーター活性の変化を調べたところ、3'領域を含む植物のみで硫黄欠乏時のレポーター活性が増加した。5'領域:: GFP::3'領域を持つ植物でも同様に、GFPの発現が観察された。Sultr2;1 3'領域には、mRNAの安定性制御に関わるDST-element様の配列が含まれており、硫黄栄養応答にもこの配列が関わる可能性が示唆された。

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植物はリン欠乏条件に対して、様々な機能によって適応することが知られているが、その機能の詳細については部分的にしかわかっていないことが多い。そこで本研究では、低リン適応機構に関連すると考えられる各種遺伝子の発現の変化について、イネcDNAマイクロアレイ法と定量的リアルタイムPCR法を利用して複数遺伝子の発現変化を同時に調べ、網羅的かつ体系的な解析を行なうことを目的とした。
イネ（Oryza sativa L. cv. Michikogane）を＋P (1 ppm)、－P (0 ppm)条件下で一定期間栽培し、地上部および根部からRNAを抽出し、イネcDNAマイクロアレイ法および定量的リアルタイムPCRを用いて各種遺伝子の発現解析を行った。
　リン欠乏処理によっていくつかのリンの吸収に関わると想定される遺伝子の発現が大幅に上昇していることが確認された。また地上部において、リン欠乏条件下で炭素代謝に関わる複数の遺伝子の発現が変動していることが確認された。一方、根部において有機酸の生合成および分泌に関与していると考えられる遺伝子群は低リンにおいて有意な発現の増加は認められなかったことから、低リンストレスによって有機酸分泌能の誘導は確認されなかった。

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多くの植物は低リン条件に陥った場合に、体内のリンの循環を高めて特に新規生長部位の生長を支えるように適応しようとする能力が発達している。このような体内のリン含有率の制御には活発なリン化合物の分解とその利用が関与していると考え、いくつかの酵素(Ribonuclease, Acid phosphatase)の体内での活性の変化を調査した。また、多くのリン化合物の代謝は炭素代謝系と密接に関連していることから、リンの効率的利用に関わると考えられるTriose phosphate translocator, Phosphoenolpyruvate translocator, Phosphoenolpyruvate carboxylase, Pyruvate kinase, NAD-Glycerol 3-phosphate dehydrogenase, NADP-Glycerol 3-phosphate dehydrogenaseの発現解析をRT-PCR法を用いて調査した。その結果、低リン処理によって無機態のリン含有率が著しく低下し、RNase, APaseの活性が高まった。単糖の含有率が低下する一方でデンプン含有率が高まった。このとき特にPPTの活性が高まったことから、低リン条件下のイネの適応機構において細胞質からクロロプラストへのPEPの取り込みが重要な働きを持っていることが予想された。

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植物は低リン条件下で酸性フォスファターゼ(APase)活性が高まり、リンの転流および吸収のために体内または根圏で有機態リンを分解する。本研究は、APaseの低リン条件下での機能をより詳細に解析することを目的として実施した。
本研究では、低リン耐性が強く根から多量のAPaseを分泌することが知られているルーピン(Lupinus albus L.)を供試した。+P区(2 ppm), -P区(0 ppm)を設けてルーピンを水耕栽培し、経時的に器官別に採取した。各試料から可溶性タンパク質を抽出し、等電点電気泳動法によりAPaseアイソフォームのプロファイリングを行った。根や本葉では-P区で特定のアイソフォームのAPase活性だけが上昇するのではなく、複数のアイソフォームの比活性が上昇した。子葉と茎・葉柄においては、-P処理はAPase活性に大きく影響しなかった。根分泌液からは、根で最も高い活性を示したpI 4.7のアイソフォームだけが-P区で検出された。全RNAを抽出し、これまでに単離したルーピン由来の3種類のAPaseのmRNA量を調査したところ、細胞壁局在型APaseとフィチン酸特異的APaseの遺伝子は、リン処理による変動は小さく、すべての器官において発現が認められた。一方、分泌性APase遺伝子の発現は-P区の根のみで検出され、他のAPaseの遺伝子発現の変化とは異なっていた。

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　重金属ストレスに応答して、Synechococcus sp. PCC 7942では、Zn²⁺をキレートするメタロチオネインSmtAが発現するのに対し、Synechocystis sp. PCC 6803では、Zn²⁺トランスポーターであるZiaAが発現する。それぞれの遺伝子発現を制御するリプレッサーであるSmtBとZiaRはともにArsRファミリーに属し、高い相同性を示すが、両者による遺伝子発現制御のレベルには差がある。この違いを解明するために転写制御に関わるシスエレメントの機能を比較した。それぞれのリプレッサーによって認識される塩基配列は相同性のあるinverted repeatを形成しているが、それらがsmtAのプロモーター領域には2つあるのに対し、ziaAのプロモーター領域には1つしかない。それぞれのプロモーター領域を含むDNA断片と、SmtBとの複合体形成をゲルシフト法で解析した結果、タンパク質濃度1×10^-7 M以上でsmtAのプロモーター領域とは複合体を4種形成したのに対し、ziaAのプロモーター領域とは2種類の複合体を形成した。このことから、smtAのプロモーター領域に2つのinverted repeatが存在することによって、SmtBはより大きな複合体を形成し、リプレッサー効果を高めていると考えられる。

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　ラン藻Synechococcus sp. PCC 7942のメタロチオネインSmtAは、Zn²⁺などの重金属を結合し、細胞内の重金属濃度を調節している。NMRによる構造解析から、SmtAはN末端側の領域(Met1～Cys47)に2個、C末端側の領域（Gly43～Gly56）に1個のZn²⁺を結合することが推測されている。また、N末端領域あるいはC末端領域単独でもZn²⁺の結合能を保持していた。本研究では、SmtAにN末端領域を連続的に接続したペプチド、およびC末端領域のみを連続させたペプチドを作製し、Zn²⁺結合数の増加を試みた。
　smtA 遺伝子にN末端領域のDNA断片を複数個接続したコンストラクト、およびC末端領域のDNA断片を複数個接続したコンストラクトを作製した。これをGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させて精製した。ICP発光分析によりZn²⁺結合数を調べた結果、野生型SmtAのZn²⁺結合数は2.9であり、N末端領域を1つずつ増やしていくにしたがってZn²⁺結合数が2ずつ増加していった。N末領域を10個つなげたものは約23個のZn²⁺が結合した。C末端領域も同様、この領域1つに対してZn²⁺結合数が1つずつ増加し、Zn²⁺を1個結合するのに必要とされるアミノ酸の数が野生型SmtAよりも少ない、効率のよい人工ペプチドが作製できた。

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重金属イオン輸送に関与するCPx-ATPaseは新しい型のP型ATPaseの1つである。その存在は植物細胞においてはあまりよく知られていない。本研究においてラン藻Oscillatoria brevisのゲノムDNAから重金属イオン輸送に関わると思われるP型ATPaseの一種であるCPx-ATPaseをコードする遺伝子（Bxa1）を単離し、その特性解析を行ったので報告する。
膜を介して重金属イオンの輸送に関与するCPx-ATPaseをコードする、全長1983-bp ORFの遺伝子は8個の膜貫通領域を含んでいた。またP型ATPaseに共通なATP結合部位（GDGINDAP）、リン酸化部位（DKTGTL）、ホスファターゼドメイン（TGES）や陽イオン輸送チャンネル（CPC）、と考えられる保存モチーフを含んでいた。N末端にはシステインの代わりに11個のヒスチジンモチーフが存在した。Bxa1のmRNAは1価（Cu⁺、Ag⁺）および2価（Zn²⁺、Cd²⁺）のいずれの重金属によっても同様なレベルで誘導された。またBxa1を導入したE. coliの形質転換体においてもいずれの種類の重金属に対しても耐性を示した。

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　我々はPhytoremediationに適した重金属耐性・高蓄積性形質転換植物の作製を目的とした研究を行っており、今回はタバコのZRC1形質転換体について報告する。 酵母の亜鉛トランスポーター、ZRC1（zinc resistance conferring 1）は、細胞質中の過剰な亜鉛を液胞内に取り込むことにより細胞内の亜鉛のホメオスタシスに関わっていることが知られている。またカドミウムを輸送することも明らかになっており、酵母のZRC1高発現変異体は亜鉛及びカドミウムに対し耐性を持つことが知られている。そこでカドミウム高蓄積植物の作製を目的としてzrc1遺伝子をタバコに導入しカドミウム耐性や重金属蓄積性について検討した。得られた形質転換体のタンパク質レベルでのzrc1の発現は低かったが、植物体中の蓄積濃度がコントロールと比べて高いものが認められた。蓄積濃度は高くないものの、バイオマスが顕著に大きく、その結果として総蓄積量が増加しているものも認められた。これは導入したZRC1により亜鉛やカドミウムの液胞への輸送が促進され、細胞質中での濃度が生育に影響しない濃度まで下げられていることによると考えられる。現在zrc1遺伝子の局在性とその機能、Phytoremediation への応用の可能性について検討を進めている。

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Lolium perenne and Poa pratensis are perennial grasses which are used to correct Fe-deficiency of fruit tree in calcareous soil by growing them along the tree. We investigated the response of these grasses to Fe-deficiency, focusing on the secretion of Fe-chelating substances from the roots. Both grasses secreted Fe-chelating substance from the roots in response to Fe-deficiency and the secretion was characterized by a temperature-controlled diurnal rhythm. Three kinds of phytosiderophores were secreted from Lolium perenne (cv. Tove); two of them were 2*-deoxymugineic acid (DMA) and 3-epi-hydroxy-2*-deoxymugineic acid (epiHDMA), while the third one was not identified previously. After purification, this unknown compound was identified as 3-hydroxy-2*-deoxymugineic acid (HDMA) by NMR. On the other hand, DMA, avenic acid A (AV) and an unknown compound were secreted from Poa pratensis (cv. Baron). The purification and identification of this unknown compound are currently being undertaken.

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　シロイヌナズナにおいて、葉の主軸および花茎においてのみ顕著に伸長の欠損した突然変異体[short stem and midrib(ssm)]を単離し解析した。遺伝子歩行によりその原因遺伝子を特定したところ、液胞膜に局在する syntaxin をコードするSYP22/AtVAM3であることが判明した。ssm変異体では、SYP22/AtVAM3の第6イントロンに34bpの欠損が起こり、短くなったイントロンがスプライシングされなくなっている。その結果、第6エクソン(= juxtamembrane domain)と第7エクソン(= transmembrane domain)の間に19アミノ酸のペプチドが挿入されたタンパクがコードされている。
　ssm変異体の遺伝学的解析から、SYP22/AtVAM3の最も相同性の高いホモログであるSYP23にエコタイプ間の多型があり、Landsberg型はssm変異体を相補できるのに対しColumbia型はできないことが判明した。すなわち、Columbiaエコタイプのバックグラウンドでのみ劣性1遺伝子変異の表現型が現れる。
　SYP22/AtVAM3を含む複数の syntaxin ホモログの遺伝子破壊株はいずれも配偶体致死になることから、このような変異体の存在は、植物における syntaxin ホモログの機能解析に大きなヒントを与えるものと考えている。

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我々は高等植物の花茎の重力屈性の分子機構を理解するために、変異体をシロイヌナズナから単離し解析している。劣性変異体zigzag (zig)-1は重力屈性異常に加えて、花茎が節で折れ曲がりジグザグな形態を示す。そしてZIGは液胞への小胞輸送に関与するSNAREの1つAtVTI11をコードしていた。そこで、形態形成や重力屈性における液胞への小胞輸送の機能を詳しく理解するために、zig-1のサプレッサー変異体を多数分離し解析を進めている。zig suppressor 1（zip1）優性変異はzig-1の形態と重力屈性異常を完全に抑制する。マッピングの結果、zip1ではAtVTI12に一塩基置換変異が見出された。zip1変異型AtVTI12と野生型AtVTI12 のゲノム断片をzig-1に形質導入した結果、前者では形態と重力屈性の異常が完全に相補され、後者では相補されなかった。この結果はzip1の原因遺伝子がAtVTI12であることを示している。AtVTI12はZIG/AtVTI11のホモログであり、アミノ酸レベルで約60％の相同性を示す。しかし、このサプレッサー変異株の存在から、両者は異なる機能をもつSNAREと推定される。そこでzip1がなぜzigの重力屈性および形態の異常を相補できるのかを明らかにするための解析を現在進めている。

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Rice α-globulin is a 2S albumin-type seed storage protein that accumulates in the protein storage vacuole (PB-II) in starchy endosperm. We constructed GFP fusions with different regions of α-globulin to identify the vacuolar-targeting signal. The localizations of the fusion proteins and prolamin protein bodies (PB-I) stained with Rhodamine in developing endosperm were simultaneously analyzed by confocal microscopy. GFP fused with the N-terminal region (M1-S43) was mostly present in dilated ER till 12 DPA, in which single or multiple PB-I were frequently visualized. Subsequently, the GFP fusion protein was efficiently transported from the dilated ER to PB-II by 18 DPA. GFP in protein bodies was sequestered to the periphery and matrix that surrounds crystalloids containing glutelins. Since the signal peptide (M1-A22) is cotranslationaly cleaved, we conclude that an efficient vacuolar-targeting signal for α-globulin exists in the N-terminal region from Q23 to S43.

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Two major families of seed storage proteins, 2S-albumin and prolamin, have common regions termed A, B, and C, which respectively contain highly conserved CxxL, CCxxL, and PxxC motifs. In rice endosperm, the ABC-containing α-globulin and prolamins accumulate in the protein storage vacuole (PB-II) and ER-derived protein body (PB-I), respectively. Molecular mechanisms responsible for targeting storage proteins into PB-I or PB-II are still unclear. We found that partial α-globulin polypeptide (G21-Q111), containing the A and B regions, targeted GFP into PB-I. We hypothesized the protein-protein interaction between the B region and prolamins caused the accumulation of the fusion protein in PB-I. To clarify the role of CCxxL motif in the B region for PB-I targeting, we substituted each amino acid residue in the CCxxL motif. We report the analyses of their localizations and discuss the role of the CCxxL motif in protein accumulation in PB-I.

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動物細胞において、エンドサイトーシスには様々な分子が関わっていることが明らかになっている。しかし、高等植物におけるエンドサイトーシスは、つい最近までその実態が明らかにされてこなかった。我々は、植物のエンドサイトーシスを明らかにする目的で、蛍光色素であるFM4－64を使用し、タバコ培養細胞（BY－2）におけるエンドサイトーシスの様子を観察した。BY－2をショ糖存在下またはショ糖飢餓下で培養し、FM4－64を与えた。FM4－64は細胞膜に吸収され、その後小胞を経由して液胞に到達した。ところが、ショ糖飢餓下で培養したBY－2にパパイン型システインプロテアーゼの阻害剤であるE64dを与えたところ、液胞に到達するFM4－64は減少し、サイトゾルにFM4－64で染色される大量の小胞が蓄積した。この小胞は酸性オルガネラを染色する蛍光色素であるキナクリンで強く染色された。ショ糖存在下で培養したBY－2では、E64dを与えても小胞の蓄積は全く見られなかった。このことから、ショ糖飢餓下のBY－2においてのみ、E64dはエンドサイトーシスを抑制する働きがあることが明らかとなった。様々なプロテアーゼ阻害剤を用いた実験から、このエンドサイトーシスに関わるパパイン型システインプロテアーゼは、アルギニンやリジンのC末端側を切断するエンドペプチダーゼであると考えられた。

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演者らは、小胞体膜タンパク質チトクロムB5とRFPの融合タンパク質をタバコ培養細胞BY-2に発現させた場合、細胞内にRFP融合タンパク質が凝集したオルガネラ(RV)が形成され、それらが細胞増殖の定常期に液胞へ移行し、液胞内腔にRFPが検出されるという現象を見出している。まず、RVを特定するために、様々な細胞小器官に対するマーカー抗体を用いて間接蛍光抗体染色を行った。その結果、RFPの蛍光は各種の細胞小器官と異なる局在を示したことから、RVはこれらのオルガネラではないと考えられた。次いで、抗RFP抗体を用いた免疫電顕および微細構造観察を行い、RVは脂肪粒のような構造体であると考えられる結果を得た。RVの液胞移行を誘導する条件を検討した結果、ショ糖飢餓条件で、RFPの蛍光が液胞に観察された。ショ糖飢餓条件下で、システインプロテアーゼの阻害剤(E-64)を加えショ糖飢餓条件下で培養した場合、蛍光顕微鏡下においてRVは液胞移行せずに核の周辺に見られ、電顕観察により核周辺の細胞質に多くオートリソソームが観察された。この細胞の細胞質中にRVが存在しないことから、RVはオートリソソーム内に存在すると考えられ、RVはオートファジーにより液胞内へ取り込まれることが示唆された。現在、ショ糖飢餓条件下でRVの液胞移行を阻害する遺伝子の探索を行っており、その結果についても報告したい。

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オートファジー（自食作用）とは、栄養飢餓等に伴い細胞質成分が液胞に輸送される分解システムである。我々は酵母において、Apg8タンパク質のC末端がApg4プロテアーゼにより切断された後、ユビキチン化に類似した反応により脂質修飾されること、そして、このApg8脂質修飾反応がオートファジー進行を担う分子機構の鍵になることを見いだしている。
　シロイヌナズナにはAPG8, APG4オーソログ（AtAPG8, AtAPG4）が存在し、その詳細が明らかになっていない植物のオートファジーにおいても同様の役割を担っていることが予想される。全9種のAtAPG8および全2種のAtAPG4はシロイヌナズナのほとんどの器官で発現しており、窒素飢餓条件下で発現がさらに誘導された。また、酵母ではオートファジーの進行に伴いApg8は液胞内に移行することが知られている。そこで、GFP-AtAPG8融合タンパク質を発現させた形質転換植物を作製し、様々な組織での蛍光顕微鏡観察を行なった。GFP融合タンパク質は細胞質中のドット状構造や液胞内への局在が観察された。現在、栄養条件下から窒素飢餓条件下に移したときのGFP融合タンパク質の挙動の変化を観察している。また、2種のAtAPG4のT-DNA挿入株をそれぞれ取得し、その二重変異株におけるAtAPG8の挙動について解析中であり、その結果についても合わせて報告する。

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Various types of mutants of precursor to the small subunit of RUBISCO (prSS) were designed and overexpressed in E. coli. The wild-type of Pisum sativum prSS has three Cystein residues, while these mutants have single Cystein residue at the various positions. These single-Cystein mutants (prSSC1) were modified with either the photoreactive crosslinker or the biotinylation reagent at the Cystein residue. The modifications didn't affect both the binding and the import activities of prSSC1. The protein close to one of the prSSC1 during binding step was crosslinked with prSSC1 via photoreactive crosslinker. Thus the identification of this crosslinked product is underway. On the other hand, one of the biotinylated prSSC1, incubated with avidin prior to the import assay, formed the protein translocation intermediate, in which prSSC1 was processed, but remained at the membrane. The characterization of the entire complex of this protein translocation intermediate is also underway.

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　高等植物葉緑体を構成する蛋白質の大部分は核ゲノムにコードされており、サイトゾルで葉緑体行きの局在化シグナルが付加された前駆体として合成されたのち、葉緑体へ輸送される。この輸送には葉緑体外包膜および内包膜に存在する蛋白質輸送装置、Toc、Tic複合体が関与している。
　演者らは昨年度の本年会において、Toc複合体はBlue-Native電気泳動により分子サイズ700-800Kに泳動される位置に、Toc34, Toc75, Toc159のいずれをも含むバンドとして検出されることを報告した。今回、さらにこれらTocコンポーネントによる複合体構築様式を明らかにするため、まず、エンドウ葉緑体における各コンポーネントの存在量の概算を行い、その存在比を見積もった。次に、無傷葉緑体をプロテアーゼ消化することによりToc複合体の限定分解をおこないBlue-Native電気泳動で解析した。その結果、Toc複合体は段階的に分子サイズを下げ、コアを形成すると考えられる複合体が観察された。また、それに伴いTocコンポーネントの部分的な解離が起こることもわかった。演者らはこれまでにアラビドプシスにおけるこれらの輸送装置コンポーネントをコードする遺伝子についてT-DNA挿入変異体を単離してきており、これらの変異体において輸送装置複合体のサイズと分子構成に変化があるのかを解析中である。

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集光性クロロフィル結合蛋白質(LHCP)の葉緑体チラコイド膜への挿入に関わるシグナル認識粒子(SRP)依存性経路では、cpSRP43、54、SRPレセプターのcpFtsYおよびALB3の関与が示唆されているが、各蛋白質の機能の詳細は明らかでない。本研究では葉緑体形成過程におけるcpFtsYの役割の解明を目的に、トウモロコシのcpFtsYの遺伝子座にMu挿入変異を有するcsr (chloroplast SRP receptor) 1-1、1-3変異株を解析した。エキソン部分に挿入変異を有するcsr1-1変異株ではcpFtsYは全く発現しておらず、葉は黄緑色だった。一方、イントロン部分に挿入変異のあるcsr1-3変異株は、cpFtsYがわずかに発現しており、葉は薄緑色であった。両変異株は劣性ホモで、播種後2週間目に枯死した。変異株単離葉緑体へのLHCPの輸送実験を行ったところ、包膜透過は野生株と同程度であったが、チラコイド膜への挿入が顕著に減少していた。csr1-1変異株の葉緑体では、チラコイド膜のスタックが著しく減少しており、維管束鞘細胞では澱粉粒の減少が観察された。また、csr1-1変異株ではLHCPだけでなく光合成に関わる様々なチラコイド膜蛋白質の減少が確認され、葉緑体の光合成装置に多面的なdefectが生じていることが明らかになった。

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インポーチンβ は、核移行シグナル（NLS）を持つ核蛋白質を、細胞核内へと運ぶ核輸送蛋白質である。NLSを持つ核蛋白質は、NLS受容体であるインポーチンα、インポーチンαと結合するインポーチンβ と、細胞質側で3者複合体を形成し、インポーチンβの機能により核膜孔を通過して核内へと移行する。植物細胞の核輸送系を解析するために、私たちはイネからインポーチンβのcDNAを2種、クローン化した。これは植物のインポーチンβ についての唯一の報告であるとともに、2分子種のインポーチンβ が同定された初めての例である。現在までに、酵母からヒトに至る様々な真核生物からインポーチンβ が単離されているが、イネ以外の生物種からは単一分子種のインポーチンβ しか同定されていない。このことから、私たちは2分子種のインポーチンβ が存在することの意義に関心を寄せている。両インポーチンβ分子間の差異を明らかにするために、（1）GFP融合蛋白質を用いたインポーチンβ の細胞内分布の解析（2）GST pulldown assayによるインポーチンβ とインポーチンα遺伝子との結合能の比較（3）Northern解析による遺伝子発現様式の比較を行い、両インポーチンβ間の機能分化を示唆する結果を得た。本大会ではこれらの結果について報告する。

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哺乳動物や酵母において、ペルオキシソーム形成因子（ペルオキシン）が同定されている。植物でも、哺乳動物や酵母のペルオキシンと相同性のある遺伝子の存在が明らかになりつつあるが、その機能については不明な点が多い。多くのペルオキシソームタンパク質はC末端またはN末にあるターゲティングシグナル（PTS1、PTS2）がPTSレセプター（Pex5p、Pex7p）に認識され、ペルオキシソーム膜上の輸送装置に結合することによってペルオキシソームへ輸送されることが示唆されている。
これまでに、ペルオキシソームタンパク質の一つであるカタラーゼ（カボチャカタラーゼ：Cat1）について、そのターゲティングシグナルを同定するとともに、酵母two-hybrid系を用いたPTS1レセプター（Pex5p）との結合解析の結果からCat1がPTS1系によって輸送されることが示唆された。今回、ペルオキシソーム膜上の輸送装置の一部で、C末にRINGフィンガーを持つペルオキシンPex10p、Pex12p等に焦点をあて、タバコを材料としてこれらのcDNAのクローニングを行った。また、アンチセンス法を用いてこれらの発現を抑制したタバコ形質転換体を作成し、カタラーゼの輸送を解析した。

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緑藻Chlamydomonas reinhardtiiは硫酸イオン欠乏条件下で細胞外にarylsulfatase（ARS）を分泌する。我々はこのARSを分泌蛋白質のマーカーとして用いて、単細胞緑藻の蛋白質分泌機構を研究し、各種薬剤に対する感受性から、微小管に依存し、高等植物細胞よりも動物細胞に類似した機構によりARSが分泌されることを報告した（昨年度年会）。
今回、ARSの輸送機構を形態学的に調べるために、抗ARSポリクローナル抗体を作製し、ARSの分泌部位を蛍光抗体法で調べた。その結果、ARS分泌を誘導した細胞では、鞭毛基部付近に点状の強いシグナルが観察されたが、分泌誘導を行っていない細胞やoryzalin（微小管重合阻害剤）処理した細胞では、特異的シグナルは見られなかった。この結果は、ARS輸送が微小管に依存した極性輸送であることを示唆する。また、他の生物種で蛋白質輸送に関与する蛋白質の影響を調べるために、ERからの輸送小胞の形成に必要な低分子量GTP結合蛋白質SAR1の相同遺伝子をクローニングし、動物細胞や酵母で明らかになっている優性変異を導入した変異型SAR1遺伝子を作製した。
現在、各種薬剤や変異型SAR1遺伝子が輸送小胞やオルガネラ（ゴルジ体やERなど）の形態・局在に対する影響を電子顕微鏡による微細構造観察により解析している。

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Bacterial periplasmic proteins use the Sec machinery or the TAT pathway for translocation across the plasma membrane. Precursors transported by the Sec machinery are unfolded before translocation, while precursors transported by the TAT pathway have pre-bound cofactors or have been oligomerized. We have characterized periplasmic substrate-binding proteins (NrtA and CmpA) of ABC transporters in Synechococcus sp. PCC7942 that have 47% identity to each other. These proteins have characteristic signal peptide for the TAT pathway. We have shown that the *TAT* signal peptide was essential for the function of the NrtA protein. In this report, we show that the CmpA protein forms tetramer. These findings suggest that the TAT pathway is required for the tetrameric structure of the substrate-binding proteins and the tetrameric structure is required for the function of these proteins. We are characterizing the relationship between the TAT pathway and the tetrameric structure of these proteins.

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C₄植物の維管束鞘細胞（BSC）葉緑体は、維管束に対して遠心的または求心的に配列している。シコクビエにおいて伸長成長中の葉組織ではBSC葉緑体はほぼ均一に分布しているが、伸長停止後は短期間のうちに維管束側に移動し、求心的配列をとる。また、遠心処理により葉緑体の求心的配列を乱れさせても、大半の葉緑体は数時間以内に元の求心的位置へと移動する。これらの葉緑体の移動には、アクチンフィラメントが関与していることが阻害剤を用いた実験より推察されているが、その分子機構は明らかになっていない。そこで本研究では分子機構解明の足掛かりとして、シコクビエ葉細胞内のアクチン骨格の可視化を行った。抗アクチン抗体を用いた蛍光抗体法により、BSCにおいて細胞膜周辺と葉緑体を囲むアクチン骨格が観察された。また、若いBSC葉緑体の維管束側への移動過程、遠心処理で乱れたBSC葉緑体の配列回復過程でも葉緑体周辺にアクチン繊維の存在が確認された。これらのアクチン繊維がBSC葉緑体の配列の維持や細胞内での移動に関与していることが期待される。

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Root hairs are tubular extensions from root epidermal cells and elongate by tip growth. It has been suggested that actin cytoskeleton plays an important role in the process of tip growth. However, little is understood about a direct role of actin cytoskeleton in root-hair development. We isolated a novel Arabidopsis missense mutation in the ACT2 gene encoding a member of actin expressed in vegetative tissues. In the heterozygote, root-hair growth was inhibited and aerial parts of the plant showed dwarf phenotype. In the homozygote, any root hairs were not formed and growth of the plant was disturbed severely to result in seedling lethal. Transgenic plant expressing a mutant-formed ACT2 protein showed the phenotypes of the mutant as described above, indicating that the mutant protein have dominant-negative effects to cause morphological defects. We will discuss possible roles of actin cytoskeleton in root-hair development and cell expansion.

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細胞伸長は、植物の形態を決める重要な要素の一つである。シロイヌナズナの花茎は生殖成長期に急速にまっすぐ伸長する。これは、複数の組織間での協調的な成長に加え、様々な環境刺激に適応した結果である。我々は、花茎の形態が異常な変異体を単離し、これらの分子機構を明らかにしようと考えた。fiz1 (frizzy shoot1)は、花茎や花柄がくねったり、カールしたりする。さらに、黄化芽生えの胚軸伸長、根の伸長、根毛の形成にも異常を示す。これらの表現型は半優性で現れる。我々は、胚軸や根においてfiz1と似た表現型を示すfiz2も単離した。FIZ両遺伝子が様々な器官の細胞伸長に関与していることが明らかになった。ポジショナルクローニングにより、fiz1はACT8に、fiz2はACT2のそれぞれにミスセンス変異が見いだされた。これら細胞伸長にアクチンが深く関与することが明らかとなった。

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微小管はα、β-チューブリンのヘテロダイマーが重合してつくられる。細胞内での微小管重合には微小管の重合核が必要であり、動物では中心体に存在するγ-チューブリン複合体が重合核の役割をしている。一方、高等植物細胞においては、中心体は存在せず、間期の微小管は表層微小管として細胞膜に沿って存在する。演者らはγ-チューブリンが表層微小管の端に存在することを示したが、表層微小管形成に働いていることの証明はできていない。また、植物細胞においてはγ-チューブリンが細胞分裂、細胞伸長に働く実験的証拠はない。本研究では、virus-induced gene silencing によりγ-チューブリンの発現を抑制し、細胞分裂、細胞伸長と微小管構築に対する影響を調べたので報告する。
Nicotiana benthamiana γ-チューブリンmRNA部分配列を持つトマトモザイクウイルスを作成し、N. benthamiana植物体に感染させた。ウイルスは茎頂分裂組織に入れないため植物体は成長を続けたが、新たに展開する葉の表皮細胞の形態異常、気孔の形成阻害、柵状組織の細胞分裂阻害などさまざまな異常が見られた。ウイルスが感染した葉ではγ-チューブリン量は数分の1以下に減少していた。γ-チューブリンmRNA部分配列を持たないウイルスは影響を与えなかった。微小管の観察結果もあわせて報告する予定である。

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　我々はタバコBY2 cDNAを3'-RACE法により増幅し，C末アミノ酸配列の異なる5種のβ-tubulin isotype，NTB 1-5の存在を推定し，それらと細胞周期の関係について調べている。
　今回我々は，これら5種の isotype について，real time RT-PCRにより個々のRNA level を比較，定量した。その結果，NTB1mRNAは全細胞周期を通じて最も多く，NTB2および3は，ほぼ同程度に存在したがNTB2の方が変動の幅が大きかった。NTB1-3に対してNTB4および5は，ずっと低い level で発現していた。全ての isotype ともM期周辺で急激に減少したことから，微小管の分布に激しい変化の起こるこの時期に何らかのmRNA level の調節 mechanism が働いていることが示唆された。
　また，NTB1-3mRNAにおいて，同一isotypeの転写産物でpolyA付着部位の異なるmRNAが存在することが分かったので，それぞれを分別定量した結果，M期周辺で短い3'非翻訳部を持つものが存在することが示唆された。その意義についてはまだ不明であるが，3'非翻訳部には翻訳調節や，RNAの安定性に関する情報などが存在することが知られており興味深い。
　一方，二次元電気泳動による蛋白質の解析からは，少なくとも5つのisoform の spot が確認されているので，現在これら各 spot の同定と修飾の可能性について検討している。

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　フラグモプラストの遠心的発達は、フラグモプラストの中心側での微小管脱重合と、その外側での微小管再重合の繰り返しによると考えられている。しかし、フラグモプラスト微小管の脱重合と再重合を、細胞板形成の進行と調和させる機構は明らかにされていない。これまでに我々は、タバコ培養細胞BY-2において、細胞板でのカロース合成とフラグモプラスト中央部の微小管の脱重合がカフェイン処理により可逆的に阻害されることから、細胞板におけるカロース合成と微小管脱重合が密接な関係を持つことを示唆した。今回は、これらの関係をより詳細に検討する目的で、YFP-α-チューブリン融合蛋白質を発現するBY-2細胞をアニリンブルーにより生染色し、フラグモプラスト微小管の動態と細胞板のカロースの蓄積を同時に連続的に観察することを試みた。細胞板の縁が親細胞壁に到達するまでは、フラグモプラスト微小管の分布域より内側でアニリンブルーの蛍光が強く観察された。一方、細胞板の縁が親細胞壁に到達すると、親細胞壁に近い側からアニリンブルーの蛍光が強くなり、フラグモプラスト微小管の残存する領域でも強いアニリンブルーの蛍光が認められた。この結果は、フラグモプラスト微小管脱重合はカロ一スの蓄積そのものが引き金となって誘導されるのでは無いことを示している。したがって微小管脱重合とカロース合成が同じシグナルにより誘導されている可能性が考えられる。

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We have identified two types of myosins, 170-kDa and 175-kDa myosins, responsible for cytoplasmic streaming in BY-2 cells. On the basis of analysis of primary sequence of each myosin heavy chain gene, these myosins were classified into myosin XI. Localization studies using antibodies against 175-kDa myosin showed that this myosin is accumulated into phragmoplasts. The accumulation depended on actin filaments, because of the suppression by latrunculin B, while brefeldin A did not affect the accumulation, indicating that this phenomenon is not related to the transport of Golgi vesicles. We examined the effects of BDM to further explore the function of 175-kDa myosin in the phragmoplasts. Although the accumulation of this myosin into phragmoplasts was induced even in the presence of 30 mM BDM, the morphology of newly synthesized cell plates was appeared to be aberrant. We will discuss the role of 175-kDa myosin XI in the phragmoplasts.

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Butanedione monoxime (BDM) is well-known inhibitor of actomyosin interaction. However, it was reported that BDM up to 10 mM did not inhibit the cytoplasmic streaming of characean alga, well-known actomyosin driven system in plant (McCurdy, 1999). On the other hand, Tominaga et al. (2000) reported that the motile activity of myosin from lily pollen tube was inhibited when BDM at concentrations higher than 10 mM was applied. We examined if characean cytoplasmic streaming was inhibited by BDM at concentrations higher than 10 mM. It was found that cytoplasmic streaming of characean cells was inhibited by BDM at concentrations higher than 10 mM. This inhibition was reversible. Inhibition of characean actomyosin by BDM was confirmed by in vitro motility assay using crude characean myosin fraction. We concluded that characean actomyosin interaction is sensitive to BDM though its sensitivity is much lower than animal myosin.

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植物細胞の原形質流動は、アクトミオシン系が関与する最も速い運動のひとつである。我々は、この運動に関わる175kDaミオシンをタバコ培養細胞BY-2から単離精製し、分子レベルでの解析を行った。
シークエンス解析の結果、175kDaミオシンはクラスXlに属していた。電子顕微鏡観察から、175kDaミオシンは大きな2つの頭部と、細いストーク、これにつながる球状尾部を持ち、形態的にはmyosin Vに類似していた。このミオシンのactin-activated ATPase活性は最大80 molecules/sec/headであり、myosin Vに比べ非常に高い活性を示した。
光ピンセットによる1分子レベルでの運動解析の結果、175kDaミオシンは35nmステップを刻みながら、アクチンフィラメント上でプロセッシブ（連続的な）運動を行った。この1ステップは、1分子のATP分解に対応していた。1分子での発生張力は、0.5pN（骨格筋ミオシンの1/10）と非常に弱かったが、速度は7μm/secであり既知のプロセッシブモーター中で最速であった。
運動の詳細な解析から、このミオシンの律速はADPの放出であり、myosin Vに比べ放出の速度が速いために高い運動速度を持つことが示唆された。以上の結果から、hand-over-hand model（歩くモデル）に従い、ミオシンの運動機構について議論する。

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　動物細胞においてアポトーシスの調節因子としてBcl-2 ファミリーが知られている。その中のBaxはアポトーシス促進因子である。近年、酵母や植物でもBaxが細胞死を誘引することが報告され、生物種を超えた共通の細胞死機構が存在すると考えられる (Kawai et al., PNAS 2001)。我々はBaxが植物にどのような細胞死を引き起こすかを調べるため、Baxを発現する形質転換シロイヌナズナとミトコンドリアや葉緑体への移行シグナルを有するGFPを発現するシロイヌナズナとの交配種を作出した。これらの植物体はDEX処理によるBax発現後、ミトコンドリア運動性の消失と形態変化、葉緑体からのGFP漏出を引き起こした。その後、液胞が崩壊し、白色化により死に至った。暗所でも明所と同様にオルガネラの変化がみられ細胞死を起こした。また、光合成を行わないシロイヌナズナ培養細胞においてもBax の発現により細胞死が誘発された。これらの結果から、植物におけるBax誘導性細胞死に発達した色素体や光は関与しないが、細胞死の初期における細胞小器官の形態変化が示された。

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シロイヌナズナBax Inhibitor-1(AtBI-1)遺伝子は酵母におけるBax誘導性細胞死を抑制する因子として、酵母を用いたスクリーニングにより単離された。植物細胞内における両因子のクロストークを解析するため、動物のBaxをDEX（dexamethasone）処理によって発現誘導する形質転換シロイヌナズナを作出した。この植物はDEX処理後、細胞の収縮、イオンの漏れ出しを引き起こし、全身が白色化して死に至った。一方、BaxとAtBI-1 両方を有する植物体では細胞死が抑制され、本遺伝子が植物細胞内で機能する事が確認された。Baxは活性酸素を介して細胞死を引き起こす事が既に報告されている。そこで、AtBI-1を過剰発現するタバコ培養細胞（BY-2）を作成し、活性酸素誘導性細胞死に対する応答を調べた。その結果、この細胞は過酸化酸素やサリチル酸により誘引される細胞死に対し抑制効果を示した。また、酵母内でBaxが誘引する細胞死の抑制にはAtBI-1タンパク質のC末側領域が必須であることが明らかとなっているが、本研究により、同領域が植物細胞における細胞死抑制にも重要な役割を果たす事が示唆された。また、GFPを用いた解析により本タンパク質は小胞体膜上に局在化しているものと考えられている。これらの結果は、酸化ストレス抵抗性機構への小胞体膜局在性タンパク質の寄与を新たに示すものである。

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タバコ種間雑種（Nicotiana gossei Domin X N.tabacum L.）の下胚軸に由来する培養細胞（GTH4）は、親植物と同様、37℃で増殖し、26℃で致死する温度依存型細胞死を発現する。細胞死は26℃に移行後6時間以内で急速に進行し、以降は緩慢となる二相型を示し、72時間後でも約20%が生存する。一方、この細胞は嫌気条件で致死が著しく抑制されることから、酸素、特にそれに由来する活性酸素種（ROI）が細胞死に重要な役割を果たすことが示唆された。そこで、GTH4細胞を26℃に移行した後に発生するROIをO₂^-と過酸化水素について定量したところ、O₂^-は2時間後、過酸化水素は30分後をピークに一過的な増減を認めた。26℃の嫌気条件下において、O₂^-は2時間目のピークを示さず暫増し続け、他方、過酸化水素は好気条件よりも有意に低いピークを示した。このことから、 GTH4細胞も、他の細胞で認められるオキシダティブバーストが先行し、致死発現のシグナルとして作用しているものと考えられた。特に、過酸化水素はその増減の挙動と、SOD、catalase、NADPH酸化酵素の阻害剤投与実験などの結果からより重要な役割を果たすと示唆された。

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Nicotiana gossei Domin X N. tabacum L.の雑種致死発現は、発芽後3～4日目の下胚軸基部より始まり、10日目には子葉にまで拡大する。下胚軸基部での細胞死発現の時期を更に詳細に調査したところ、細胞質の部分的崩壊などの細胞形態の異常が発芽直後から開始していた。時間経過とともに下胚軸組織は表皮細胞、皮層細胞の変形が進むことから、細胞内容物の消失が急速に進行するものと考えられた。そこで、細胞死進行過程における細胞内の変化を更に詳細に検討するため、下胚軸由来の培養細胞（GTH4）を用いた。蛍光顕微鏡により、葉緑体、ミトコンドリアが致死条件（26℃）では数時間で消失し始め、細胞内pHの低下した細胞数が増加することが観察された。GTH4細胞は37℃において高い生存率を維持するが、その内部形態は原形質糸により分けられた液胞を内包する複雑な構造を示す。致死条件においた直後、このタイプの細胞の頻度は高いが、やがて複雑な構造ではなく一様な密度の内部構造を示す細胞の頻度が高くなり、最後にはプロトプラストが萎縮して細胞壁より乖離した細胞が最も多くなった。これらの結果は、細胞死の最終的な実行が液胞の崩壊によって起こることを示している。

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During culture, Brassica napus leaf protoplasts become swollen and finally degrade. Both morphological and biochemical approaches revealed that the process through which the death occurred were subjected to apoptotic-like manner. This suggests that the recalcitrance of B. napus leaf protoplasts might be explained by apoptosis. The amounts of hydrogen peroxide and superoxide present in the medium during the isolation of leaf protoplasts from recalcitrant B. napus and regenerating Petunia hybrida were measured. This data showed that both active oxygen species (AOS) accumulated to greater levels in P. hybrida. Addition of radical scavengers to the isolation medium of B. napus protoplasts had no effect on the cell death. This suggests that neither of the two AOS generated during the isolation of leaf protoplasts might be involved in triggering apoptosis in B. napus leaf protoplasts. Intracellular ROS generated during the culture need to be further elucidated.

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サリチル酸(SA)の合成経路には、フェニルアラニンを前駆体とする経路とイソコリスミ酸を前駆体する経路が知られている。我々はタバコ(Nicotiana tabacum cv. SR-1)に、光化学オキシダントの主成分であるオゾン(O₃)を曝露した時に生成するSAが、どちらの経路で合成されるのかについて調べた。播種後30日のタバコに0.2 ppmのオゾンを曝露すると6時間後に急激なSA合成が観察された。曝露6時間後では、同時にフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)の活性とmRNA量、コリスミ酸ムターゼのmRNA量も顕著に増加していた。しかし、イソコリスミ酸合成酵素のmRNA量には増加が見られなかった。この結果、O₃曝露したタバコでは、フェニルアラニンを前駆体としてSA合成が起こることが示唆される。次に、O₃曝露によるSA合成がエチレンによる制御を受けているかについて、O3曝露時のエチレン生成が抑制された組み換え体を用いSA蓄積量やPAL活性を測定したところ、組み換え体では野生型よりSA蓄積量が少なくPAL活性も抑制された。この結果、O₃曝露により誘導されるSAは、エチレンによるPAL活性の上昇によって合成が促進されると考えられる。O₃曝露によるSAの蓄積により細胞死が起こることが知られているため、野生型のタバコではエチレンによりSA合成が促され可視障害が発生すると考えられる。

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トリコテセンは、コムギ赤カビ病菌が産生するマイコトキシンで、麦類への感染過程で病原性因子として作用することが報告されているが、植物細胞におけるその作用についてはほとんど明らかにされていない。動物細胞では、T-2 toxin等のトリコテセンがリボソームにおけるペプチジル基の転移を阻害し、このRibotoxic Stressが引き金となり、JNKやp38MAPKの活性化やアポトーシスを誘導することが知られている。我々は、T-2 toxinがシロイヌナズナの培養細胞における蛋白質合成を阻害し、また、葉に投与した場合には、過敏感反応死のような病斑の形成を伴う細胞死を誘導し、活性酸素の生成、SA及びSAGの蓄積、自家蛍光物質やカロースの蓄積が見られることを明らかにした。一方、シクロヘキミドやアニソマイシンなどの蛋白質合成阻害剤ではこのような細胞死の誘導は見られなかった。さらに、MBPを基質としたゲル内リン酸化法により、T-2 toxinによって、1時間から6時間後に活性化される47及び44kDaMAPKの存在が明らかとなり、特異的な抗体による免疫沈降法によって、ATMPK4及びATMPK6が活性化されることが分かった。また、投与後1日から3日にかけて、PR-1遺伝子及びPDF1.2遺伝子の発現誘導が見られた。さらに、T-2 toxinのderivativeを用いて解析した結果、蛋白質合成阻害能と細胞死の誘導、MAPKの活性化及びPR-1遺伝子の発現誘導に高い相関性が認められた。

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タバコ培養細胞（BY-2）にタンパク質性エリシター（cryptogein）を処理すると、細胞質の凝集、収縮など細胞の形態変化を伴う細胞死が誘導される。この細胞死の初期過程では、Ca²⁺、pH、Cl^-などの一連の特徴的な変化のパターンを示すイオンフラックスが誘導され、続いて活性酸素の発生が誘導される（昨年度本大会）。本研究では、こうした細胞膜上の初期応答反応に続いて誘導される細胞死実行過程の解明を目的として、オルガネラの変化を解析した。細胞死に先立ち、数時間以内にミトコンドリア還元酵素活性がほぼ完全に失活し、ミトコンドリア膜電位の脱分極が誘導された。このミトコンドリアの変化はイオンチャネル阻害剤により完全に抑制された。ミトコンドリア活性低下が細胞死誘導に重要な役割を果たしている可能性がある。また液胞内腔を特異的に蛍光染色して観察したところ、細胞死が誘導された細胞では、液胞構造は崩壊し、蛍光は失われていた。液胞崩壊と細胞死誘導との関連性を調べるため、死細胞を特異的に染色するEvans　blueとともに二重染色して解析したところ、液胞の蛍光消失は、細胞死にわずかに先立つ現象であると考えられた。そこで細胞死過程の連続観察を行ったところ、ダイナミックな形態変化を示す液胞が、細胞質の凝集が誘導される直前に崩壊することが示唆された。エリシター誘導性プログラム細胞死実行過程における液胞の動態変化とその役割について議論する。

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植物病原菌由来のタンパク質性エリシター（cryptogein）は、タバコ培養細胞BY-2に感染シグナル誘導性プログラム細胞死(PCD)を誘導する（門田ら、2002年度本大会）。このPCDは細胞周期依存的であることが明らかとなり、このことを利用して高度に同調的なPCDを誘導する実験系を構築した。本研究では、プロテアーゼに対する各種特異的阻害剤を用いて、こうしたエリシター誘導性PCDの過程にプロテアーゼが関与する可能性を検討した。その結果、AEBSFやTLCKを含む複数の阻害剤がPCDを顕著に抑制した。抑制効果の程度は阻害剤により大きく異なっていた。一方、PCD過程のどの過程にプロテアーゼが関与するのかを調べる目的でエリシター処理前後に阻害剤を投与したときのPCD抑制効果を調べたところ、AEBSFはエリシターシグナル伝達の初期過程に効果を示すことが示唆された。このPCDの過程には、Ca²⁺、pH、Cl^-など一連の特徴的な変化のパターンを示すイオンフラックスの誘導や活性酸素種の発生（郷ら、本大会）、それに引き続いて誘導されるミトコンドリアの活性低下などのオルガネラの変化（中村ら、本大会）が関与すると考えられる。これらの初期応答反応とオルガネラの変化を指標として、PCD過程における各種プロテアーゼの作用点について解析した結果について報告する。

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プログラム細胞死(PCD)は一般的に形態学的変化と生化学的変化に関連するプロセスとして遺伝学的に定義されており、恒常的な組織の維持・発達・防御反応に重要である。これまで動物細胞のアポトーシスは広く研究されているが、植物については幅広い生化学的研究はそれほど報告されていない。PCDは花弁細胞で急速に起こるため、しばしば組織老化を分子レベルで解明するためのモデル系に用いられる。花弁細胞死は酸化酵素により生産される活性酸素種(ROS)の増加と、酸化防御酵素の活性減少による場合がある。また老化過程では種々のプロテアーゼやヌクレアーゼの活性化による核酸と蛋白質の減少が観察されている。本研究では開花から花弁脱離までが比較的長いチューリップをPCD実験のモデル系として選択し、PCD過程で変化する重量・タンパク質・抗酸化系酵素活性・エチレン放出量・DNA断片化・過酸化水素濃度・温度に依存した花弁運動について分析した。花弁の開閉運動は初期には活発であるが、老化中期から運動能力が低下する。同時期にはDNA分解が観察され、同時にDNase活性・プロテアーゼ活性も上昇した。老化終期におけるエチレン放出量の急激な増加は、過酸化水素含量の急激な増加に続いて生じていた。これに並行して抗酸化酵素の一種であるアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)活性の低下が生じていた。チューリップ花弁の老化過程は、動物細胞と同様のPCD過程であると考えられる。

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