We evaluated the effect of

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光合成細菌の光捕穫作用においてカロテノイド(Car)は、光を吸収して光学活性1B_u⁺状態に励起され、一重項エネルギーをバクテリオクロロフィルに伝達する。このエネルギー伝達には、1B_u⁺状態のみならず、より低エネルギーの光学禁制3A_g⁻、1B_u⁻、2A_g⁻状態も関与すること、またこれに競争する内部転換は非常に速く、振動緩和・振動再分配が完了する前に起こることが示唆されている。光合成系には共役二重結合数(n)が9から13の様々なCarが存在しているが、その一重項状態のエネルギーはnの関数に比例して大きく変化し、特に内部転換経路はCarによって大きく異なることが予想されている。このような内部転換・振動緩和・振動再分配が混同した複雑な系では、スペクトル分解能が高く、細かい遷移のエネルギーをスペクトルから直接読み取ることができるKerr-gate時間分解蛍光は非常に強力な測定手段である。そこで今回我々は、光合成細菌に選択されているn = 9 - 12のCar、ヌロスポレン、スフェロイデン、リコペン、アンヒドロロドビブリンについてKerr-gate時間分解蛍光スペクトルを測定し、C=CおよびC-C伸縮振動の2つのモードの振動再分配及び振動緩和を加味し、Franck-Condon因子・振動緩和速度等をパラメータとした内部転換のシミュレーションを行うことによってこの複雑な緩和挙動の解析を試みた。

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Subpicosecond time-resolved absorption spectra were recorded in the visible region for a set of photosynthetic carotenoids (Cars) having different numbers of conjugated double bonds including neurosporene (n=9), spheroidene (n=10), lycopene (n=11). Anhydrorhodovirin (n=12) and spirilloxanthin (n=13). Singular-value decomposition and subsequent global fitting of the spectral data matrices lead us to a branched kinetic model including both (1) singlet internal conversion in the sequence of 11Bu+ * 11Bu- * 21Ag- * 11Ag-(G), and (2) singlet-to-triplet fission of 11Bu- * 13Ag plus 13Bu, and subsequent triplet internal conversion of 13Ag * 13Bu. With the knowledge of the new internal conversion in Cars, it is very crucial to re-examine the energy transfer pathway from Car to bacteriochlorophyll (BChl) proposed previously.

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光合成細菌において、光エネルギーは、周辺アンテナであるLH2複合体

から光反応中心(RC)を囲むように存在するLH1複合体へ、最終的にはRC

に伝達される。RCが電子伝達を行った直後の酸化状態で更に光を受けた

時に生成する有害なバクテリオクロロフィル(BChl)の三重項状態

(T₁)から生体を守るために、RCに結合したカロテノイド

(Car) はT₁ BChlをクエンチする「光保護作用」を行うと

されているが、LH1では、「酸化状態のRC」に伝達する光エネルギーを

制限してT₁ BChlの生成を妨げる形の光保護作用も起り得

ると考えた。そこで我々は、光合成の最小ユニットであるRC-LH1

(Core)複合体に注目し、CarとBChlの励起状態のダイナミクスをLH2と

比較した。Rhodobacter sphaeroides G1Cから植田らの方法で

単離・精製・安定化し(2001年度日本植物生理学会要旨参照)、SDS-

PAGEでペプチド組成を確認したCore複合体のサブピコ秒時間分解吸収ス

ペクトルを測定した結果、LH2と大きく異なり、Carの三重項励起状態が

早くから顕著に現れ、Car→BChlのエネルギー伝達の結果として

現れるQ_yが少ないことが観測された。これは、Carから

BChlへの一重項エネルギー伝達の効率を落とすようにダイナミクスが変

化したと解釈できる。

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我々はLH1アンテナ複合体 (LH1) におけるカロテノイドからバクテリオクロロフィル (BChl) への極短時間領域でのエネルギー伝達に着目した。カロテノイドのないLH1は界面活性剤の存在下でB820、B780サブユニットに解離することが知られている。BChl aの二量体から成るB820はカロテノイドをもたない変異株Rhodospirillum rubrum G9からおだやかに作用する界面活性剤であるβ-OGを用いて単離し、DEAEセルロース陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。このB820サブユニットにカロテノイド (たとえばanhydrorhodovibrin) を結合して、カロテノイドを含むLH1を再構成した。この再構成LH1において、BChlの極大吸収ピーク (Q_y) は大きく長波長シフトし、野生株のLH1と同じ880 nmとなった。今後、様々なカロテノイドを再構成したLH1の蛍光、およびフェムト秒時間分解吸収スペクトルを測定し、励起エネルギー伝達についても報告する予定である。

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　緑色硫黄細菌Chlorobium tepidumのアンテナ複合体「クロロゾーム」は、光エネルギーを捉えて、光反応中心に一重項エネルギーを伝達している。クロロゾームの光保護作用と励起状態のダイナミクスを解明するために、サブピコ秒～ミリ秒の時間領域でポンププローブ時間分解吸収分光を用いて測定を行った。
　∼400 nm, 0.12 psのパルスを用いたサブピコ秒～ナノ秒の時間領域での実験では、一重項－一重項消滅反応と同時に一重項分裂反応や三重項－三重項消滅反応といった二分子反応が観測された。また、355 nm, 12 nsのパルスを用いたサブマイクロ秒～ミリ秒の時間領域での実験では、piggy-back dimerへのクロロゾームの解離が各励起状態反応の後に起こり、クロロゾームの構造は∼20 ms以内に再構築されることが分かった。クロロゾームの二次元的なシリンダー状の会合構造が、一重項－一重項消滅反応の後に起こるSoretやQ_y状態からの初期の誘導放出あるいは一重項分裂反応や三重項－三重項消滅反応の後に起こるQ_y状態からのその後の誘導放出のどちらかを通して効率的な放射エネルギー散逸を促進している。また、内部転換過程によって生成する余剰の熱エネルギーは、クロロゾーム特有の会合構造による効率的な光捕獲作用の瞬間的な停止が引き金になっているようである。

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Rhodobacter2種, Rubrivivax から全てのカロテノイド合成遺伝子が単離され，また酵素の性質が調べられている．カロテノイドの化学構造を考え合わせると紅色細菌（既知100種以上）の生合成経路が判明してきたので考察した． 1）標準型スピリロキサンチン経路：CrtI, CrtC, CrtD, CrtF：最終産物はスピリロキサンチン：基本となる生合成経路で約半数の紅色細菌が該当．2）スフェロイデン経路：CrtIの性質の変化, CrtC, CrtD, CrtF, CrtA獲得：スフェロイデン，スフェロイデノン：Rhodobacter など5属．3）変化型スピリロキサンチン経路：CrtI, CrtC, CrtD, CrtFの内一つ以上の酵素の活性の低下あるいは基質特異性の変化：ロドピンなどの蓄積：約1/3の種．4）カロテナール経路：CrtI, CrtC, CrtD欠損, CrtF一部の種は欠損，メチル基をアルデヒド基に酸化する酵素の獲得：ロドピナールなど：7種のみ．5）オケノン経路：CrtI, CrtC, CrtD欠損, CrtF, CrtA-like・CrtY-like・CrtU-like獲得：オケノン：11種のみ．　一部の種の特殊なカロテノイドは生合成経路が不明であり，またいくつかの種はカロテノイドの同定が不十分で解析できない．
生理活性脂質データベース http://lipid.bio.m.u-tokyo.ac.jp

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バクテリオクロロフィル合成系で、ポルフィリン環の環ΙΙを飽和化する酵素遺伝子は3つの遺伝子bchX、bchY、bchZからなると考えられている。BchXのアミノ酸配列は、ポルフィリン環の環IVを飽和化する酵素のBchLサブユニットに類似し、BchY、BchZはそれぞれ同酵素のBchN、BchBに類似する。BchL、N、Bは複合体として機能することが示されているが、BchX、Y、Zに関しては報告がない。本研究では、紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusを用いてbchX、Y、Zそれぞれを欠損させた変異株を作成し、蓄積色素の分析を行った。bchX、Y、Z欠損株はいずれも光合成で成育せず、また蓄積色素はBacteriochlorophyll aとは異なる吸収スペクトルを示したことから、BchX、Y、Zの酵素としての機能はBchL、N、Bで代替できないと考えられた。蓄積色素のHPLC解析では、Bacteriochlorophyll aよりも親水性の高い色素が検出され、MALDI-TOF解析では、環ΙΙが飽和化されていないChlorophyllide aと3-Devinyl-3-hydroxyethyl chlorophyllide aを骨格とする化合物が検出された。BchX、Y、Zによる環ΙΙの飽和化に前後して環Ιに水酸基を付加する反応が知られるが、bchX、Y、Z欠損株でChlorophyllide aに由来する化合物が有意な量検出されたことから、バクテリオクロロフィル合成において、BchX、Y、ZによるChlorophyllide aの飽和化反応が、水酸化反応に先行する可能性が考えられた。

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クロロフィル（Chl）aは、クロロフィリド（Chlide）aに長鎖アルコールが付加して合成される。一方、バクテリオクロロフィル（BChl）aはChlide aからさらに数段階の酵素反応を経て合成されたバクテリオクロロフィリドaに長鎖アルコールが付加し合成される。我々は、Chlide aからのBChl a合成に必要な酵素の1つである3-ビニルバクテリオクロロフィリドヒドラターゼの遺伝子bchFを紅色細菌Rhodobacter capsulatusから単離後、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803の染色体DNAに挿入した株（bchF導入株）を作製した（2002年度植物学会、京都）。アセトン:メタノール(7:3、v/v)による色素抽出物をHPLC分析したところ、bchF導入株では、野生株にはみられない極性の高い4つのクロロフィル誘導体が微量検出された。FAB-MS分析より、これらは同じ化学組成であることが示唆された。吸収スペクトルより、4つの色素は3-ヒドロキシエチルクロロフィリドaおよびその立体異性体であると推定される。現在、これらの色素の同定と、細胞内での局在性について検討中である。

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　光非依存型プロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素（DPOR）は、暗所でのクロロフィル合成を決定づける重要な反応を触媒する。先の研究で、紅色非硫黄細菌 Rhodobacter capsulatusを活用したDPORの各コンポーネント（BchLとBchNB）の精製と再構成系を報告した。今回、より多量のDPORコンポーネントの発現と精製を目指して、広宿主域ベクターpJRD215を利用した発現系の構築を行うとともに、これらを活用した各コンポーネントの活性を評価する系を確立した。pJRD215にpuc promoter断片を導入し、その下流にS-tagを付加したbchLを挿入したpYCL10と、同様にS-tag-bchNとbchBを一連のオペロンとして挿入したpYCNB111を構築し、puc promoterの発現が野生株より数倍高い変異株DB18に導入した。これらの形質転換株の粗抽出液を用いることにより、各コンポーネントの活性を安定に評価することが可能となった。また、pYCNB111を有する形質転換体は、バクテリオクロロフィル含量が低下しPchlideの蓄積が認められた。この細胞から精製したBchNBは緑色を呈しており、吸収スペクトルからPchlideを結合していることが判った。この性質は、DPOR複合体においてBchNBが基質結合・触媒部位を供していることを示唆している。

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Chloroflexus aurantiacusより単離したクロロソームのバクテリオクロロフィルc（Bchl c) とBchl a 蛍光の酸化還元状態による2段階蛍光消光過程を蛍光スペクトルとピコ秒蛍光寿命の測定で解析した。Bchl cの750nm蛍光強度は空気酸化で1/5に減少し、さらにフェリシアナイド酸化により1／5に減少した。後者は410mVのEmを示した。このとき24、480ps の750nmBchl蛍光寿命は各々9.1, 227psになり、Bchl c集団内に消光物質が出来ることを示唆した。このような消光過程は緑色細菌クロロビウムでの結果(1-3)とは異なり、棲息環境の違いを反映した適応と考えられる。1) N V Karapetyan et al. (1980) BBA 593: 254-260.2) J Wang et al. (1990) BBA1015: 457-463. 3) Frigaard et al.(1998) Photosynth.Res 58: 81-90

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　Rhodovulum sulfidophilumは、反応中心結合チトクロムが3ヘムであり、一般の4ヘムとは大きく異なる特徴がある。欠失したヘムは、4ヘムチトクロムでは可溶性電子伝達体からの電子受容部位であり、電子受容機構が異なることが予想される。本研究では、その電子伝達体について調べた。
　これまでの研究で、分子量が30kDa付近の可溶性チトクロムc-549が主要な電子伝達体であることが示唆されていたが、そのチトクロムは培養後期のみに多く出現した。また、SDS-PAGEの泳動パターンから、近縁種における膜結合性電子伝達体チトクロムc_yと共通点があることから、チトクロムc-549は本来膜結合性の電子伝達体であるものが、膜部分のペプチドから切断されて可溶性となった可能性が考えられた。膜結合性の電子伝達成分が実際に機能しているかを検討するため、スフェロプラストから可溶性成分のない膜標品を調製し、閃光照射実験を行ったところ、反応中心結合チトクロムの再還元が観察され、この菌には膜結合性の電子伝達体が存在し、チトクロムbc₁複合体から反応中心結合チトクロムへの主要な電子伝達体として機能していると考えられた。これまで、そのような膜結合性の電子伝達体は、反応中心結合チトクロムを持たない紅色細菌でのみ観察されていたが、本研究により反応中心結合チトクロムを持つ菌にも存在することが示唆された。

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クロロゾームを持たない緑色糸状細菌としてはじめて単離されたRoseiflexus castenholziiは、光合成反応中心複合体の構造と機能について、Chloroflexus aurantiacusと高い類似性がある。緑色糸状細菌における反応中心への電子伝達経路は、銅タンパク質であるオーラシアニンが反応中心への電子供与体であることが示唆されている点を除いて、ほとんど解明されていない。R. castenholziiは、バクテリオクロロフィルcを持たず、紅色細菌と同様に電子伝達系の分光学的測定が容易であることから、本研究では、光合成反応中心への電子伝達経路を明らかにするために閃光照射実験を行った。
膜標品に閃光照射すると、光酸化したチトクロムの再還元が認められ、膜結合型の成分がチトクロムを還元していることが示唆された。単離したオーラシアニンでも再還元がみられたことから、この成分はオーラシアニンであると考えられた。また、電子伝達阻害剤HQNOを添加して閃光照射すると、チトクロムの再還元速度が低下した。このことから、膜におけるキノール・オーラシアニン酸化還元酵素の存在が示唆された。以上の結果から、R. castenholziiにおける反応中心への電子伝達には、オーラシアニンと紅色細菌のチトクロムbc1複合体に対応するキノール・オーラシアニン酸化還元酵素が関与すると考えられた。

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光合成生物におけるカロテノイドの役割の1つに光酸化障害から細胞を保護する機能がある。カロテノイドには多くの分子種が存在するが、生体内における分子構造と障害防止機能の関係は不明な点が多い。本研究では多くのカロテノイド分子種を持つ紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusを用いて特定のカロテノイドを蓄積する変異株を作成することで、同一生体内でのカロテノイド分子種の障害防止機能の比較を行った。強光、好気条件下における成育測定、およびに、ローズベンガルによって一重項酸素を発生させた条件下での生存率測定の結果、共役二重結合の数（n）が9のニューロスポレンと10のスフェロイデンの障害防止機能は低いことが示された。また、リコペン（n=11）とスピリロキサンチン（n=13）は、生育においては高い障害防止機能を持つが、一重項酸素の消去能力はあまり高くないことが示された。2つの測定において、最も高い障害防止機能を示したのは、ケト化カロテノイドであるジケトスピリロキサンチン（n=13+2）とスフェロイデノン（n=10+1）であった。スフェロイデノンとリコペンの比較から、ケト化カロテノイドが高い一重項酸素消去機能を示す原因は、共役二重結合の数によるものではなく、ケト基の存在にあることが示唆された。

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　ヘリオバクテリアの光化学反応中心は、シアノバクテリアや高等植物の系I型反応中心と同じFe-Sタイプである。この光合成細菌はグラム陽性であり、集光性タンパクやアンテナ色素会合体をもたない。反応中心コアタンパクはホモダイマー構造と推測されているが、含まれる電子伝達成分やそれらの分子内配置・配向性は系I型と同じであることが期待される。我々は昨年の本大会において、好熱性のHeliobacterium modesticaldumから異なる可溶化方法により得た2種類の反応中心標品の分光学的特性について報告した。しかしいずれの標品においても二次電子受容体であるキノンの存在を示唆するデーターは得られなかった。また低温閃光照射においては、t_1/2 = 2 msで再還元されるP798⁺が観測され、Fe-Sからの電荷再結合に帰因すると考えられた。このことを確認するために膜標品を調製し、ESRによるFe-Sセンターの観測を行うことにした。ジチオナイトの添加により、比較的ブロードなFe-Sセンターのシグナルが観測されたが、このシグナルは低温照射（77K）において還元されてくる成分と同一であった。このことは、膜結合型のFe-Sタンパク質が反応中心内に存在していることを示している。また観測されたシグナルは2成分から構成され、温度依存性が異なっていた。現在、このシグナルについて詳細に解析中である。

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Heliobacterium modesticaldum 膜標品中のI型反応中心の示すX-band( 9 GHz)のESRスペクトル及びそのkineticsを測定した。植物の光化学系Iの反応中心クロロフィルP700^＋、受容体キノンA₁^－はそれぞれg=2領域に8-10 Gの線幅を持つブロードなESR信号として定常状態では観測される。しかし光照射直後短時間のESR信号はラジカル対（P700^＋A₁^－）がスピン相互作用することによって低磁場側よりA/E/A（E:放射,A:吸収）の特徴的なスピン分極スペクトルを示す。今回へリオバクテリアでP800^＋のtransient ESR 測定を行ったところP700^＋と同様なスピン分極スペクトルは観測されたがP700^＋A₁SUP>－と異なるE/A/Eのスペクトルを示すことが分かった。更に、ジチオナイト付加、11.5Kで測定を行ったところflash後10μsの短時間領域に500 Gの広範囲にわたってのスピン相互作用スペクトルが観測できた。スペクトル線形から、このスペクトルがFx由来であることが強く示唆される。これまで100 G以上にわたる広範囲でのESRスピン分極信号の測定は例がなく現在計算解析を行っている。

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Heliobacteriaは1980年代に発見されたバクテリオクロロフィルgを持つ光合成細菌で、その反応中心（RC）コアポリペプチドは緑色硫黄細菌RCやPSIのものと相同性が高い。そのRCは、フェレドキシン(Fd)を直接還元できるものと予想されているが、生化学的証明は未だなされていなかった。われわれはH. mobilisから2種の4Fe-4S型Fd（FdA, FdB）を精製し、N末端アミノ酸配列を決定し、また、それら遺伝子の塩基配列を決定した。酸素に対する感受性は、FdAは低く、そのA₃₈₅は空気中4^oCで20時間後にも殆ど変化しなかったが、FdBは感受性が高く、同じ条件下で約2時間で半分に低下した。2つのFdの遺伝子は染色体上に隣接して存在していた。2つのFdの推定アミノ酸配列はかなり異なっており、FdAはClostridiumのものと、FdBはproteobacteriaのものと相似性が高かった。FdA、Bは、緑色硫黄細菌Chlorobium tepidumのRC、ホウレンソウFNR存在下にNADP⁺を還元したが、その活性はC. tepidumのFdと比較してそれぞれ約60％、30％程度と低かった。H. mobilisの膜画分から界面活性剤によってRCを抽出し、ショ糖密度勾配超遠心、陰イオンクロマトグラフィーにより部分精製標品を得た。RC標品とFdはホウレンソウFNRの存在下に、NADP⁺を光還元活性を示した。

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酸性グリセロ脂質であるスルフォキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）は光合成生物のチラコイド膜に存在する。我々はラン藻Synechocystis PCC6803においてSQDG合成欠損株を作製し、その性質を野生株と比較することにより光合成におけるSQDGの役割を解析している。これまでにSQDGがPCC6803の生育に必須で、光合成能の維持に必要であることを明らかにしてきた。今回、SQDGが光合成過程の中でも特に光化学系IIの正常な特性の維持に重要な機能を担っていることが明らかとなった。一方、Synechococcus PCC7942でもSQDG欠損変異株を構築したが、この変異株は生育にSQDGの供給を必要とせず、通常のPSII活性を示した。この結果はGülerら（J.Biol.Chem. 271, 7501, 1996）のPCC7942のSQDG欠損株に関する報告と一致する。すなわち、PCC6803とPCC7942でPSII活性や生育におけるSQDG要求性に差異が存在することが明らかとなった。この事実はPSII複合体とSQDGの分子間相互作用の解析の糸口をもたらすとともに、機能タンパク質の進化の上でも注目すべき点と思われる。

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　哺乳類のグルタミン酸作動性シナプスのグルタミン酸・グルタミン回路では、グルタミン輸送担体が重要な役割を担う。しかし、グルタミン輸送能が選択的に高いアミノ酸輸送担体は、植物では発見されていない。演者らは、イネにおける窒素代謝系遺伝子群のグルタミンを介した発現制御機構を解析することを目的として、イネよりラット神経細胞グルタミン輸送担体(rGlnT/rATA1)ホモログ遺伝子を単離した。
　rGlnT (rATA1)の推定アミノ酸配列をもとにイネESTデータバンクを探索した結果、有意な相同性を有するカルス部分cDNA (C10038)を見いだした。同遺伝子(OsGlnT)の完全長cDNAは、イネ根より5', 3'-RACE法にて単離した。また、OsGlnT遺伝子はゲノムDNAからPCR法にて単離した。OsGlnT遺伝子の約3.1kbの転写領域は、5個のイントロンにより分断された6個のエキソンから成り、11個の推定膜貫通領域を有する分子量50kDaのポリペプチドをコードしていた。OsGlnTは、アミノ酸配列レベルで哺乳類グルタミン輸送担体群(ATAs, SNs)と53- 60％の相同性を有した。系統樹解析の結果では、OsGlnTは、既法の高等植物アミノ酸輸送担体群とは分類が明確に異なり、哺乳類グルタミン輸送担体群とクラスターを形成した。また、OsGlnT転写産物は、イネの根及び葉身において、ほぼ恒常的に発現蓄積していた。現在、OsGlnT遺伝子のさらに詳細な発現特性の解析を行うとともに、同遺伝子産物の機能を検証している。

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アンモニウムトランスポーター（AMT）は、NH₄⁺の能動的な膜輸送を行なう担体である。シロイヌナズナ、トマト、イネなどで単離された AMT1に関する研究は進んでいるが、AMT1とは異なるAMT2が2000年にシロイヌナズナから単離された。EST検索の結果、イネにおいてもAMT2ホモログ遺伝子が存在していたことから、本研究ではイネにおけるAMT2遺伝子群の探索と発現様式の解析を行なうことを目的とした。
ESTとゲノムの塩基配列を元にRACE法およびPCR法により、完全長の翻訳領域を含む2つのcDNAクローン（OsAMT2;1、OsAMT3;1）を得た。OsAMT2;1は酵母AMT欠損変異体の機能を相補することができたことから、OsAMT2;1はNH₄⁺輸送能を有することが示された。また、OsAMT2;1とOsAMT3;1の推定アミノ酸配列を用い、イネゲノム配列に対して相同性検索を行なった結果、新たに5つのホモログ遺伝子を見出した。これらは系統樹解析の結果、3つのクラスターに分類された（OsAMT2;1-2;3、OsAMT3;1-3;3、OsAMT4;1）。OsAMT2群とOsAMT3群は、推定アミノ酸配列でAtAMT2に対してそれぞれ85%、84%という高い相同性を示した。RT-PCR解析の結果、これらの遺伝子はOsAMT4;1を除いて根および葉身においてmRNAが検出された。AMT2;2 mRNA量は、根においてNH₄⁺Cl供給にともなって0.5時間後から増大していた。AMT3;3 mRNA量は、葉身の老化に伴い増大していた。現在、これらのホモログ遺伝子について詳細な発現解析を行なっている。

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　ラン藻Synechococcus sp. PCC7942 の硝酸イオン/亜硝酸イオン能動輸送体（NRT）の活性は、培地へのアンモニアの添加により可逆的に阻害される。このラン藻のNRTは、ABC型の輸送体であるが、ATP結合サブユニットのひとつであるNrtCが他の同族輸送体に例のないC末端側ドメイン（R ドメイン）を持っている。R ドメイン はNRTの活性には必須ではないが、アンモニアによるNRTの活性阻害に関与していることが明らかにされている。しかし、どのような分子機構によりR ドメイン がNRTの活性を制御しているかは解明されていない。我々は、R ドメイン がNRTの基質結合タンパク質であるNrtAと30％の同一性を持つことに着目して、大腸菌に大量発現させたR ドメインの生化学的性質を調べることにした。近年ラン藻において細胞内の窒素栄養状態を検知するシグナルとして2-オキソグルタル酸（2-OG）の役割が明らかにされつつあるので、R ドメイン と2-OG の結合について調べた結果、R ドメインが2-OG と特異的に結合すること（Kd =190μM）が明らかになった。次にSynechococcus sp. PCC7942の細胞内2-OG濃度を測定したところ、硝酸イオンまたは亜硝酸イオンを窒素源にしている場合には約150μMであり、アンモニア添加後その濃度は急速に低下（約10μM）した。以上の結果から、R ドメインは2-OGと結合、解離することによりNRTの活性を制御していると推定した。

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硝酸イオン能動輸送体(NRT)は硝酸同化経路の最初の段階に位置しており、植物ではNRT1とNRT2の2種が知られている。NRT1はペプチドトランスポーターファミリーに分類され高等植物でのみ見つかっているのに対し、NRT2は原核・真核生物を問わず広く分布している。我々は相同組み換えによる遺伝子機能解析が容易に行えるセン類のヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)を材料としてNRT2の構造と機能を解析することを目的とし、cDNAクローニングを行った。まずヒメツリガネゴケのNRT2ホモログをRT-PCRやcDNAライブラリからのスクリーニングによって探したところ、NRT2;1からNRT2;5の5つが見つかった。これらの推定アミノ酸配列を分子系統樹に当てはめたところ、全てがセン類の系統学的な位置と同じく緑藻と維管束植物の間にあり、しかも維管束植物のNRT2に比較的高い同一性を示した。また植物で硝酸イオン輸送活性の制御に関わると推定されているC末端領域のセリン残基とその周辺の構造も保存されており、実際に硝酸イオンの取り込み活性がアンモニアによって阻害されることが確認された。さらにNRT2mRNA発現は高等植物の場合と同様に硝酸によって誘導された。以上の結果からヒメツリガネゴケは植物のNRT2の遺伝子発現と活性調節の研究の良いモデル系となることが確認された。

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　活性窒素代謝は NO シグナリングの制御のみならず，活性窒素毒性からの防御の面でも重要であると考えられるが，その植物生化学的・分子生物学的知見はほとんどない。活性窒素の細胞毒性は強力な酸化剤・ニトロ化剤であるペルオキシナイトライトの生成によると考えられる。過酸化物を還元するペルオキシダーゼであるアラビドプシスの 2-Cys ペルオキシレドキシン (2CPRX) の精製組換えタンパク質が，ペルオキシナイトライトを効率的に消去することを示した。アラビドプシスの 2CPRX は，酵母 2CPRX 欠損株の活性窒素や活性酸素に対する過感受性を相補した。これは高等真核生物の 2CPRX が RNS 毒性の防御に働くことを in vivo で示した最初の事例である。本結果は、活性窒素耐性因子としての植物 2CPRX の新規機能を証明するとともに，植物における活性窒素代謝酵素系の存在を支持するものである。
(Sakamoto et al. Plant J., in press)

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　植物は大気中の二酸化窒素を気孔から取り込み、アミノ酸にまで代謝することが知られているが、一方で二酸化窒素は植物にとって有毒であるとも言われている。我々はこれまでに、植物葉内に取り込まれた二酸化窒素由来の窒素の約1/3は未知窒素（UN）化合物に変わることを見いだしており、UNの少なくとも一部は植物にとって有毒であるという結果を得ている。また、二酸化窒素がどのような形で植物葉内に取り込まれるかは明らかにされておらず、二酸化窒素が植物体内でどのように代謝されるのかについては未だ不明な点が多い。
本研究ではNicotiana plumbaginifoliaの野生株と硝酸還元酵素欠損株（E-23株）を用い、大気に添加した二酸化窒素を唯一の窒素源として生育させた。4 ppmの二酸化窒素で3～6週間暴露を行ったところ、根から9.46 mMのコハク酸アンモニウムを与えた場合とほぼ同程度（草丈で約3～4倍）生育し、植物は大気中の二酸化窒素を唯一の窒素肥料として生育しうることが示された。また、Kjeldah法による解析を行ったところ、取り込んだ二酸化窒素は還元態窒素にまで代謝されていることが確認できた。無機窒素量、未知窒素化合物量の測定結果と合わせて報告する。

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植物は二酸化窒素（NO₂）を吸収し、アミノ有機化することが知られているが、我々は、取り込まれた約30%のNO₂由来の窒素は還元態窒素（ケールダール窒素）および無機窒素でもない未知の窒素化合物になることを明らかにしている。この未知窒素化合物の候補のひとつにニトロ化合物がある。NO₂はオゾンまたは酸素存在化では、極めて反応性に富み、脂肪族、芳香族炭素化合物をニトロ化することが知られている。そこで、本研究では抗ニトロチロシン抗体を用いてNO₂暴露した植物葉中のニトロチロシンについて調査を行った。
　タバコ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）を4 ppm NO₂で8時間暴露し、植物葉から粗抽出液を調整し、SDS PAGE あるいは2-D PAGEで分離した。抗ニトロチロシン抗体を用いてウェスタンブロット法によりチロシンがニトロ化されているタンパク質を調べた。その結果、抗ニトロチロシン抗体と反応する数個のタンパク質を検出した。それらのタンパク質スポットの同定を行ったところ、PR (pathogenesis-related) タンパク質であることを明らかにしている。さらに調査を行ったところ、新たに抗ニトロチロシン抗体と反応する数個のスポットを検出した。現在、それらのタンパク質のニトロ化部位の質量分析による解析を行っている。

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無機窒素源の吸収は植物体の要求に応じて厳密に制御されている。窒素源の取込・同化・移行という植物体全体における窒素吸収活性（以下吸収活性）は生育環境における窒素や光合成活性の変化に対応すると考えられる。PETIS (Positron Tracer Emitting Imaging System)は短寿命の放射性同位体を植物に与え、その吸収、移行をリアルタイムで計測できる。通常大気で生育したイネ（36Pa）と高CO2環境下で生育したイネ（110Pa）において、13NH4+を水耕培地に投与し、地上部に輸送されてくる13Nシグナルを検出しNH4+吸収活性を測定した。この結果、窒素源を含む水耕液中では、NH4+吸収活性は36Paより110Paの方が乾物重当たりにおいても高かった。3日間の窒素飢餓処理後におけるNH4+吸収活性は、両者とも窒素源を含む水耕液における活性より上昇した。その後同一個体を用いて2 mMの窒素源で2時間処理した場合のNH4+吸収活性を測定した結果、窒素飢餓処理後の活性と比較して36Paでは低下し、110Paは顕著に上昇した。同様に窒素飢餓処理後2 mMグルタミンで2時間処理した場合におけるNH4+吸収活性は、前述の窒素源処理とは全く逆の結果となり、36Paでは顕著に上昇し110Paでは低下した。NH4+吸収活性制御への窒素環境の変化と高CO2の影響を報告する。

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非共生型ヘモグロビンは、植物に広く存在することが知られている。しかしその機能については、低酸素耐性との関連が示唆されている以外はほとんど明らかになっていない。本研究では、非共生型ヘモグロビンの硝酸同化における機能を解明するため、非共生型ヘモグロビン遺伝子の誘導に対する培地の無機窒素化合物の影響について検討した。
イネ懸濁培養細胞に硝酸、亜硝酸および一酸化窒素発剤であるS-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) を処理した後にmRNAを抽出し、RT-PCRにより非共生型ヘモグロビン遺伝子の発現を解析した。イネにはORYsaGLB1aおよびORYsaGLB1bの2つの非共生型ヘモグロビン遺伝子があるが、イネ懸濁培養細胞においてこの2つのヘモグロビン遺伝子の発現は、培地の硝酸により誘導された。また、ORYsaGLB1aおよびORYsaGLB1b遺伝子の発現は、培地への亜硝酸およびSNAPの添加によっても誘導され、その発現は硝酸による誘導と比較して短時間で起こることが明らかになった。イネ懸濁培養細胞においては、ORYsaGLB1aとORYsaGLB1b遺伝子の発現パターンにはどの窒素化合物処理においても大きな差は見られなかった。これらのことより、イネ懸濁培養細胞において非共生型ヘモグロビン遺伝子は、培地の硝酸、亜硝酸および一酸化窒素により誘導されることが明らかになった。

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SNAREタンパク質群は分泌タンパク質輸送において重要な役割を担っており、細胞小器官の膜上に異なるt-SNAREが局在し輸送小胞に局在するv-SNAREが特異的に結合することによってタンパク質を目的の場所へ輸送するのに必要と考えられている。
根粒菌はマメ科植物と共生することで根粒を形成し窒素固定を行う。この根粒形成において新しい感染領域特異的細胞が作り出される。我々はこれら細胞分化形成過程に必要となるSNAREタンパク質を検索することを試みた。まず分裂酵母で知られている様々なSNARE遺伝子のアミノ酸配列をカズサDNA研究所のミヤコグサESTクローンと相同性検索を行った。その結果12種類の遺伝子が酵母のSNARE遺伝子高い相同性を示した。この12種類の遺伝子の一部をプローブにしてノーザンブロットを行った結果、2つの遺伝子(Sn6, GEN03)が根粒で強い発現を示した。この2つの遺伝子は互いに95％以上の相同性を示し、酵母のSed5タンパク質と相同性が高かった。In situ ハイブリダイゼーションの結果、非感染細胞で強い発現を示した。このタンパク質がなぜ非感染細胞で発現しているのか疑問であり、根粒形成で強い発現を示す非感染細胞に局在する2つの遺伝子について今後さらに検討していかなければならない。

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cDNA macroarray systems were applied to compare the gene expression profile of Fix^- mutant Ljsym75 nodules with that of wild-type Gifu nodules in order to reveal host plant genes related to nitrogen fixation. In total 18,432 non-redundant clones, expressions of 56 genes were reduced and 45 genes were enhanced in sym75 nodules significantly compared with those in Gifu nodules. These results were mostly confirmed by northern blot analysis. Genes of which expression was lower in sym75 nodules were represented by nodulins such as leghemoglobin and Nlj21, enzymes involved in carbon and nitrogen metabolism such as sucrose synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase and asparagine synthetase, membrane transport proteins such as aquaporin, pathogenesis-related proteins, and enzymes involved in phytohormone metabolism. On the contrary, enzymes concerning with senescence such as cysteine proteinase and metal binding proteins such as metallothionein were included in those of which expression was higher in sym75 nodules.

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　日本型イネNipponbare及びインド型イネKasalathに由来する98系統のBILsを用いた解析より、第二染色体上のマーカーC777近傍に主稈の穂重量を規定しているQTL (Pnw1) が統計学的に検出された。Pnw1はKasalathの対立遺伝子が穂重を増加させる効果があることが判明した。Pnw1を含む約50cMの領域のみがKasalath由来の染色体に置換された系統C-22を選抜し、ガラス室内にて基肥窒素処理を行い育成した。遺伝背景であるKoshihikariに比較して、C-22の個体あたりの穂重及び穂数は最大で約30%増加していた。これより、Pnw1がKasalath由来の染色体に置換された領域に存在することが確認された。本研究ではPnw1遺伝子の同定を目的として、高密度連鎖地図の作製並びに詳細な連鎖解析を行った。
　Pnw1近傍がヘテロ接合体である系統の自殖後代200個体を用いて、新たに約20個のマーカーを設定し、連鎖地図を作製した。また、その自殖後代3385個体より、マーカーC777とC10005間の組み換え個体177個体を選抜した。それらの組み換え個体を野外にて土耕法により育成し、完熟期に穂数並びに穂重の測定を行った。現在、組み換え個体の遺伝子型を決定するとともに、詳細な連鎖解析を行っている。

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陰生植物の葉は，陽生植物の葉と比べ低い呼吸速度を示し，光の制限される林床でも正の炭素バランスを維持するのに役立っている．さらに陰生植物クワズイモの葉では，ATP合成とは共役しないシアン耐性呼吸経路（alternative oxidase: AOX）がほとんど働いておらず，エネルギー的に効率よい呼吸系が実現されている．本研究では，陰生植物の葉におけるAOXの制御機構とその役割を調べるために，単離ミトコンドリアを用いて詳細な生化学的解析を行った．その結果，クワズイモの葉のAOX活性が低いのはAOX量が少ないためではなかった．クワズイモの葉のAOXは活性化を受けると高い酸素消費活性を示した．通常の光環境条件ではクワズイモの葉のAOXの酸化還元状態は不活性化状態（酸化状態）になっていたが，光阻害を引き起こす強い光条件でクワズイモを栽培すると，AOXは活性化状態（還元状態）になり，in vivoでは高い酸素消費活性を示すと考えられる．陰生植物は通常林床などの薄暗い環境に生育しているが，林冠木の倒壊などにより非常に強い光にさらされることがある．そのようなとき呼吸系全体が還元状態になり，活性酸素の生じやすい不安定な状態に変化すると考えられる．活性化されたAOXは呼吸系の安定化に働いていると思われる．

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RNA editing in plant mitochondria alters several hundred C nucleotides to U residues in coding regions of mRNAs. To analyze the biochemical and the specificity parameters of RNA editing in plant mitochondria we have developed a novel in vitro system. The high sensitivity of the mismatch-specific endonuclease thymine glycosylase is employed to allow quantitative evaluation of the in vitro RNA editing products. A pea mitochondrial lysate correctly edits a specific site in the cognate atp9 template. In this contribution we will present the latest results on the biochemical parameters of in vitro RNA editing and of the investigation of the cis-requirements defining an editing site.

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シロイヌナズナDREB1は乾燥・塩・低温応答性シスエレメントであるDREに結合し、ストレス耐性に寄与する多様な遺伝子群の発現を誘導する転写活性化因子である。DREB1遺伝子ファミリーであるDREB1A, 1B, 1C はいずれも低温により迅速に応答し、これらのプロモーターには少なくとも6種の配列が共通に保存されている。形質転換植物を用いてDREB1Cプロモーターを詳細に解析した結果、-113～-47の67bpが低温応答に必要十分な領域であることを明らかにした。この67bp内には3種のDREB1プロモーターの共通配列であるG-box配列を含むBox-VおよびBox-VIが存在していた。さらに、本領域をプローブとしてゲルシフト解析を行ったところ、無処理または低温処理したシロイヌナズナから抽出した核タンパク質と複合体を形成した。そこで、酵母one-hybrid系を用いて、タンデムにリピートさせた67bp領域と相互作用する因子をシロイヌナズナの無処理cDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行っており、それらの結果と合わせて報告する。

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シロイヌナズナのDREB2Aタンパク質は、乾燥、塩ストレス応答性の遺伝子発現に関与する転写因子であり、ストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域に存在するDRE/CRT配列に特異的に結合する。しかしながら、DREB2Aをシロイヌナズナで過剰発現させても、ターゲットと予想される遺伝子の発現はほとんど変化しない。従ってDREB2Aタンパク質の活性化には、リン酸化のような翻訳後の修飾が必要とされると考えられる。我々はDREB2Aの活性化メカニズムを解明するために、シロイヌナズナT87培養細胞のプロトプラストを用いたトランスアクティベーション実験により、DREB2Aタンパク質の各領域の機能解析を詳細に行い、転写活性化ドメインはアミノ酸253-335の領域に存在すること、DREB2Aタンパク質のアミノ酸135-165や318-335の領域を削除するとレポーター遺伝子の活性が向上することを明らかにしている。特に、アミノ酸318-335の領域を削除するとレポーター遺伝子活性の著しい向上が見られるので、この領域はDREB2Aタンパク質の活性化において重要な役割を担っていると思われる。DREB2Aタンパク質のターゲット遺伝子を特定するため、活性型DREB2Aデリーション変異体を過剰発現させた形質転換シロイヌナズナを用いてマイクロアレイ解析を行った。

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　我々はこれまで、シロイヌナズナの乾燥・塩・低温応答性の遺伝子の発現調節に関わる転写因子DREBについての解析を行い、さらにイネにおけるDREBのホモログを同定した。これらDREB遺伝子を導入したシロイヌナズナでは、多数のストレス誘導性遺伝子の転写産物の蓄積及びストレス耐性の向上を確認した。さらにイネにDREB遺伝子を導入したところ、2つのイネの乾燥・高塩・低温ストレス誘導性の遺伝子が過剰発現することを見出した。このストレス誘導性遺伝子の一つはそのプロモーター中にDREBが結合するDREが存在していた。本発表では、イネにおけるDREB遺伝子の機能を、形質転換イネを用いてさらに詳細に調べた。
　DREB導入イネの耐性試験を行い、乾燥耐性が上昇していることを確認した。また、これら形質転換体中の遊離アミノ酸を分析したところ、ストレスのないコントロール状態でも適合溶質であるプロリン濃度が上昇していることが明らかになった。さらにイネのcDNAマイクロアレイによる解析の結果、前述の2遺伝子の外にもDREBのターゲットと思われる遺伝子が見出された。が、イネにおいてもシロイヌナズナと同様、DREB遺伝子の導入により複数のターゲット遺伝子の発現が誘導され、その結果適合溶質であるプロリンの上昇などの生理現象が起こり、DREB導入イネの乾燥耐性が上昇したと考えられる。

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DREB1A遺伝子は、低温、乾燥および塩ストレスに関与する遺伝子発現を制御するシス領域であるDRE（Dehydration Responsive Element）配列に結合するタンパク質をコードするcDNAとして単離された。DREB1A遺伝子は、低温ストレス条件下において 誘導される。DREB1A遺伝子を恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温、乾燥、塩ストレス耐性が向上する。本研究では、DREB1Aによって制御される標的遺伝子を完全長7000cDNAマイクロアレイおよびAffymetrix社製 8000 Genechipをもちいて網羅的に検索した。さらに、DREB1A遺伝子の直接的な標的遺伝子を3つの基準で同定した。(1)標的遺伝子のmRNAの蓄積量は、DREB1A遺伝子を導入した形質転換植物体で上昇する。(2)標的遺伝子のmRNAの蓄積量は、低温ストレス処理後、2から10時間で上昇する。(3)標的遺伝子のプロモーター領域内にはDRE配列が存在する。これらの解析結果からDREB1A遺伝子はストレス耐性に関与する種々の機能をもった遺伝子群を制御していることが明らかになった。

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我々は、シロイヌナズナトランスポゾンDs挿入変異体のリソースの中から、乾燥に著しく感受性を示す劣性の変異体slh1(sensitive to low humidity 1)を取得した。slh1はプレート中では正常に生育するが、幼植物体を土に移植すると、徐々に壊死班が現れて枯死してしまった。土に播種した場合には、本葉が小さく萎れた暗緑色になり、矮小化した植物体となった。slh1は高い湿度条件では生長し種子を得ることができたが、ABA噴霧では表現型は回復しなかった。透明化による顕微鏡観察により、葉の矮小化は細胞サイズの縮小によるものであることがわかった。マイクロアレイ解析の結果、病原体抵抗性に関与する遺伝子の変動が示された。ノーザン解析により、slh1植物体では、抵抗性関連遺伝子（PR1, PR2）、酸化的ストレス関連遺伝子（PRXc, GST）、プログラム細胞死関連遺伝子（SAG13）、Rgeneシグナリング関連遺伝子（EDS1）といった過敏感反応のマーカー遺伝子の恒常的な発現が認められた。さらに、slh1葉身において、トリパンブルー染色による死細胞と、アニリンブルー染色によるカロースと自家蛍光物質の蓄積を検出した。これらの結果より、slh1は自発的に病原体抵抗性反応を示す変異体であることが明らかとなった。Ds挿入位置は決定したが、現在相補性を確認している。

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　シロイヌナズナの光形態形成抑制因子COP1は、暗所では核に分布し、核内の転写因子等のタンパク質との相互作用を介して光形態形成を抑制する。一方、明所では細胞質に移行し、COP1による抑制が外れると考えられている。本研究ではCOP1の細胞内分布と機能発現の相関を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。COP1の核移行を抑えるためにCOP1のNLS (Nuclear Localization Signal) に変異を加え、GFPとの融合遺伝子を構築した。このGFP-COP1 (Mut) 遺伝子をタマネギ表皮細胞で一過的に発現させたところ、GFP-COP1は核に、GFP-COP1 (Mut) は細胞質に分布することを確認した。これらの遺伝子をシロイヌナズナに導入し、GFP融合タンパク質が芽生えの形態形成に及ぼす影響を調べた。その結果、GFP-COP1は核に、GFP-COP1 (Mut) は細胞質に分布していた。また、GFP-COP1 (Mut) 形質転換体の芽生えでは、暗所で子葉の発達が観察された。このような暗所での子葉の発達はGFP-COP1過剰発現個体では見られなかった。従って、GFP-COP1 (Mut) 形質転換体の形態変異はCOP1の細胞質分布によるものと推測できる。以上の実験結果に基づいてCOP1の細胞内分布と機能発現の相関について考察する予定である。

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　ラン藻 Anabaena sp. PCC 7120は、窒素飢餓時にヘテロシスト (異形細胞) を分化させて、窒素固定を行うようになる。窒素固定を行うニトロゲナーゼは酸素によって不活性化されてしまうため、ヘテロシスト内は嫌気状態に保たれる。このような生理現象には、酸素の感知が重要な役割を果たすと考えられる。バクテリアの酸素センサーとして、根粒菌のFixLや大腸菌のDOSといったタンパク質のヘムPASドメインが知られている。我々は、Anabaena 7120のゲノム解析よりヘムPASドメインを含むalr2428という遺伝子を検出し、このドメインを含むタンパク質をCyanobacterial oxygen sensor (COS) と名付けた。このヘムPASドメインに関して、ヒスタグ融合タンパク質として大腸菌で発現、精製した。精製タンパク質は、ヘム結合タンパク質に特有の吸収スペクトルを示した。このタンパク質に関して、酸化型、還元型、酸素結合型、一酸化炭素結合型のそれぞれの状態を作り、吸収スペクトル、ラマンスペクトルを測定した。これらは、大腸菌のDOSに非常によく似ており、酸化型、還元型において六配位になっていたが、DOSの配位残基に該当するアミノ酸は、一次配列では保存されていなかった。可能な配位残基について議論する。

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オゾンは光化学オキシダントの主成分であり、植物に取り込まれるとエチレン（ET）、ジャスモン酸（JA）、サリチル酸（SA）を介した遺伝子発現を誘導する。本発表ではcDNAマクロアレイを用いてオゾン誘導性遺伝子の単離及びそれらの発現のシグナル依存性について検証した。
0.2ppmのオゾン暴露と非暴露を12時間行なったシロイヌナズナから調製したmRNAを用いてcDNAマクロアレイをスクリーニングした結果、オゾン暴露により発現変化する遺伝子を245クローン（発現増加185クローン、発現減少60クローン）単離することができた。次に、オゾンにより発現増加するクローンを用いてサブセットアレイを作製し、これらの発現誘導性をET、JA、SAシグナル伝達変異体（ein2-1、jar1-1、npr1-1）で検証した。約半数の遺伝子の発現誘導がein2-1で抑制された事から、オゾンによる遺伝子発現は主にETによって制御されていることが示唆された。さらに、オゾン暴露時のET、JA、SAシグナル相互作用について調べた結果、多くの遺伝子の発現が各シグナル物質により拮抗的に制御されていた。特にETやJA経路によって誘導されるcell rescue/defenseに関与する遺伝子群の発現はSAシグナルによって抑制されることから、SAシグナル伝達経路はETやJA経路により誘導される遺伝子に拮抗的に働くことが示唆された。

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生物は急激な環境温度の上昇に曝されると、いわゆる熱ショックタンパク質を発現させて適応することが知られている。我々はDNAマイクロアレイを用いて、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803の熱ショック条件下での遺伝子発現プロファイルを解析した。多数の熱ショックタンパク質の遺伝子に加えて、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の発現が誘導されることがわかった。その熱ショック誘導性のヒスチジンキナーゼ遺伝子の破壊株は、野生株に比べ熱ショックに対する耐性が明らかに高まっていた。また、その変異株では通常の培養温度（34℃）において、いくつかの熱ショックタンパク質の遺伝子発現が顕著に高まっていることがわかった。これらの結果から、ラン藻にはこのヒスチジンキナーゼにより熱ショックタンパク質の発現を抑制する機構が存在することが示唆された。ラン藻にはHrcAといわれる、熱ショックタンパク質遺伝子の発現抑制因子の存在が知られている。我々はこの転写調節因子の破壊株も作製し、その遺伝子発現におよぼす影響を調べた。その結果、熱ショック誘導性のヒスチジンキナーゼと転写因子HrcAは独立に熱ショックタンパク質の遺伝子群を制御していることが明らかになった。これらの結果をもとに、ラン藻の熱ショック応答の機構について考察する。

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Exposure of photosynthetic organisms to strong light leads to photoinhibition of photosystem II (PSII). We isolated mutants of histidine kinases (Hiks) in which the extent of photoinhibition was higher than that in wild-type cells. In ΔHik2 cells, photoinhibition was apparently accelerated by hyperosmotic stress with 0.5 M sorbitol due to the inhibition of repair of damaged PSII. Inactivation of Hik16 and Hik33 also enhanced the photoinhibition. ΔHik16 cells were not able to uptake sorbitol under hyperosmotic conditions, whereas ΔHik33 degradated chlorophyll under strong light. Thus, effects of inactivation of Hik2, Hik16 and Hik33 on tolerance of PSII are different. These results suggest that Synechocystis assigns different function to Hik2, Hik16 and Hik33 to tolerate photoinhibition.

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リン酸は生体内において様々な構成成分の合成および生化学反応に利用されており、生物にとって最も重要な栄養素の一つである。我々は、先にアルカリフォスファターゼ活性を指標に、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803におけるリン酸欠乏応答に関与する因子としてヒスチジンキナーゼHik7(sll0337)およびレスポンスレギュレーターRre29(slr0081)から成る二成分制御系を明らかにした。今回新たにDNAマイクロアレイを用いてリン酸欠乏応答性遺伝子の網羅的解析を行った結果、野生株では8時間のリン酸欠乏処理を施したところ、アルカリフォスファターゼ、リン酸トランスポーターなどの著しい発現誘導が確認された他に、7種の機能未知遺伝子の発現誘導が認められた。またHik7およびRre29欠損株を同様のリン酸欠乏条件下において解析したところ、リン酸欠乏応答性遺伝子の発現誘導がすべて抑制されていた。これらの結果から、Hik7およびRre29からなる二成分制御系は、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803の唯一のリン酸欠乏応答の制御系であると考えられた。

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タバコのMAPキナーゼであるWIPKは病傷害ストレスによりリン酸化され、活性化される。活性化されたWIPKは病傷害応答のシグナル伝達において重要な役割を演じていると考えられる。しかし、その活性化を引き起こす内生シグナルの実体は不明である。そこで、我々は、TMV感染タバコ葉からWIPK を活性化する物質を生化学的手法により単離し、機器分析によりその構造を決定したことを前本学会において報告した。この物質（WAF-1）は、新規なラブダン型ジテルペン化合物であった。この物質の有機合成にも成功し、合成品を用いたところ、nM濃度でWIPKを活性化した。
　今回、内生WAF-1の定量法を確立し、病傷害ストレスによる内生WAF-1量の変動を調べた。TMV感染タバコ葉では、壊死病斑の形成前にWAF-1が蓄積し始めること、その蓄積はWIPKの活性化に先行することがわかった。人為的に葉に傷つけても、内生WAF-1量が急速に増加した。また、nM濃度での外生WAF-1処理は傷害誘導性PR遺伝子群の転写産物の蓄積を高めた。これらの結果は、WAF-1がWIPKの活性化と傷害誘導性防御遺伝子群の発現誘導の内生シグナルとして機能することを示す。

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WIPK is a protein kinase from tobacco transcriptionally induced by wounding and activation of the hypersensitive response (HR). A yeast two-hybrid screen for proteins interacting with WIPK led to the identification of a new protein, NtWIF. The C-terminus of NtWIF interacts with WIPK in the yeast two-hybrid system as well as in an in vitro pull-down assay. The N-terminus shows high sequence similarity to the DNA binding domain of ARF transcriptional regulators, and the middle region confers transactivation activity to a luciferase reporter gene. Furthermore, a GFP-NtWIF fusion construct localizes to the nucleus in onion epidermal cells, suggesting a role of NtWIF as a transcription factor.
Transgenic tobacco plants constitutively expressing full-length NtWIF were produced. These plants have a drastically changed expression pattern of wound responsive genes. Our results provide evidence for the involvement of NtWIF in a signal transduction pathway from WIPK to the transcriptional control of wound-responsive genes.

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MAPKカスケードは真核生物に広く保存されているシグナル伝達系の一つであり、高等植物においても環境ストレスや病原菌感染応答における重要性が示唆されている。近年、シロイヌナズナのGenome sequence projectが終了し、シロイヌナズナゲノム中にはMAPKKKが60、MAPKKが10、MAPKが20個存在することが明らかとなった。今回、我々はMAPK kinaseの一つであるAtMKK3に着目し、AtMKK3がどのMAPKを基質とするかをin vitro 活性法により検討した。その結果、AtMKK3はAtMPK8を特異的に活性化することが示唆された。また、AtMKK3を過剰発現させた植物体において、AtMPK8が強く活性化されることを確認した。AtMPK8は酵母のmpk1 mutantを相補することから、MAPKとしての機能を所持するものと推測される。更にAtMPK8はCalmodulinと特異的に結合することがYeast Two-Hybrid Systemにより示唆された。AtMKK3及びAtMPK8に類似した遺伝子は植物以外の真核生物には存在しないことから、植物独自のAtMKK3-AtMPK8カスケードがどのような機能を担っているかを詳細に解析している。また、Calmodulinのこのカスケードにおける関与についても解析を進めており、その成果について報告する。

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私たちは、イネの登熟初期におけるデンプン蓄積のメカニズムを明らかにする目的で、登熟初期の未熟種子で一過的に発現が誘導されるSNF1相同遺伝子産物(OSK)の機能解析を進めている。OSKに特異的な合成基質のリン酸化能を指標に、イネの未熟種子からOSKホロ酵素を部分精製し、ゲル濾過法により分子量を決めたところ、約130kDであった。酵母のSnf1や動物のホモログであるAMPKはα, β, γの3量体（分子量120～140kD）から成っており、イネのOSKホロ酵素も同様のサブユニット構造を持つと予想された。そこで酵母を用いたTwo-hybridスクリーニングによってOSKと相互作用するタンパク質を探索した。単離したクローンは最終的に16種類のcDNAに分類され、その中には3種類のβサブユニットのホモログ（β#15, β#17, β#19）が含まれていた。この3種類のβサブユニットのアミノ酸配列を比較すると、β#17と β#15は酵母Snf1複合体のβサブユニットであるGAL83と全長にわたって相同性を示したのに対して、β#19はC末側半分（ASCドメイン）のみを含む短いタンパク質であった。OSKには3種類の分子種（OSK1, OSK24, OSK35）が存在するので、特異的な組み合わせがあるかどうかを調べるために登熟過程における発現パターンを比べたところ、3種類のβサブユニットの遺伝子はいずれもOSK1に似た発現パターンを示した。

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シンクやソースの機能制御、ストレス応答など植物生長の様々な面で重要な役割を果たす糖に応答した遺伝子発現制御には、複数のシグナル伝達経路が関わる。しかし、糖シグナル応答に関与することが明らかになった転写因子は極めて限られている。我々は、シロイヌナズナのマイクロアレイを用いて糖に応答したmRNA レベルの変動を網羅的に解析し、多数の糖応答性遺伝子を同定した。その中の転写因子遺伝子について、更に詳細な解析を進めている。ショ糖による誘導比の最も高かった遺伝子の一つがAtMYB90である。AtMYB90はアントシアニン合成系遺伝子の発現に関与することが最近報告され、その糖による誘導は糖によるアントシアニン蓄積の誘導に関わると考えられる。AtMYB90 mRNA はグルコースでも誘導されたが、2-デオキシグルコースやABAには顕著な応答を示さなかった。ショ糖により多くの bZIP因子のmRNAレベルが変動し、その多くがABAにも応答することから、ABA 依存的な糖シグナル応答経路で働いていると推定される。しかし、bZIPの中でもAtbZIP22 と AtbZIP63のmRNA は、ショ糖処理後急速に誘導、あるいは抑制をうけたが、ABAに対しては顕著な応答を示さなかった。また、これら2つのbZIP mRNA のショ糖による誘導や抑制はシクロヘキシミド存在下でも起こった。

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Oxidative stress is a major environmental factor for all living organisms. Incubation of the cyanobacterial cells of Synechocystis with 0.25 mM of H₂O₂ causes dramatic changes in the pattern of gene expression. Expression of about 230 genes encoded in the genome was enhanced and 260 genes were repressed by H₂O₂. We also found that two histidine kinases, Hik33 and Hik34, and a putative transcription factor were involved in the regulation of H₂O₂-inducible genes. Hik33 regulated the expression of more than 100 genes and Hik34 regulates that of 20 genes. The transcription factor negatively regulates the expression of a small number of genes. However, the expression of other genes was not regulated by these components. These results suggest that there are at least 4 pathways for signal transduction of oxidative stress in Synechocystis.

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　リン酸飢餓条件下で成長したヒメウキクサSpirodela oligorrhiza（-P植物）は、リン酸十分条件下で成長した植物（+P植物）に比較し、50倍以上高いリン酸取り込み活性を示した。この-P植物におけるリン酸取り込みはCCCPにより阻害されることより、細胞膜を横切っての電気化学的プロトン勾配に駆動されることが示唆された。またリン酸取り込みの速度論的解析から、-P植物にはリン酸飢餓によって誘導される高親和性リン酸トランスポーターが存在することも予測された。そこで、高親和性リン酸トランスポーターの保存配列に対する抗血清を用いて、細胞膜タンパク質のウェスタンブロット分析を行ったところ、-P植物で大きく蓄積する強い疎水性の48 kDaタンパク質を検出した。一方、細胞膜H⁺-ATPaseのウェスタンブロット分析では、リン酸飢餓に伴う量的増加を検出出来ず、またATP加水分解活性も+P植物の方が高かった。しかし、ATPase活性及びプロトンポンプ活性の速度論的解析から、-P植物では低いK_m値と高いH⁺/ATP共役比を持ったプロトンポンプが存在することが示唆された。
　以上の結果は、ヒメウキクサの-P植物におけるリン酸取り込み活性の大きな増加は、主に高親和性リン酸トランスポーターの誘導と細胞膜における蓄積に起因し、-P植物における高親和性・高エネルギー効率の細胞膜プロトンポンプが、その取り込みをリン酸飢餓下で促進していることを示している。

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