シロイヌナズナの花茎は生殖成長期に急速にまっすぐ伸長する。これは、複数の組織間での協調的な成長に加え、重力や光といった環境刺激に適応した結果である。我々は、花茎の形態に異常を示す変異体を単離し、これらの分子機構を明らかにしようと考えた。fiz1 (frizzy shoot1)は、花茎や花柄がくねったり、カールしたりする。さらに、黄化芽生え胚軸の伸長、根の伸長、根毛の形成にも異常を示す。これらの表現型は半優性で現れる。さらに、胚軸や根においてfiz1と似た表現型を示すfiz2変異体も単離した。fiz1変異体はACT8に、fiz2変異体はACT2にそれぞれミスセンス変異を持っていた。また、それらの変異箇所はアクチン分子の異なるサブドメイン上にあった。ACT2のT-DNA挿入変異体に、fiz1変異をもつACT2ゲノムを導入すると、元のfiz1、fiz2変異体より非常に矮小な植物が得られた。このことから、fiz1変異はfiz2変異に比べ非常に強い負の優性変異であり、アクチンの脱重合への影響に違いがあると考えられた。現在、GFPマーカーを用いてアクチン繊維とオルガネラの動態を解析中であり、その結果についても報告する予定である。

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根毛の変形は根粒菌の侵入開始に必須な初期現象である。本研究ではマメ科モデル植物であるミヤコグサLotus japonicus Gifuと根粒着生初期不全変異体であるLjsym71およびLjsym73を用いて、根粒菌Mesorhizobium loti MAFF303099由来のNod factor処理による、根毛におけるF-アクチン骨格の挙動を蛍光ファロイジン染色により観察した。野生型において、処理後5分では根毛の先端部位の蛍光シグナルが徐々に弱くなり、10分ではケーブル状のF-アクチンが細くなり先端部位近傍に散在していた。しかし変異体では、接種後10分でもケーブル状のF-アクチンが先端部位近傍まで確認された。処理後1時間の野生型では根毛先端部位が膨潤し、再伸長を始めていた。また根毛内でのF-アクチンまたはアクチンケーブルの再構築が見られた。これに対し、変異体では根毛の変形が遅延し、またF-アクチンの挙動も野生型とは異なっていた。処理後2時間ではLjsym71は野生型とほぼ同じアクチンネットワークが再構築されていたが、Ljsym73ではアクチンネットワークの再構築が進んでおらず、野生型より遅れていた。変異体ではNod factorに対する応答が遅く、F-アクチン骨格の構築変化が不全なことから、秩序立ったアクチンネットワークの再構築は根粒菌感染に重要な役割を果たしていると考えられる。

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　多細胞生物にとって細胞間接着は、形態形成の調節を行う上で非常に重要な要素のひとつである。半数体タバコの葉切片に対しT-DNAの導入による変異誘導を行うことで、細胞接着性に変化が見られ、器官分化能力を失った細胞接着変異株nolac(non-organogenic callus with loosely attached cells)のひとつであるnolac-K4を得た。この変異株からTAIL-PCRを用いてT-DNAにタグされた遺伝子を単離したところ、3種の異なるT-DNA近傍配列が得られた。そこで相同性検索等により変異の原因遺伝子の候補（L445）を絞り込んだ。その結果、L445はタンパク質間相互作用の受容体様ドメインであるLRR(leucine-rich repeat)とEXTENSINドメインをもつキメラ遺伝子であることが分かった。このL445は主に根、葉などで発現が強く、花でも発現していた。また、pL445::GUS導入タバコでは若葉の葉柄の維管束、葉脈及び、根端、側根原基で強く発現していた。さらに、LRRドメインのみを過剰発現させたBY-2培養細胞では、約40％の細胞に細胞が肥大するなどの形態や分裂の異常が見られた。

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タバコ細胞壁に局在するpurple acid phosphatase(NtPAP)をコードする4種類のcDNAクローンのうち、プロトプラストの細胞壁再生過程における発現解析を行なったところ、細胞壁再生に伴い、NtPAP12のmRNAレベルの速やかな増加が認められた。そこで、NtPAP12をタバコ細胞に導入し、NtPAP12を過剰発現する形質転換タバコ細胞を作出した。形質転換プロトプラストの細胞壁再生過程は、プロトプラスト表面全体がβ-グルカンで覆われる再生120分までカルコフルオア染色により観察された。その結果、野生株と比較してβ-グルカンの蓄積の促進が認められ、再生60分後には野生株のほぼ2倍量に増加した。本研究では、培養7日目のタバコXD-6細胞の野生株と形質転換体のプロトプラストの細胞壁再生初期（再生60分まで）の細胞壁画分からNaClによってNtPAPを溶出し、細胞壁画分のNtPAP蓄積量の定量化を試みた。その結果、形質転換体でのNtPAPの細胞壁への蓄積の増加量は野生株に比較して再生60分後に約2倍であった。なお、プロトプラストの細胞壁再生60分後の細胞壁からNtPAPを溶出するための濃度は、培養7日目細胞の細胞壁から溶出するための濃度の約1/2であった。

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タバコ種間雑種（Nicotiana gossei Domin x N. tabacum L.）は種子発芽後3日目で下胚軸基部から細胞死が開始し、これが全身に拡大して枯死する。致死反応は26℃で進行し37℃で抑制される。植物体で検出される O₂^-とH₂O₂の量は37℃より26℃で有意に増大した。26℃で培養した植物体へのマンガンデスフェリオサミンやSOD（O₂^-のスカベンジャー）の処理はO₂^-量を低下させるがH₂O₂量は低下させず、これらの処理は致死の進行を抑制しなかった。他方、ピリジンやDPI（NADPH酸化酵素の阻害剤：O₂^-とその不均化により生じるH₂O₂の発生を抑制する）処理はO₂^-量と共にH₂O₂量を低下させ、これらの処理は致死の進行を抑えた。イネのCuZn-SODと細胞質型アスコルビン酸パーオキシダーゼ（APX）を過剰発現する形質転換タバコを花粉親として、N.gosseiと交雑して得たF₁雑種を解析した結果、CuZn-SODでは致死の進行が早まり、APXでは抑制されることが分かった。これらの事実から、タバコ種間雑種の致死発現では、O₂^-よりもH₂O₂が細胞死反応のシグナルとして作用することが明らかとなった。

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タバコ種間雑種（Nictotiana gossei Domin x N. tabacum L.）の培養細胞（GTH4）はその親植物同様37℃から26℃に移した後、急速に致死する。これまでの研究から、活性酸素種がGTH4の細胞死に関与することが示されてきた。GTH4細胞の致死反応において、O₂^-とH₂O₂とのいずれが、より直接のシグナルとして作用するかを調査した。細胞をマンガンデスフェリオサミン（MnDef）やSOD処理すると、共にO₂^-の検出量が低下したが、MnDefではH₂O₂の検出量も低下した。他方、SODではH₂O₂は低下しなかった。細胞死はMnDefで抑制されたが、SODでは抑制されなかった。細胞をピリジンやDPI、あるいはカタラーゼ（Cat）処理するとH₂O₂の検出量は低下し、細胞死も抑制された。グルコース(G)／グルコース酸化酵素(GO)によるH₂O₂発生条件下では細胞死は促進し、Catを同時処理することで抑制された。キサンチン(X)／キサンチン酸化酵素(XO)によるO₂^-発生条件下では無処理区と比較して90倍ものO₂^-とH₂O₂とが検出されたが、細胞死は抑制された。また、X/XO処理はG/GOによる細胞死促進効果をうち消した。以上の事実から、GTH4細胞の致死発現にはO₂^-ではなくH₂O₂がシグナルとして作用することが明らかとなった。

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　ネナシカズラは、根も葉も退化した絶対寄生性被子植物である。このツル状の寄生植物は特殊な吸収器官（いわゆる寄生根）を形成し、宿主植物の地上部に侵入させる。我々は、ネナシカズラ寄生根の同調誘導系を確立しており、この実験系を用いて寄生根分化のしくみを調べている。これまでの組織観察の結果、寄生根分化過程の中後期に寄生根原基の特定部域の細胞が崩壊していくという事実が見いだされた。そこで本研究では、プログラム細胞死（PCD）に関連する既知の遺伝子群に着目して、それらが寄生根分化過程でどのような発現挙動を示すかを調べた。
　まず、ネナシカズラの寄生根組織からRNAを抽出し、一群のPCD関連遺伝子のcDNAの単離を試みた。その結果、3種類のプロテアーゼ遺伝子と2種類の老化関連遺伝子のcDNAクローンを得た。これらとすでに取得済みのエンドヌクレアーゼ遺伝子および3種類の細胞壁多糖分解酵素遺伝子のcDNAとを用いて、寄生根分化過程におけるそれぞれの遺伝子の発現パターンをRT-PCRによって解析した。調べた9種類の遺伝子のうちプロテアーゼ遺伝子の1種と老化関連遺伝子の1種とを除く7種の遺伝子の発現レベルが、細胞死の観察される発生時期に特異的に上昇することが明らかになった。以上の結果とともに、現在すすめているin situ ハイブリダイゼーションの結果についても報告する。

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長日植物アラビドプシスの転写因子CONSTANS(CO)と短日植物イネのオーソログであるHd1は、FT相同遺伝子の発現制御に関わっており、日長による開花の制御において中心的な役割を果たしている。しかしながら、COは長日条件下でFTの発現を促進するのに対し、Hd1は長日条件下でイネFT相同遺伝子(Hd3a
etc.)の発現を抑制、短日条件下では促進するという点で、両者を介した日長によるFTの制御は異なっている。私達は、CO/Hd1によるFT相同遺伝子の発現制御の共通点と相違点を明らかにするために、イネとアラビドプシスにおける一過性発現系を用いて、CO/Hd1によるFTおよびHd3aの発現制御の解析を行った。Hd1はイネのプロトプラストの一過性発現系においてHd3aプロモーターの活性を抑制することが報告されているが、FTプロモーターに対しては、活性化に働くことが確認された。一方COはアラビドプシスにおいてFT-プロモーターを活性化することが報告されているが、イネにおいてHd3aプロモーターに対しては抑制的に働くことも確認された。これらの結果は両種間のCO/Hd1によるFT相同遺伝子の制御の違いは、プロモーターの違いも要因であることを示している。現在FTとHd3aのプロモーター上のCO/Hd1による発現制御に関わるシスエレメントの同定を行っている?

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シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC7942のkaiA、kaiBおよびkaiCは概日リズム発生に必須である。KaiCタンパク質はkaiBC遺伝子の転写を抑制するが、この自己フィードバックループが概日時計の本体であると考えられている。KaiCはin vivoでSer/Thr残基のリン酸化に概日リズムが観察され、in vitroでは自己リン酸化および自己脱リン酸化活性を示す。さらにKaiCのリン酸化はin vivo、in vitroともにKaiAにより促進され、KaiBにより抑制されることが明らかになっている。しかしながら概日リズム機構におけるKaiCのリン酸化の役割は未だ不明である。我々はKaiCのリン酸化レベルが低下するシアノバクテリア株を2つ得た。これらの株においてはkaiBC 遺伝子発現リズムが失われ無周期になっていた。また現在KaiCのリン酸化部位の決定を試みている。これらの結果をもとにKaiCのリン酸化がシアノバクテリアの概日時計システムにおいて果たす役割を考察したい。

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Chl. tepidumからクロロソームを単離する新しい手法を開発した。 2M NaSCNの存在下でEDTA-リゾチーム処理により外膜を破壊し、浸透圧ショックで溶菌後、ショ糖勾配遠心によりクロロソームの単離を行った。この手法により単離したクロロソームはバクテリオクロロフィル(BChl) aをもつFenna-Mattews-Olson　(FMO)タンパクを結合していないことが低温スペクトル（100K）測定により確認された．従来のフレンチプレスによる破砕方法で単離したクロロソーム内ではBChl cからベースプレートBChl aへのエネルギー移動効率は低下するが、この手法により単離したクロロソーム内では生細胞内における効率とほぼ近い結果を得た．このクロロソーム単離の過程でBChl cのQyバンドのピークは約10 nm短波長側へシフトしたが、ポリエチレングリコール(PEG)を加えることで元の生細胞の波長を回復した．これはPEGのもつ疎水性効果によるものと考えられた．またPEGを加えた前後のスペクトル分析からBChl c集合体の波長のシフトは長波長側のみの影響によることから、クロロソーム内のBChl c集団はFMOタンパクの分離に伴って集合構造が変化し、PEGを加えることで元の状態に戻ったことが示唆された．

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好熱性シアノバクテリアの光化学系I反応中心のP700近傍には機能未知のフォスファチヂルグリセロール(PG)が3分子結合し、その機能は興味深い。シアノバクテリア SynechocystisPCC6803 のPG合成酵素欠損株をPG欠乏培地に移すと、既報のように、3日以内に系II電子受容体キノン(QB)機能が失われた。この時点では系I活性には変化なかった。さらに7日以上PG欠乏状態をつづけると、系I反応中心量の減少、3量体形成の阻害、小蛋白質の欠落がみられた。PG再添加により3量体形成の回復、系II活性の回復がみられた。これにより反応中心外側の3量体中心部でPGが働く事が示された。さらに、遅延蛍光の励起スペクトルと、5-77Kでの蛍光寿命を測定し、PG欠乏に伴う系I, II反応中心内部の機能変化について検討した。

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酸素発生系II標品に結合した表在性蛋白は植物種間で異なることが知られている。高等植物には、33, 23, 17 kDa の3種の表在性蛋白が存在するが、ラン色細菌には33, 12 kDa 蛋白とcytc550 の3種の表在性蛋白、また紅藻には33, 20, 12 kDa 蛋白とcytc550 の4種の表在性蛋白が結合している。我々は、表在性蛋白の分布を指標とした酸素発生系の進化を調べる目的で、すでに種々の植物種のPSIIあるいはチラコイド膜と高等植物や紅藻の表在性蛋白の抗体との反応性を調べてきた。その結果、褐藻、珪藻のチラコイド膜は紅藻の20 kDa 蛋白(R20) とcytc550 (Rc550) の抗体と反応し、緑藻のPSII やチラコイド膜は高等植物の23 kDa 蛋白(H23)の抗体 と反応することを報告した（2002年 植物生理学会）。今回、新たにハプト藻、プラシノ藻、ユーグレナ藻について調べたので報告する。ハプト藻のチラコイド膜はR20, Rc550の抗体と反応し、ユーグレナのPSIIとプラシノ藻のチラコイド膜はH23の抗体 と反応することが明らかになった。これらの結果は、紅藻が二次共生した褐藻、珪藻、ハプト藻には紅藻型の表在性蛋白がそのまま保存されてきたことを、一方、Chl.a/b型の光合成生物には高等植物型の表在性蛋白が存在することを示す。

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We have reported a novel protein homologous to plant PsbQ in cyanobacterial PS II. The localization and the function of this protein were carefully assessed in Synechocystis 6803. Although the cyanobacterial PsbQ is predicted to be a soluble protein with one transit peptide, it was unexpectedly extracted to Triton X114 phase. However, trypsin digestion revealed that PsbQ was highly exposed to the lumenal space. PS II complexes purified from the mutant lacking psbQ showed impaired oxygen evolving activity. Furthermore, witout PsbQ, the donor side of PS II became remarkably sensitive to NH₂OH. And, the cytochrome c550 (PsbV) partially disappeared in the purified PS II complex suggesting the structural vulnerability without PsbQ. These findings confirm that PsbQ really associates to the lumenal side of PS II with anchor to the lipid layer, and functions at the water oxidizing system.

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The reported crystallographic structural model of cyanobacterial PS II suggests important function of PsbU in water oxidation. We have deleted the psbU gene in Synechocystis 6803. The &DeltapsbU cells could not grow if both of Ca²⁺ and Cl^- were eliminated from the growth medium. The light utilization efficiency and the maximum rate of oxygen evolution were highly reduced than in wild type cells even if after grown in normal BG11. S2-state decay was slowed down, whereas S3-state showed faster decay in &DeltapsbU. The S-state distribution after dark adaptation was also perturbed. Polypeptide analysis showed that a number of extrinsic proteins (PsbO, PsbV and PsbQ) were absent in the isolated &DeltapsbU PS II complex. These results supports the idea that PsbU contributes to the functional assembly of the extrinsic proteins and Ca²⁺ ion to assist efficient water oxidation in PS II.

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　高等植物では効率的な遺伝子発現抑制の技術が未確立であるため，光合成関連タンパク質の生理機能の解析には形質転換の容易なシアノバクテリアやクラミドモナスなどの微生物が主に用いられてきた。しかし，高等植物に特有なタンパク質の機能解析には，植物における遺伝子発現抑制法の確立が性急な課題である。そこで，本研究では，psbP遺伝子を標的に，近年有効なツールとして期待されているRNAi法により，遺伝子発現抑制形質転換タバコの作製を試みた。
　表在性23-kDaタンパク質（PsbP）は緑藻と高等植物に特徴的な核支配の光化学系IIサブユニットの一つで，Nicotiana tabacumのpsbP遺伝子はファミリーを形成し，塩基配列の相同性により2つのグループに分類される。まず，グループ内での相同性が高くかつグループ間で相同性の低い3'-非翻訳領域をRNAiトリガー配列として用いることで，グループ特異的な発現抑制が可能であることを明らかにした[Ifuku et al. (2003) BBB, 67, 107-113]。また，高度に保存されたコーディング領域をトリガー配列に用いることにより，ファミリーを構成する全てのpsbP遺伝子の発現を完全に抑制することにも成功した。PsbP発現抑制タバコは，すでに報告されているクラミドモナスPsbP欠損株とは明らかに異なる特徴を示しており，現在，その生理機能の解明のために形質の安定なT2ホモラインで詳細な解析を進めている。

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プラストシアニンは酸素発生型の光合成電子伝達系で機能する電子伝達銅タンパク質である．われわれは緑藻Pediastrum boryanumにおいて，このプラストシアニンの発現が倍地中の銅に依存して制御されていることを報告してきた．今回，P.boryanumのプラストシアニン遺伝子をinverse PCRゲノミッククローニングにより単離し，コーディング領域の5’側上流領域1kbと3’側下流領域0.9 kbの塩基配列を決定した．cDNA配列との比較から緑藻に共通に含まれるイントロンが1つあった．これまでに報告されている緑藻2種のプラストシアニン遺伝子と比較すると，Scenedesmus obliquus が2つ目のイントロンを持つという違いがあるにもかかわらず，5’側上流領域及びコーディング領域においてはChlamydomonas reinnhardtiiよりも，S. obliquusの方に類似していた．3’側下流領域には類似した配列は見つけられなかった．

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　植物細胞でのシグナル伝達の分子機構を解明するためには、タンパク質の核－細胞質間輸送の視点からの考察が有効である。私たちはGFPを利用して核外輸送系の特性を明らかにした。核外輸送には疎水性アミノ酸に富む核外輸送シグナル(NES)が働くとされており、本研究ではPKIαのNES（NES1）とトマトHsfA2のNES（NES2）をそれぞれGFPのN末端、C末端、もしくは両方に付加したプラスミドを構築した。これらをタマネギ表皮細胞で一過的に発現させ、NES-GFP融合タンパク質の細胞内局在を観察した。NES1もNES2もGFPの核外輸送には有効であったが、NES1付加よりもNES2付加の効果の方が大きかった。また、NES付加はN末端、C末端に関わらず有効であった。一方、タンパク質の核外輸送にはエクスポーチンがタンパク質受容体として働く。このエクスポーチンの特異的阻害剤であるレプトマイシンB（LMB）の効果を調べたところ、NES-GFP融合タンパク質の核外輸送が阻害された。このことから、NES-GFP融合タンパク質の核外輸送にはエクスポーチンが関与していることが示された。今後、さまざまなタンパク質の細胞内分布に関する実験に応用できる。

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DnaJファミリーのタンパク質（DnaJホモログ）は，hsp70のパートナータンパク質として，その活性の制御を行なうとともに，hsp70の基質タンパク質とも結合する分子シャペロンである．出芽酵母小胞体には，Jem1p，Scj1p，Sec63pという3種類のDnaJホモログが存在し，小胞体のhsp70であるBiPのパートナータンパク質として，タンパク質の小胞体膜透過，小胞体におけるタンパク質の品質管理，接合時の核膜融合といった過程を制御している．われわれは，変異体を用いた解析から，BiPは異なる過程に異なるDnaJホモログをパートナーとして用いることを明らかにしてきた．シロイヌナズナゲノム上に存在する約90のDnaJホモログの遺伝子の中にも，1次構造の比較から，出芽酵母のJem1p，Scj1p，Sec63pそれぞれに対応すると予測される遺伝子が存在する．そこでわれわれは，これら遺伝子の機能を解析するため，RT-PCR法によってcDNAのクローニングを行なった．また，これら遺伝子はすべて，BiPと同様にその発現が小胞体ストレスを引き起こすツニカマイシン処理によって誘導されることがノザンブロット法によって示された．現在，これらの遺伝子が出芽酵母変異株の表現型を抑圧するかどうかについて検討している．

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シスタチオニンγ-シンターゼ (CGS) は植物におけるメチオニン生合成の鍵となる段階を触媒し、核にコードされ葉緑体に局在する酵素である。葉緑体に移行するにはN末端に葉緑体移行シグナルが必要である。また、CGSは第2エキソン以降の領域で酵素として機能し、第1エキソンはmRNAの安定性の段階で遺伝子発現のフィードバック制御に関与することが明らかになっている。特に、その中の十数アミノ酸からなる領域（MTO1領域）が重要であることが示されている。本研究では第1エキソンのどの部分が葉緑体移行に必要であるか、またCGS mRNAの安定性制御とどのような関わりがあるかについて調べることを目的としている。様々に欠失させたCGS第1エキソンとGFPの融合タンパク質をシロイヌナズナの葉に導入して一過的に発現させ、その細胞内局在を解析した。その結果、葉緑体移行には第1エキソン中央部の多くの植物で高度に保存されている領域とその前後の領域が関与しているが、その一部が欠けても移行は可能であることが明らかになった。また、葉緑体中のCGS第1エキソンとGFPの融合タンパク質のN末端アミノ酸配列を解析した。その結果、成熟タンパク質のN末端はMTO1領域の直後であった。このことから、CGSは酵素活性に不必要なmRNAの安定性制御領域を切り捨てて、葉緑体に移行すると考えられる。

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小胞体で合成されるタンパク質は正しくフォールディングされた後、小胞輸送により目的の場所へ運ばれる。ストレスなどによるフォールディング異常でBiPなどの小胞体シャペロンの遺伝子が誘導される現象は小胞体ストレス応答と呼ばれる。植物においては小胞輸送系に関する遺伝子も誘導される。植物における小胞体ストレス応答の分子機構を明らかにすることが本研究の目的である。酵母、動物の小胞体ストレス応答にbZIP型転写因子が関与することから植物でもbZIP型転写因子が関わるという予想のもとに実験をおこなった。シロイヌナズナのゲノム中に存在する75のbZIP型転写因子遺伝子に関して、小胞体ストレスを誘導する糖鎖合成阻害剤ツニカマイシンにより転写産物の大きさあるいは量が変化するものをRT-PCRにより探索した。その結果、顕著に発現量が増加する遺伝子を同定しAtbZIPERと名付けた。興味深いことにAtbZIPERはC末端側に膜貫通領域と考えられるドメインを有し、N末端側とGFPの融合タンパク質は核に局在したことからタンパク質レベルでの切断が活性化に関与する可能性が示唆された。GUSレポーター遺伝子を用いた組織化学的解析によりAtbZIPERは未熟な種子で発現していると考えられた。またT-DNA挿入による遺伝子破壊株においては、小胞体ストレス応答により誘導される小胞輸送に関わる遺伝子の発現が抑制された。

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貯蔵タンパク質は種子の登熟期に小胞体でプロ型前駆体として合成され，レセプター依存的にタンパク質蓄積型液胞に運ばれ，プロセシングを受けて成熟型になる．シロイヌナズナの選別輸送レセプターであるAtVSR1を欠損する変異体の種子では，貯蔵タンパク質の一部が前駆体となり細胞外に分泌される．本研究では，貯蔵タンパク質の前駆体を蓄積する新たな変異体A02とA03の解析結果を報告する．A02及びA03変異体の種子では，貯蔵タンパク質の成熟型とともに前駆体も蓄積していた．遺伝学的解析の結果，これらの表現型は同一遺伝子座に起因する劣性変異であることが判明した．電子顕微鏡観察の結果，これらの変異体の種子ではAtVSR1欠損変異体とは異なり貯蔵タンパク質の細胞外への分泌は見られなかった．一方，細胞質にはタンパク質蓄積型液胞とは明らかに異なる直径1μm程度の電子密度の高い構造体が多数蓄積しているのが観察された．興味深いことに，一部の構造体の周囲にはリボソームが付着しており，小胞体由来であると考えられた．免疫電顕観察で貯蔵タンパク質は，新規構造体の電子密度の高い部分には検出されず，その周辺または内部の電子密度の低い部分に検出された．現在，プロテオーム解析により，A02変異体と野生型の種子で存在量が異なるタンパク質の同定を行っている．

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Positron Emitting Tracer Imaging System (PETIS)は、¹¹CO₂, ¹³NO₃^-, ¹³NH₄⁺, ⁵²Fe³⁺等の形で植物個体に与えたポジトロン放出核種の体内分布を非破壊的に観測できる装置である。最大の特長は、オートラジオグラフィーなどの手法と異なり動画像（2次元 x時間）データが得られる点にある。これにより植物における物質輸送の動態を視覚的に理解することが容易になり、近年、様々な研究に利用されている。
本発表では、定性的な解釈にとどまらず、PETISデータからはトレーサーの移動速度や組織への分配比等の定量的情報が抽出可能であることと、そのための数理的解析方法および応用例を報告する。
動画像データから2つの位置を選び、各点におけるトレーサー量の経時変化を抽出し比較解析すれば、2点間の移動速度等を導くことができる。解析方法には伝達関数法を用いた。伝達関数とは、メカニズムが未知である系（ブラックボックス）の入力データと出力データを元に、系が行なった変換を数学的にモデル化したものである。これにより、ニラの葉身を移行する¹⁸F^-トレーサーの移動速度と損失の割合、ダイズの三出葉への¹⁸F^-、¹³NO₃^-トレーサーの分配比を求めた。さらに、¹¹CO₂を供給した植物体における光合成産物の移動を解析した最近の研究例も挙げ、将来展望を示す。

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　P23kは、発芽したオオムギ種子の胚盤に局在するタンパク質として同定され、その発現パターンから胚への栄養供給、すなわち物質転流に深く関与していると期待されている。しかし、P23kのアミノ酸配列中には機能推定に繋がるような既知ドメインは無く、転流過程における役割は推測の域を脱していない。また、胚盤以外の組織を使った解析を行っていないことから、P23kがオオムギの一生を通じて物質転流に関与しているか否かも不明のままである。
　そこで本研究では、様々な生育ステージのオオムギを用いてP23kの発現を解析し、物質転流との関連性を調べた。その結果、P23kは光合成能力を獲得した緑葉や登熟過程にある種子の珠心突起組織など転流の盛んな組織で発現していることが確認できた。これは、P23kと物質転流との関連性を強く示唆する結果であると推察される。さらに本研究では、転流におけるP23kの機能を解明するため相互作用因子の同定を試みた。BIACOREを用いた解析では、オオムギの細胞内にP23kと相互作用するタンパク質が存在することが確認できた。現在、免疫沈降法やtwo-hybridシステムを用いて当該タンパク質の同定を試みており、その結果についても報告する予定である。

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植物組織において、カドミウム（Cd）は有機酸、ペプチド、タンパク質といった物質と結合することが知られているが（Rauser, 1999）、篩管液中のCd結合物質に関しては詳しい調査がなされていない。
本研究では、Cdを含む合成培土で育てたイネから篩管液を採取した。篩管液はサイズ排除高速液体クロマトグラフィーで分画後、画分のCd含量を原子吸光法で測定した。その結果、篩管液中のCdのほぼ全てが何らかの物質に結合しており、その結合物質の分子量は10 kDa以下であることが明らかとなった。これらのCd結合物質に関してさらに情報を得るため、Cdを含んだHPLC画分についてマススペクトロメトリーによる分析を行った。

Rauser W.E. (1999) Cell Biochem. Biophys, 31; 19-48

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植物中の水は生長や物質輸送に直接関わっており、その動態を調べることは生命活動を理解する上で極めて重要である。水輸送において木部組織（特に導管）はこれまで受動的な水や無機イオンの通導組織と考えられてきた。しかしながら、最近になって、それら木部組織が、そこを経由する物質流を積極的に制御している可能性があるとの見解も報告されるようになった。そうしたことから、自然に活動している状態の植物中の水動態を直接計測する方法の確立が望まれてきた。本研究では、標識水の[¹⁵O]waterとポジトロン検出装置を併用することにより、非侵襲で植物茎中の水の流れをリアルタイムで定量的に計測する系を確立した。そして、その系を用い、播種後3weekのダイズ茎中1cmの水の動態を調べたところ、計測部位では導管より約20nl/sの水漏出が生じていることが分かった。この量は、茎から蒸散により失われる水を補える量であり、植物の水収支を考える上で無視できない量である。さらに、それら導管から漏出する流量は、蒸散流速度に依存することが示唆された。現在、導管漏出流が生じる機構に関しさらに研究を続けている。

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植物にとって太陽光は光合成を行うための唯一のエネルギー源であるが、過剰な光環境は葉緑体内部、さらには細胞質での傷害を引き起こす原因となりうる。植物はこういった環境に対して、転写制御を含むストレス防御機構を獲得している。光ストレスに対する転写応答へ至るシグナル伝達経路としては過酸化水素に依存する経路としない経路とが存在することが明らかになりつつある。本研究では両者の関係を網羅的遺伝子発現解析により調べたのでそれについて報告したい。発現解析にはシロイヌナズナのほぼすべての遺伝子を網羅したオリゴアレイを用いて、強光下における経時変化や光量に対する応答などを比較した。

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シロイヌナズナにおけるサイトカイニン応答情報伝達機構に関して、サイトカイニン受容体（AHK4/CRE1/WOL）が同定されたことでその理解が一挙に深まった。AHK4がヒスチジンキナーゼであることも含め、His-Aspリン酸リレー系がサイトカイニンに応答した初発情報伝達機構に深く関わっていることを示す多くの知見が蓄積しつつある。しかし、シロイヌナズナにおけるHis-Aspリン酸リレー系ネットワークは複雑であり、その分子機構や下流の情報伝達機構に関しては不明な点が多い。この点を解析するために、今回はシロイヌナズナT87培養細胞がサイトカイニン応答研究に利用可能かどうかを検討した。まずT87細胞の培養条件を適正化し、サイトカイニン処理によるタイプ-A ARR（His-Aspリン酸リレー制御因子）ファミリー遺伝子の誘導発現を解析したところ、サイトカイニンに応答した遺伝子発現が確認された。続いて、T87細胞を用いた形質転換系を検討・確立し、各種のARR::LUCトランスジーンをもつ安定な形質転換細胞株を樹立することができた。これらを用いた発光検出リアルタイム解析系においても、T87細胞のサイトカイニン応答性を確認できた。他の解析結果も踏まえ、T87培養細胞系を用いたサイトカイニン情報伝達機構解析の有効性に関して考察する。

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　バクテリア型リン酸リレー情報伝達機構が高等植物に存在することが明かとなり注目されている。我々は、シロイヌナズナにおけるリン酸リレー情報伝達機構が3つの因子群（AHKs, AHPs, ARRs）から構成され、サイトカイニンなどの植物ホルモン応答に関与することを示唆してきた。しかし、シロイヌナズナにおけるリン酸リレー情報伝達系の機能的ネットワークの全貌は不明である。ARR因子群はアミノ酸配列から大きくタイプAとタイプBに大別されが、ここではタイプBに属するARRに焦点をあてた。タイプ-B ARRは、レシーバードメインに加えDNA結合ドメインを持つことから転写因子として働き、サイトカイニン応答転写制御に関与すると考えられている。しかし、個々の特異的機能は明らかにされていない。そこで、まず11種類全てのタイプ-B ARRプロモーター::GUS融合遺伝子を導入した形質転換体を作製し、タイプ-B ARRの器官特異性および時期特異性など発現傾向の解析を行った。さらに、系統樹から見て比較的系統の遠い4種類のタイプ-B ARR（ARR11, ARR14, ARR20, ARR21）の過剰発現体の作成と解析を行った。また転写因子のターゲット遺伝子の解析を目的とし、ARR21過剰発現体のマイクロアレイ解析を行った。これらの解析結果からタイプ-B ARRの生理的機能およびリン酸リレー情報伝達機構における位置付け、さらにはサイトカイニン応答への関与について報告及び考察する。

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　植物におけるメチオニン生合成の鍵段階で働く酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ（CGS）は，メチオニン添加に応答してmRNAの安定性の段階でフィードバック制御を受ける．また，この制御機構においてCGS遺伝子の第1エキソン領域が必要十分な領域であることが明らかにされている．
　この制御機構に関わる因子を遺伝学的に同定することを目的として，CGS遺伝子の第1エキソンとGFP遺伝子を繋ぎ，これをCaMV 35Sプロモーターの制御下においた融合遺伝子を持つトランスジェニック・シロイヌナズナを構築した．この形質転換体はメチオニンを添加した条件下ではGFP蛍光は低くなるため，これを親株として高いGFP蛍光を示す突然変異株の分離を行った．実際に導入遺伝子の発現量が増加しており，さらに，導入遺伝子の第1エキソンに塩基置換は生じていなかった4株を分離した．このうちの候補株#57ではCGS遺伝子の発現量も増加していた．さらに，CGS遺伝子の第1エキソンとGUS遺伝子を繋ぎ，CaMV 35Sプロモーターの制御下においた融合遺伝子を一過的に発現させたところ，親株と比較してメチオニン非添加時でも2倍，メチオニン添加時では4倍のGUS活性を示した．以上のことから，候補株#57はメチオニン添加に対する応答が弱くなった突然変異株であると考えられる．

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自家不和合性は、柱頭と花粉の間の自己・非自己の認識反応により、自己の花粉の発芽、花粉管の伸長を阻害して自殖を抑制する機構である。本研究で用いるアブラナ科植物の自家不和合性は、1遺伝子座のS複対立遺伝子により支配されており、S遺伝子座上の柱頭側因子と花粉側因子の相互作用により誘起されると想定されている。これまでに柱頭側因子として受容体型キナーゼSRKが、また、花粉側因子として塩基性小型タンパク質SP11が同定された。そして、柱頭の細胞膜上に存在するSRKは同じS遺伝子座のSP11と結合すると、自己リン酸化し、そのシグナルを下流に伝達し、自家不和合性を誘起することが明らかとなった。しかし、リン酸化の後におこる乳頭細胞内での情報伝達系については明らかではない。自家不和合性反応の全容を明らかにするためには、和合・不和合受粉時におこる乳頭細胞内での生理反応を詳細に解析する必要がある。今回、乳頭細胞内の細胞骨格系が自家不和合性反応に関与するかどうかを明らかにするために、和合・不和合受粉後の柱頭を免疫染色し、アクチンと微小管の配行を共焦点レーザー顕微鏡により調べた。その結果、アクチンについて、受粉時に配行の変化がみられた。現在、アクチンの配行と不和合性反応との関連について解析中である。

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青色光による気孔開口や、アブシジン酸による気孔閉鎖にプロテインキナ－ゼが関与する事が明らかになっており、孔辺細胞のシグナル伝達にキナーゼが重要な働きを持つと考えられているが、その実体は不明の点が多い。
　私達は、孔辺細胞のシグナル伝達に関与するプロテインキナーゼの特質を知る目的で、ソラマメ孔辺細胞から植物SNF1関連キナーゼのSnRK3グループに属する遺伝子vfPK1を単離し、その機能解析を行っている。前回、vfPK1と相互作用するタンパク質を探索するため酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行った結果、カルシウム結合タンパク質をコードする遺伝子（vfCBL1）が得られ、vfCBL1が実際にvfPK1と相互作用してキナーゼ活性を上昇させ、この相互作用がカルシウムによって低下するということを報告した。今回、vfPK1に特異的な抗体を作成し孔辺細胞の各画分に対するウエスタンブロッテイングを行ったところ、vfPK1はミトコンドリア画分に多く存在することがわかった。この局在は孔辺細胞内に一過的に発現させたGFP融合タンパク質の観察でも確認できた。vfPK1はプロテアーゼ処理により消化されることから、ミトコンドリア外膜に存在することが示唆された。以上の結果から、vfPK1は孔辺細胞内におけるカルシウムの情報伝達に関与し、ミトコンドリアにおける何らかの代謝調節を行っていると考えられる。

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Calmodulin (CaM), a ubiquitous Ca²⁺ sensor in eukaryotes, modulates a number of target proteins in a Ca²⁺-dependent manner. We cloned 13 tobacco CaM genes (NtCaM1~13), which were subdivided into 3 groups. They showed different expression profiles and affinities to target proteins. To study CaM-mediated signal transduction after wounding or pathogen infection, we screened cDNA expression library, and identified mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphatase (NtMKP1) as a novel CaM-binding protein. Recombinant NtMKP1, expressed in E. coli, showed higher binding affinity to NtCaM1 and 3 than 13. Deletion and site-directed mutagenesis of NtMKP1 revealed that Baa motif located near the center was essential for binding to CaMs. Moreover, wound-induced activation of WIPK and SIPK, tobacco defense-related MAPKs, was compromised by overexpression of NtMKP1, suggesting the involvement of Ca²⁺/CaM signaling in MAPK activation via MAPK phosphatase.

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我々は、植物の乾燥ストレス応答機構を解明することを目的として、乾燥応答性転写制御因子であるRD26遺伝子の機能解析を行っている。RD26はNACドメインを含むタンパク質をコードしており、我々はこれまでに、RD26:GFP融合タンパク質の局在観察や酵母を用いた転写活性化実験によって、RD26タンパク質が核移行能を持つ転写制御因子として機能することを明らかにした。また、RD26過剰発現体を用いたマイクロアレイ解析を行い、RD26の下流遺伝子を同定した。本研究では、プロトプラストの一過的発現系を用いて、RD26が下流遺伝子のプロモーターを活性化させることを示し、RD26が植物細胞内でも転写因子として機能することを証明した。また、ストレスホルモンであるアブシジン酸 (ABA) 欠損変異体を用いた解析により、RD26遺伝子の乾燥応答性が主にABAによって制御されていること、さらに、RD26過剰発現体がABAに高感受性を示すことを明らかにした。現在、RD26欠失変異体、RNAiおよびリプレッションドメインを用いたRD26機能欠損変異体を作製し、RD26過剰発現体との表現型比較を行っている。これらの結果と合わせて、RD26がABAを介したストレスシグナル伝達において果たす役割について考察する。

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タバコのMAPキナーゼであるSIPKとWIPKは、サリチル酸、傷害、TMV感染など様々な刺激に反応して活性化されることが知られている。
本研究ではストレス応答性MAPキナーゼの解析をするために、N.benthamiana　を用いたアグロインフィルタレーション法による実験を行った。GST融合MAPキナーゼを発現するアグロバイナリーベクターを構築し、このベクターをもたせたAgrobacterium菌液をタバコ葉身に注入して、GST-SIPKおよびGST-WIPKの一過的発現を試みた。ウェスタンブロッティングによってタンパク質の発現が、それとともにゲル内リン酸化法によってGST-SIPK,GST-WIPKの活性化が確認できた。
健全な葉に紫外光を照射した場合ではSIPK,WIPKの分子量付近でキナーゼの活性化がみられた。更にアグロインフィルタレーション法を用いて解析を行った結果、GST-SIPK,GST-WIPKの活性化が生じていた。
以上により、タバコの紫外線ストレス応答時においてはSIPK,WIPKがシグナル伝達系の因子としての役割を持つことが示唆された。
現在、GST融合MAPキナーゼとその上流活性化因子候補分子を共発現させ、活性化メカニズムの解析を進行中である。また、紫外光を照射された植物体において、TMVを始めとする病原体抵抗性への影響についての解析を行っている。

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本研究室ではアラスカエンドウとアカパンカビにおいて、それぞれ赤色光、青色光照射後に NDKのリン酸化が上昇することをみいだした。本研究ではアラスカエンドウNDK-P1に対応するシロイヌナズナNDK1 (AtNDK1) をもちいて生化学的解析を行った。AtNDK1の機能を知る手掛かりを得るために、AtNDK1をbaitとした酵母 Two-hybrid 法のスクリーニングを行った結果カタラーゼ遺伝子群の一つAtCAT3 が候補として得られた。シロイヌナズナのカタラーゼ遺伝子群は3遺伝子より構成されており、AtCAT1,2 と AtNDK1 の相互作用も Two-hybrid 法により検出された。2次元 native-PAGE においても共分離が確認され、カタラーゼと NDK が生体内で複合体を作ることが示唆された。またAtNDK1 を異所的に発現させた AtNDK1-EX は野生型より有意に高いパラコート耐性を示した。
　In vivo でのAtNDK1のリン酸化様式が AtNDK1-EX や野生型と異なる 6XHis-AtNDK1^P93S を異所的に発現させた形質転換体のパラコート処理後の粗抽出液ではカタラーゼ のnative-PAGE 上での移動度が大きくなっていた。カタラーゼは酸化レベルにより native-PAGE での移動度が変化することが知られており。P93S 変異蛋白の異所的発現がカタラーゼの酸化レベルに影響を与える可能性が示唆された。

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PSKは植物細胞の培養液中に存在する分泌型ペプチドであり，細胞の増殖や分化を促進する活性を示すが，植物個体レベルでの本質的機能については未知の部分が多い．PSK受容体（PSKR1）はすでにニンジン培養細胞の膜画分から精製・クローニングされ，LRR-RLKであることが明らかとなっているが，アラビドプシスにはそのホモログが3種類（AtPSKR1, AtPSKR2, AtPSKR3）見出される．最もPSKR1と相同性の高いAtPSKR1をアラビドプシスで過剰発現させたところ，カルス由来の膜画分ではAtPSKR1発現量の増加にともない顕著なPSK結合活性の上昇が見られた．しかしながら，植物体では何らかの転写後調節が行なわれており，AtPSKR1はほとんど増加しなかった．AtPSKR1のノックアウト株は，in vitroではWTと同等の生育を示したが，自然環境下では葉が枯れやすく生育が抑制された．また，リーフディスクからのカルス形成がやや抑制された．植物が自然環境下で生育するためには，外界からの様々なストレスによってダメージを受けた組織を常に修復していく必要があり，局所的な細胞の脱分化・増殖・再分化が繰り返されているものと考えられるが，このような局面にPSKが関与している可能性が示唆された．現在，AtPSKR2, AtPSKR3についても解析を行なっている．

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青色光は孔辺細胞細胞膜H⁺-ATPaseを活性化して気孔開口を引き起こす。最近、私達は気孔開口の青色光受容体がフォトトロピンであることをシロイヌナズナのフォトトロピン変異体を用いて明らかにした。しかしながら、シロイヌナズナの孔辺細胞プロトプラスト（AtGCPs）を用いた青色光反応の解析は行なわれていない。本研究ではAtGCPsにおける細胞膜H⁺-ATPaseの活性化について調べた。まず、AtGCPsにおいて青色光（100 μmol/m²/s、30秒）によるH⁺放出反応を調べたところ、青色光照射開始から2分で最大となり6分程度持続した。次に、細胞膜H⁺-ATPase活性を調べると、青色光によりATP加水分解活性が増加していた。さらに、Far Western解析を行ったところ、青色光に依存して細胞膜H⁺-ATPaseへの14-3-3蛋白質の結合が認められ、細胞膜H⁺-ATPaseは青色光によりリン酸化され、そのリン酸化部位への14-3-3蛋白質の結合により活性化されることが推測された。一方、phot1 phot2二重変異体においては、青色光に誘導されるH⁺放出、細胞膜H⁺-ATPaseの活性化、14-3-3蛋白質のH⁺-ATPaseへの結合のいずれもが見られなかった。以上の結果は、AtGCPsにおける細胞膜H⁺-ATPaseの活性化には青色光受容体としてフォトトロピンが関与することを確証するものである。さらに、AtGCPsに発現する細胞膜H⁺-ATPaseアイソフォーム(AHA1-AHA11)を調べる目的でRT-PCRを行ったところ、全てのアイソフォームが発現していた。

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シロイヌナズナの光屈性は、青色光、UV-Aおよび緑色光によって誘導される。青色光による光屈性では青色光受容体フォトトロピン（phot1、phot2）の関与が示されており、詳しく解析されている。しかし、緑色光による光屈性の機構はほとんど明らかになっていない。そこで本研究では、各青色光受容体の突然変異体および光屈性突然変異体を用いて、光屈性を解析・比較し、緑色光による光屈性の機構を明らかにすることを目的とした。in　vitro で発現させたphot1は青色光とUV－Aを吸収するが、緑色光の吸収は報告されてない。一方、光形態形成等に関与する青色光受容体クリプトクロム1（cry1）は、青色光だけではなく緑色光を吸収する。そのため、光屈性における緑色光受容体の候補として本研究に用いた。phot1突然変異体は緑色光、青色光共に光屈性を示さなかったが、phot2、cry1およびcry2は野生型と同じ光屈性を示した。四重突然変異体（phot1／phot2／cry1／cry2）にphot1遺伝子を導入した植物体は、野生型と同じ光屈性を示した。また、光屈性突然変異体nph3は青色光、緑色光のいずれの光屈性も全く示さなかったが、rpt2は青色光では光強度反比例的に光屈性が弱くなる表現型を示すが、緑色光ではほぼ野生型と同じ表現型を示した。これらの結果から考えられる青色光と緑色光による光屈性の機構の違いを考察したい。

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　トマトの暗黒芽生えに光を当てると、フックが巻き込む（更に内側に曲がる）ことを我々は見出した。このフック巻き込みの促進には、赤色光（R）および遠赤色光（FR）のどちらも有効であった。すなわち、1）パルス照射の場合、Rによってフック巻き込みがおこり、この効果は、FRによってわずかに打ち消された。2）FRパルス照射も顕著なフック巻き込みを引き起こした。3）連続照射の場合は、RもFRも共にパルス照射よりも大きな巻き込みを引き起こしたが、4）phyA欠損mutantでは、FRのパルスおよび連続照射の効果が消失した。5）phyB1欠損mutantではパルス照射におけるR/FRの可逆反応は認められたが、連続照射において0.1 μmol m^-2 s^-1以下の光強度領域でのRの効果が減少した。これらの結果から、光によるフック巻き込み反応には、phyAを光受容体とするvery-low-fluence-responseならびにFR-high-irradiance-responseが関与するが、それに加え、phyB1がR-high-irradiance-responseに部分的に関わっている可能性も示された。今回は、これらフィトクロム反応におけるエチレンの関与についても報告する。

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　赤・遠赤色光可逆反応の光受容体として知られているフィトクロムにはPAS domainがタンデムに並んで存在しており、アラビドプシスの変異体解析から光応答反応において重要な役割を果たしていることが知られている。本研究では、溶液NMRを用いてイネフィトクロムBのPAS1 domain (L647-A782)およびPAS2 domain (L806-A923)の構造解析を試みた。
　まず、大腸菌発現系を用いて、¹³C /¹⁵ N安定同位体標識したPAS2 domainを大量発現及び精製し、NMR測定した。多核多次元NMRスペクトルを用いた連鎖帰属法により、主鎖118残基のうち1残基目を除く全ての残基において帰属が完了した。また二面角の情報を用いてTALOSによる二次構造解析を行なった。既に構造解析された他のPAS domainと比較して、イネフィトクロムB PAS2 domainは12%以下のアミノ酸配列相同性を示すにもかかわらず、非常に類似した2次構造のトポロジーを有していることがわかった。現在、PAS1 domainおよびPAS2 domainの構造解析を進めている。さらに、フィトクロムのC末端領域を介した2量体形成能に関して、PAS1 domainおよびPAS2 domainの自己会合、PAS1-PAS2間相互作用をNMRにより解析中であり、その結果も合わせて報告する。

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主要作物の中では一般的にオオムギは耐塩性が高く、イネは感受性である。外観的にも似たこれらイネ科植物間に見られる塩ストレスへの耐性機構の差異に関する知見を得るために、オオムギの塩ストレス応答性遺伝子群を用いたカスタムアレイを作製し、オオムギとイネにおける塩ストレス処理後初期（処理後1時間目と24時間目）における遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、オオムギでは多くの遺伝子の発現量が増加していたがイネでは少数の遺伝子のみが発現誘導されていた。またオオムギでは浸透圧調節に関係した遺伝子群の早い発現制御が見られたのに対し、イネでは見られなかった。一方で、イオンホメオスタシスに関連したいくつかの遺伝子は両種でともに発現誘導が確認された。さらにオオムギではいくつかのアミノ酸合成に関連した遺伝子群の発現誘導が確認されたが、イネでは発現が抑制されていた。このような塩ストレス処理後初期におけるストレス耐性に関与した遺伝子群の発現制御の差異が両種間に見られる塩ストレスへの耐性の差異を示唆していると考えられた。また一部の遺伝子についてリアルタイムPCRやタンパク質レベルでの発現量の差異を確認しており、本研究におけるアレイ解析の有効性が示された。

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タンパク質脱リン酸化酵素タイプ2C（PP2C）は酵母やシロイヌナズナ（ Arabidopsis thaliana）の研究から環境ストレス応答のシグナル伝達に関与していることが示されている。特にシロイヌナズナでは、アブシジン酸シグナル伝達に関与するABI1,ABI2が詳しく研究されている。我々は塩生植物アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）から11個のPP2C（Mpc1～11）を単離し、その中で全長のcDNAが得られたMPC2,6,8遺伝子に関して、シロイヌナズナに遺伝子導入して解析を行っている。MPC2の形質転換ライン3ラインの中で、2ラインは野生型と外見上同じような表現型を示したが、他の1ラインは野生型と比較して成長が遅いこと、種子ができにくいことが分かった。ノーザン解析の結果、野生型と同じ表現型を示したラインではMPC2遺伝子が過剰に発現していたのに対し、表現型の変化していたラインではMPC2のRNAが分解していた。また、MPC2遺伝子と配列相同性の高いシロイヌナズナ内在性遺伝子に関するノーザン解析の結果、表現型の変化していたラインでは分解しているRNAが確認された。以上の結果から、このラインの植物体ではco-suppressionが起こり、シロイヌナズナ内在性のMPC2相同遺伝子の発現が抑制されたために表現型が表れた可能性が考えられた。

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　適合溶質による浸透圧調節は植物にとって重要な環境適応機構の一つである。プロリンは適合溶質として広く生物に用いられている。我々はこれまでに、プロリン脱水素酵素をコードするProDH遺伝子が乾燥後の再吸水や低浸透圧及びプロリン処理により発現誘導されること、ProDH遺伝子の低浸透圧及びプロリン応答性シス因子がACTCAT配列であることを報告している。
　そこで、ACTCAT配列を介してProDH遺伝子を発現制御する転写因子の同定を試みた。シス因子データベースの探索から、ACTCAT配列にbZIPタンパク質が結合する可能性が示された。そこで、bZIPタンパク質がProDH遺伝子の発現を活性化するかを一過性発現実験により調べた。その結果、4つのbZIPから成るATB2サブグループがACTCAT配列特異的にレポーター遺伝子を活性化し、その活性化は低浸透圧処理により上昇した。ゲルシフト法による結合特性解析から、ATB2サブグループはACTCAT配列特異的なDNA結合特性を示した。細胞内局在性解析の結果、ATB2は核に局在した。シロイヌナズナにおけるATB2サブグループの遺伝子発現解析の結果、AtbZIP2/GBF5遺伝子とAtbZIP53遺伝子が低浸透圧処理の初期に一過的に発現誘導された。よって、ATB2サブグループがProDH遺伝子の低浸透圧応答性発現に関与する転写因子として機能することが明らかになった。

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　トレハロースはグルコース2分子がα,α-1,1で結合した、非還元性の糖質で、菌類、藻類、酵母、昆虫など自然界に幅広く分布している。トレハロースはエネルギー貯蔵体としての役割だけではなく、様々な環境ストレス、特に脱水、凍結、高温、活性酸素ストレスに対する保護物質として働いている。高等植物においては、トレハロース合成能力を持っているにもかかわらず、体内に顕著なトレハロースの蓄積がみられない。これはトレハロースを加水分解するトレハラーゼの存在が大きいと考えられる。私たちは、トレハラーゼのアンチセンス遺伝子をタバコに導入し、トレハラーゼ遺伝子の発現を抑えることによって、トレハロース蓄積タバコの作出を行い、環境ストレスに対する耐性評価を行った。
　形質転換体植物は、コントロールに比べてトレハラーゼ遺伝子の発現とトレハラーゼ活性の減少がみられ、トレハロースの蓄積が確認された。これらの形質転換体植物は、乾燥、パラコート処理に対して非形質転換体植物よりも高い耐性を示した。またトレハロース含有種子はNaCl存在下及び、高温処理後において、非形質転換体植物よりも高い発芽率が観察された。

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温帯性植物は、低温馴化過程において細胞内に適合溶質を蓄積し、耐凍性を獲得・向上させる。また越冬性の穀物には、2つの低温馴化ステージ（1st-phase：プラス温度域、および2nd-phase：マイナス温度域）が存在する。本研究では、2つの低温馴化ステージにおける耐凍性の変化と適合溶質の細胞内局在との関連を検討することを目的として実験を行った。材料として冬コムギ（Norstar）、および春コムギ（Haruyutaka）を用い、人工環境下でプラスおよびマイナス温度域での低温馴化処理を行い、耐凍性および適合溶質（糖・プロリン・ベタイン）の細胞内局在性を測定した。適合溶質の細胞内局在性は、葉組織をNonaqueous Fractionation法（Stitt et al., 1989）を用いて分画し、3つの細胞内画分（細胞質・液胞・葉緑体）について決定した。また、葉切片の透過型電子顕微鏡観察により細胞内画分の体積推定を行い、適合溶質の細胞内画分における濃度を推定した。その結果、1）適合溶質濃度は、2つの低温馴化期間を通じて、細胞質において最も高いこと、2） 2つの低温馴化処理によって、各細胞内画分の適合溶質濃度が急激に変動すること、3）しかし、その変動パターンは各細胞内画分、および品種間で異なること、が明らかになった。以上の結果を基に、耐凍性と適合溶質の細胞内局在性の変動、およびコムギの品種間差異について考察する。（本研究の一部は生研機構の援助により行われた。）

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　植物は、病原体の感染やサリチル酸のようなシグナル伝達化学物質によって、全身獲得抵抗性(SAR)が誘導され抵抗性を示すことが知られている。SARが誘導された植物では、抗菌活性や防御反応にかかわるpathogenesis-related （PR）たんぱく質やフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)の蓄積が起こっていることが報告されている。我々は、キュウリに2分間45°Cの浸漬処理を行い、高温ストレスを与え、PR8及び9遺伝子発現の定量RT-PCRやノザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。その結果、高温によってこれら遺伝子が誘導されていることがわかった。また、フェニルプロパノイド経路の鍵酵素遺伝子であるPALの発現も誘導されていることがわかった。さらに、接種試験を行ったところ、高温ストレスを与えたキュウリでは病原体の感染が抑制されることが明らかとなった。また、35°C及び40°Cの処理では抵抗性関連遺伝子の発現は見られなかった。この結果、キュウリでは、45°C高温ストレスによってSARが誘導されることが示唆された。

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　ブロムグラス培養細胞（Bromus inermis Leyss）は、低温処理やアブシジン酸（ABA）処理により耐凍性を獲得する。我々はブロムグラスの耐凍性機構を解明するために、低温処理やABA処理による遺伝子群の発現変化をイネのマイクロアレイを用いて解析した。前回大会では、低温やABA処理により発現が上昇する遺伝子群の中から10遺伝子をクローニングし、その発現などについて解析した結果を報告した。
　今大会では遺伝子産物の機能を推定するために、大腸菌の発現系を用いた活性の測定、および単離した遺伝子を導入した形質転換植物を解析した結果について報告する。

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　イネの多収を目的とした多窒素条件では，夏期の冷温による不稔が発生しやすい。これまでに多窒素条件では小胞子初期の冷温により花粉数が顕著に減少し，また柱頭上花粉数が充分でも稔実歩合が低いことを示してきた．これらのことは，体内の窒素条件により葯や花粉の冷温感受性が変化することを示唆している．この生理的メカニズムを明らかにするため，葯で発現するタンパク質を二次元電気泳動により網羅的に解析し，多窒素・冷温により変動する蛋白質を探索した．イネプロテオームプロジェクトにより，イネ葯蛋白質の二次元電気泳動像と同定された蛋白質が公開されている．このデータベースと照合した結果，beta-expansinは多窒素により減少し，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenaseは多窒素・冷温により増加した．

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低分子量熱ショックタンパク質（sHSP）は生物が熱などのストレスにさらされた時に発現が誘導される主要なストレスタンパク質である。高等植物では、細胞質や小胞体、ミトコンドリア、葉緑体に異なる分子種が局在し、分子シャペロン活性を持つことが明らかになっている。
我々はシロイヌナズナにおいて、ペルオキシソームへの局在が予想される新奇なsHSPとしてAtHSP15.7を見い出した。AtHSP15.7タンパク質はsHSPの保存領域であるαクリスタリンドメインと、C末端にペルオキシソーム輸送シグナルを持つ。本研究ではこのAtHSP15.7について、遺伝子発現解析、細胞内局在性の検討、および機能解析を行った。
まず、遺伝子発現パターンをRT-PCRによって解析したところ、AtHSP15.7は、高温ストレスによって発現が誘導されることが分かった。次に、細胞分画とイムノブロットを行った結果、高温ストレス処理したシロイヌナズナのペルオキシソームにAtHSP15.7の蓄積が認められ、AtHSP15.7がペルオキシソームに局在することが確認された。また、組換えタンパク質を用いたin vitro実験により、AtHSP15.7は化学変性したクエン酸合成酵素の高次構造の回復を助けることが明かとなった。これらの結果は、AtHSP15.7がペルオキシソームに局在し、分子シャペロンとして機能することを強く示唆する。

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コケ植物は熱帯から極地まで幅広く生育し、その中には極端な乾燥や凍結に対して耐性を持つ種が少なからず存在する。蘚類ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）の原糸体は、通常の培養条件では耐凍性を持たないが、アブシジン酸（ABA）処理によって高い耐凍性を獲得し、-80℃での凍結保存も可能になる。このことから、ABAが細胞の凍結脱水ストレス耐性に重要な役割を持つと考えられた。私たちは、ABA処理したヒメツリガネゴケ原糸体細胞において葉緑体や液胞の小型化、細胞内浸透濃度の増加および熱安定性タンパク質や可溶性糖の蓄積がおこり、凍結傷害の主要因である細胞膜の損傷が緩和されることを明らかにした。ABAで誘導される耐凍性上昇はシクロヘキシミド処理で著しく抑制されることから、この過程には核コードタンパク質の合成が必須であることが示された。
ヒメツリガネゴケの耐凍性上昇に関わる遺伝子を同定するため、フィルターアレイを用いたディファレンシャルスクリーニングによりABA処理で増加する60以上の遺伝子を単離した。その結果、これらの中にはLEAや水チャネルなどのように高等植物のストレス応答性遺伝子と相同性のあるものが多数含まれる一方、高等植物には保存されていない葉緑体タンパク質LI818や、UVI-1など原核生物遺伝子のホモログが新たに同定された。

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