日本植物生理学会年会およびシンポジウム 講演要旨集
第46回日本植物生理学会年会講演要旨集
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  • 伊藤 由加, 後藤 高紀, 秋山 満知子, 佐藤 義和, 山下 俊, 井上 英俊, 土屋 徹, 宮下 英明, 三室 守, 小林 正美
    p. 001
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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     酸素発生型の光合成では、光化学系I(PS I)に二次電子受容体(A1)としてキノンを有するが、PS I型の反応中心を持つヘリオバクテリアや緑色硫黄細菌では、キノンをA1として有するのかまだはっきりしていない。
     シアノバクテリアGloeobacter violaceus PCC7421は他のシアノバクテリアとは異なりチラコイド膜を持たず、細胞膜中に光化学系と呼吸系が共存する。この形態は、光合成細菌によく似ている。そのため、G. violaceusはシアノバクテリアの中でも最も古いと推定されている。本研究では、PS I型反応中心で機能する鍵色素の解明を目的として、G. violaceusのPS1の色素分析を行った。
     その結果、G. violaceusのPS IにはChl aの立体異性体であるChl a'が1分子存在し、P700としてChl a/a’ のヘテロダイマーを形成していることを明らかにした。また、キノンとしてはメナキノン-4(MQ-4)がChl a’ 1分子当たり2分子検出された。酸素発生型のPS IでA1として機能しているフィロキノンは検出されなかった。このことは、G. violaceusのPS Iが始原的であり、その祖先と考えられるヘリオバクテリアや緑色硫黄細菌にキノンがA1として機能しているなら、それはフィロキノンではなくMQ-4またはその誘導体だと強く示唆する。
  • 三野 広幸, 河盛 阿佐子, 青山 大輔, 鞆 達也, 岩城 雅代, 伊藤 繁
    p. 002
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    現在2.5A分解能で構造解析されている光化学系I反応中心の電子供与体P700はChlaとChla'(Chlaのエピマー)の2量体として形成されている。この酸化状態(P700+)でのENDOR(電子核二重共鳴)信号は、単量体Chla型のスペクトルに近いと報告されている。P700の周辺アミノ酸を置換した試料での実験結果にもとづきLubitzらはP700+では電子スピン密度がpsaBブランチ側のChla分子に大きく偏っていると推定している。
    Acaryochloris marinaはChldを主要色素としてもつシアノバクテリア型細菌で、その光化学系I反応中心クロロフィルP740は2分子のChldからなる。本研究ではP740+の示すENDOR信号を、P700+、Chla+, Chld+分子の信号と比較検討した。
     P700+とP740+のENDORスペクトルは、Chla+, Chld+スペクトル間の違いから予想される分子構造の違いに由来する大きな違い(例えばC2H3信号の有無など)を示した。しかし、それ以外の点ではP740+とP700+スペクトル間に本質的な差はなく、P740の構造と周囲環境が、P700の場合とよく似ていることを示している。 P700+とP740+の比較よりP700+での電子スピン密度分布は片側のChlaに80%局在していることが示された。
  • 伊藤 繁, 岩城 雅代, 中村 洋子, 三野 広幸
    p. 003
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    クロロフィルdを主要色素とするアカリオクロリスの単離チラコイド膜上の光化学系IとIIの電子供与体P740とP720の成分を、レーザ誘起後に得られる吸収スペクトル変化にもとづき解析した。
    (1) フェリシアナイド添加でP740を前もって酸化すると、半減期0.85ms(相対強度0.3)と0.03ms(0.7)の2成分からなる減衰を示した。差スペクトルは共に同じで671, 700, 725nmに正、684、715nmに負極大を示し、740nmには変化を示さず, DCMU感受性なのでP720の変化といえる。
    (2)これにNa-Ascorbateを加えP740を還元すると,負極大740nmで半減期4.4msの一成分、725nmで4.4(0.6)、0.85ms (0.4)とさらに速い成分の三相で減衰した。従ってP720+P740と推定された。
    (3) 差スペクトル(2)から(1)を引きP740だけの差スペクトルを得た。これは単離PSI反応中心で報告されたものとほぼ同じだった。
    「P740の差スペクトル」は、Chl d-スペシャルペア740nm帯の消失, Chl d-アクセサリー705nm帯の青移動、Chl a-アクセプター680nm帯の青移動として説明された。
    「P720の差スペクトル(1)」はChl d-725nm帯の消失、Chl d-721nm帯の青移動、Chl a- または Phe a-680、695nm帯の移動あるいは減少を示唆する。
  • 青山 大輔, 重永 高俊, 中村 洋子, 三野 広幸, 伊藤 繁
    p. 004
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    クロロフィルd (Chl d)を主要色素とし、5%程度のChl aを持つ酸素発生型の光合成原核生物Acaryochlorisのフィコビリン含量の違いと光化学系の関係を調べた。
    Acaryochlorisの光化学系I反応中心はすでに単離され、Chl dがアンテナ色素であるとともにスペシャルペアP740として働く事が分かっている(Q.Hu et al. 1998 PNAS)が、いまだ単離精製されていない光化学系IIについては不明の点が多く、フィコビリンと光化学系IIの量的関係もわかっていない。フィコビリン含量の異なるAcaryochloris種を培養し、光化学系I,IIの量比、活性、色素含有量を調べる事でこれらの問題を検討した。
    ESRによるYDとP740量の測定では、フィコビリンの少ない種は多い種に比べてChl dあたりPSII量が約2倍であった。PSIIだけから出る遅延蛍光強度も約2倍であった。これらの細胞の吸収スペクトル、蛍光スペクトルの測定からChl dの吸収帯も大きく違うことを見出した。チラコイド膜標品を界面活性剤で処理し、ショ糖密度勾配遠心で分離した画分の特徴を検討した
  • 河盛 阿佐子, 中澤 繁顕, 小野 高明, 原 英之, 鞆 達也
    p. 005
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    光化学系2の3重項は反応中心でなくアクセサリークロロフィル上に生成することは配向膜の磁場方向に依存するEPR信号の観測より知られている。アクセサリークロロフィルはD1とD2タンパク上にそれぞれ1個あり、いずれが3重項に関与してるかは
    結晶構造が報告された現在でも不明でえる。パルスEPRは電子伝達で生ずるラジカル対間の双極子相互作用を検出し、その周期がラジカル対間距離Rの3乗に比例することより距離決定に有効な手段である。
     本報告では、D1D2Cytb559反応中心複合体に受容体キノンDBIBMを導入し、これを還元してそのラジカルがレーザー光照射により誘起された3重項によりスピン偏極されたESEEMを生ずるので、これを観測して3重項からの距離決定を行った。
    得られた距離26 オングストロームはD1上のクロロフィルが3重項であることを
    X線解析結果とあわせて結論される。
  • 長谷川 浩司, 野口 巧
    p. 006
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    光化学系IIの第一電子供与体クロロフィルP680は、約1.2Vという極めて高い酸化電位(Eox)を持ち、この高い酸化力が、系IIにおける水の酸化による酸素発生を可能にしている。およそ27億年前に起った細菌型反応中心(PのEoxは約0.5V)から光化学系IIへの進化において、この高いP680の酸化電位が如何にして獲得されたかは、大きな謎として残されている。本研究では、量子化学的手法を用い、系II蛋白質におけるP680の高い酸化電位の原因を調べ、その進化の過程を推測した。密度汎関数法を用いて、溶媒の極性(誘電率:ε)とクロロフィルのEoxとの関係を求めたところ、ε>5の極性環境下ではEoxはほぼ一定値(~0.75)を示したが、ε<5の低極性環境下では、εが低くなるにつれ、Eoxは急激に上昇した。この関係から、理想的な疎水蛋白質中(ε=2)では、クロロフィルは1.5Vという極めて高い酸化電位を持つことが示された。このことは、クロロフィルは、無極性環境下では本来、水の酸化に十分な酸化力を持っていることを示している。実際に、P周りの極性残基の数は、紅色細菌に対し、系IIでは約半数に減っており、P680の結合部位の極性を下げることが、P680の酸化力上昇の最大の要因であったと考えられる。
  • 鈴木 博行, 長坂 将明, 杉浦 美羽, 野口 巧
    p. 007
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    光化学系IIにおいて、第二キノン電子受容体QBは、一電子還元によりセミキノンアニオンQB-となり、さらに二電子還元されるとプロトンを結合して蛋白質から遊離する。こうしたQBに関する反応機構の詳細は、未だほとんど解明されていない。昨年の年会において、我々は、酸素発生系II標品を用いたQB-/QBFTIRシグナルの測定を報告した。今回は、Mnを除去した系II試料を用いてほぼ純粋なQB-/QBFTIRスペクトルを観測し、さらに、重水素置換によって近傍アミノ酸側鎖の反応を調べた。Mnを除去した好熱性ラン藻Thermosynechococcus elongatusの系IIコア標品に、電子供与体を加え、一閃光照射によりQB-/QBFTIR差スペクトルを測定した。得られたスペクトルのCOOH振動領域(1760-1710cm-1)には、特徴的な1745cm-1の正のピークが現れた。このピークは、重水置換した試料においても低波数シフトを示さないことから、蛋白質のCOOH由来ではなく、近傍のフェオフィチン分子のC10=Oに帰属された。このバンドを含め、COOH振動領域のスペクトルは、重水置換によってほとんど影響を受けなかった。このことから、系IIでは、紅色細菌型反応中心の場合と異なり、QBの一電子還元により、近傍カルボキシル基のプロトン化は起こらないことが示された。
  • 杉浦 美羽, Fabrice Rappaport, Klaus Brettel, 野口 巧, A. William Rutherford, ...
    p. 008
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    光化学系IIにはredox activeなTyrZおよびTyrDがそれぞれD1およびD2タンパク質に存在する。これらはP680から約13 Åの対称な位置に局在し、それぞれの近傍にあるHisと水素結合している。TyrZはMnクラスターからP680へ電子移動を仲介するのに対し、TyrDの役割は不明である。
    本研究では、His189との水素結合を除去してTyrDをredox inactiveにする為に、D2-Tyr160をPheに置換した部位特異的変異体を作製し、特徴付けを行った。無傷で熱安定な試料を得るために、宿主細胞には好熱性ラン藻Thermosynechococcus elongatusを用いた。変異株の細胞増殖速度は野生株の約2倍遅かったが、S3→S0への酸素放出キネティクスは同じであった。P680+の5 ns毎の閃光照射に伴う吸光度変化測定では、PD1+PD2とPD1PD2+の平衡が左側へシフトしていることを示唆した。また、P680+/P680 FTIR差スペクトルでは、変異によってP680のカルボメトキシC=O伸縮振動のバンドが短波数へ約10 cm-1シフトしていた。更に、変異株のTyrZ→P680+への電子伝達速度は野生株の1.2倍速くなっていた。これらの結果から、TyrDはP680+の正電荷の平衡を制御してTyrZ→P680+への電子伝達速度をコントロールしているものと考えられる。
  • 水澤 直樹, 木村 行宏, 山成 敏広, 石井 麻子, 小野 高明
    p. 009
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    光合成酸素発生活性中心は4原子のMnと1原子のCaよりなる金属錯体であり、主としてD1蛋白質のアミノ酸残基が配位子となっている。D1蛋白質C末端アラニンのカルボキシル基はMnクラスターの配位子候補として提唱されている。 Mn原子は水の酸化分解過程で酸化・還元を受けるが、実際に個々のMn原子の酸化・還元が観測された例はない。本研究では、D1蛋白質C末端アラニンのカルボキシル基を特異的に13C同位体標識化したSynechocystis sp. PCC 6803光化学系IIコア標品を用いてS状態遷移に伴うC末端カルボキシル基の構造変化を光誘起フーリエ変換赤外吸収(FTIR)差スペクトルにより解析した。中赤外領域(1800-1200 cm-1)のS2/S1差スペクトルには、1360-1300 cm-1に同位体シフトを示すバンドが幾つか観察され、これらはMnイオンに単座配位したC末端カルボキシル基のバンドであると同定された。本バンドはS1→S2遷移で顕著に出現したが、S2→S3遷移ではほとんど変化がみられず、次のS3→S0遷移でS1→S2遷移とは符号が反転したバンドして再び出現し、S0→S1遷移では変化しなかった。以上の結果より、D1 C末端のカルボキシル基はMnクラスター中のMnイオンの単座配位子であり、このMnはS1→S2遷移で酸化されS3→S0遷移で還元されることが明らかとなった。
  • 木村 行宏, 山成 敏広, 石井 麻子, 小野 高明
    p. 010
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    光合成酸素発生複合体の触媒中心である光化学系IIマンガン(Mn)クラスターは、S0からS4の5つの酸素発生反応中間状態(S状態)を経て2分子の水を1分子の酸素に変換することが知られているが、その詳細な反応機構は明らかにされていない。低波数(1000-370 cm-1)赤外分光法はMnに配位する基質水分子由来の化学種の振動モードを直接検出することが可能であり、水の酸化反応機構を解明する上で非常に有力な手法である。本研究では好熱性ラン藻Thermosynechococcus elongatus光化学系IIコア標品のS状態間遷移に対応する低波数赤外吸収差スペクトルを測定し、各S状態間赤外吸収差スペクトルに対するH218O、D216O、D218O置換の効果について調べた。H216O、H218O、D216O、D218O置換試料のS状態間赤外吸収差スペクトルの詳細な比較から、S2/S1、S3/S2、S0/S3、S1/S0遷移に伴って変化する16O/18O交換でのみ変化するバンド、及びH/D交換でのみ変化するバンドが観測された。前者は主にMnクラスターの骨格振動、後者はアミノ酸残基やタンパク質に由来するモードであることが示唆された。さらに、16O/18O及びH/D交換で変化するバンドは光合成酸素発生反応に密接に関与したMnと基質水分子の相互作用に由来するモードであることが示唆された。
  • 伊福 健太郎, 山本 由弥子, 石原 靖子, 佐藤 文彦
    p. 011
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    一般に、光合成のエネルギ-変換に直接関わるタンパク質は葉緑体ゲノムにコードされており、その機能調節は核コードタンパク質により行われている。光化学系IIでは強力な酸化力を利用した水分解による酸素発生が行われるが、核支配の表在性タンパク質PsbO, PsbP, PsbQはその水分解-酸素発生反応を至適化するのに重要な役割を担っていると考えられている。これらのタンパク質に関して、これまで単離標品を用いた生化学的・構造学的解析がなされてきた一方で、変異体の単離やアンチセンス法による遺伝子発現抑制の困難さから、植物体におけるin vivoの生理機能に関する研究はほとんどなされていない。そこで我々は、RNAi法により上記3つの表在性タンパク質の発現抑制形質転換タバコ(psbOir, psbPir, psbQir)の作製を行った。psbOirとpsbPirタバコにおいては、糖含有培地においても顕著な生育の遅延と葉の緑色の退色が観察された。一方でpsbQirに関しては野生株とのみかけ上の差は観察されなかった。psbPirとpsbQirに関しては独立栄養的に生育することが可能であったが、psbPirは強光に対して著しい感受性を示した。現在、上記形質転換タバコに対するさらなる解析を進めている。
  • 石原 靖子, 山本 由弥子, 伊福 健太郎, 佐藤 文彦
    p. 012
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    複二倍体であるタバコ(Nicotiana tabacum)の光化学系II表在性23-kDaタンパク質(PsbP)は、配列相同性によりグループI (1A、5B)とグループII(2AF、3F)とに分類できる4つのpsbP遺伝子にコードされており、グループIIが主な成分として発現している。本研究では、タバコにおいて2つのPsbPが存在する生理的意義を明らかにする為に、RNAi法により作出したグループ特異的PsbP発現抑制タバコの解析を行った。グループII抑制株ではPsbPの総量が野生株の2-3割程度であり、生育の遅延や葉の退色などの表現型が観察され、かつFv/Fm値及び単離チラコイド膜の酸素発生活性が極端に低下していた。一方、グループI抑制株では、PsbP総量は野生株の6-7割程度に減少していたが、生育や外見は野生株と全く違いがなかった。しかしながら、そのFv/Fm値及び単離チラコイド膜の酸素発生活性は野生株の7-8割程度の値を示し、全てのPsbPメンバーが発現している事が、植物体内で最大の光化学系II活性を発揮するのに重要である事を示唆していた。現在、各グループのPsbPに機能的な差が存在する可能性を検討する為に、グループII抑制株にグループI強制発現遺伝子コンストラクトを導入し、グループIのみを過剰発現する形質転換タバコを作製した。同形質転換体の表現型について、現在解析中である。
  • 久保 美和, 坂本 亘
    p. 013
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    植物は重複受精をするため、花粉には受精までに2個の精細胞ができる。しかし、成熟花粉では1個あるいは2個の雄原細胞を持つ種があり、雄原細胞が1個の場合は柱頭への受粉後に分裂し2個の精細胞が形成される。このような「核性」の違いは近縁種でも異なることがあり、花粉寿命に関係するともいわれるが、詳しいことは不明である。これまでにシロイヌナズナ花粉のスクリーニングにより、雄原細胞が2個で正常な3核性花粉と、雄原細胞が1個で2核性の花粉が1:1に分離する変異体nikakuを単離した。遺伝解析の結果より、この変異は雌性配偶子には影響しない雄性配偶子致死変異であることがわかった。花粉以外の生長段階で、野生型と異なる形質は観察されなかった。2核性花粉は常に1:1の分離を示すことから、nikakuでは花粉第2分裂 (PMII)が特異的に阻害されていると推測された。また、2核性花粉における生殖核のDNA量は倍加していないので、nikakuはPMIIの初期に影響することが示唆された。2核性花粉が発芽するかどうかは興味深いので、現在解析を進めている。nikakuは3番染色体下腕にマップされ、花粉の核性を支配する遺伝子の1つであると考えており、マップベースクローニングによる原因遺伝子の単離を進めている。
  • 有泉 亨, 畠山 勝徳, 日向 康吉, 佐藤 修正, 加藤 友彦, 田畑 哲之, 鳥山 欽哉
    p. 014
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    T-DNAタギングにより、シロイヌナズナの雄性不稔変異体を単離した。この変異体では開花期における花糸伸長に欠陥が見られたものの、花粉の稔性は正常であった。つまり、雄性不稔性の原因は花粉自身ではなく、花糸伸長に起因していると考えられた。透過型電子顕微鏡を用いてWTと変異体のエキシンの発達過程を調べたところ、変異体ではエキシンの構成要素であるスポロポレニンの付着の足場となるプライムエキシンがほとんど形成されないことが明らかとなった。またスポロポレニンは作られるが、小胞子の細胞膜にランダムに付着していた。細胞膜に正常に付着できないスポロポレニンは凝集し、葯室内で顆粒様の構造として見られた。しかし、変異体では開花期には正常なエキシンが形成された。MOJYAO遺伝子をクローニングしたところ、ブラシノステロイド合成に関わるDET2遺伝子であると予想され現在確認を行っている。
  • 森藤 暁, 三木 大介, 秋山 昌広, 川原 美保子, 井澤 毅, 真木 寿治, 島本 功
    p. 015
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     我々は、DNA修復、DNA複製、遺伝的組換えなどに機能していることが知られるRAD2/XPGヌクレアーゼファミリーに属する新規な遺伝子(OsRAD)を単離した。OsRAD遺伝子のホモログは高等植物を含め、ヒトなど多細胞生物に存在しているが、それらの報告は現在のところなく機能は未知である。
     OsRAD遺伝子の植物個体レベルにおける機能解析のため、RNAiコンストラクトを導入した形質転換イネの発現抑制体を作製したところ、OsRAD遺伝子の発現の抑制が確認され、複数の系統で雄性不稔となった。雄性不稔の原因を解析したところ、表現型の強い系統において、減数分裂は正常で四分子が形成されるが、その後の小胞子が初期の段階で花粉へと成長せずに退化してしまうためであった。
     OsRADプロモーターgus融合コンストラクトを導入した形質転換イネにおいて、葯特異的な発現が検出された。 また、GFP融合OsRADタンパク質を一過的にタマネギの表皮細胞で発現させたところ、核に局在することがわかった。そして、大腸菌発現系でOsRADタンパク質の発現と精製を行い、このタンパク質が1本鎖DNAおよび2本鎖DNA結合活性をもつことを確認した。
     以上の結果から、OsRAD遺伝子はイネの小胞子の初期生育に重要な機能を持ち、小胞子の生育に必要な何らかの核DNA代謝に関与している可能性が考えられた。
  • 藤木 友紀, 吉本 光希, 大隅 良典
    p. 016
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    当研究室で同定した出芽酵母のオートファジー遺伝子群の一つATG6は、フォスファチジルイノシトール3リン酸キナーゼ(PI3K)複合体を構成するVPS30をコードする。植物でもPI3Kの阻害剤によってオートファジーの進行が停止することが近年報告されている。そこで植物におけるATG6の機能解析を目的に、シロイヌナズナATG6遺伝子についてT-DNA挿入変異体の単離を試みたが、ホモ変異体は得られなかった。しかし、ヘテロ接合体の次世代における野生型ホモとヘテロ接合体の分離比、及び野生株とatg6ヘテロ接合体の掛け合わせの結果は、異常の原因が雄性配偶体にあることを示していた。DAPIやアニリンブルー染色では花粉の形態に目立った異常は認められないが、in vitroで花粉発芽を観察したところ、atg6ヘテロ植物体の葯を用いた花粉の発芽率は、野生株の花粉と比べて低下していた。さらにqrt1変異体との交配で得たATG6/atg6/qrt1/qrt1植物体の花粉を用いた四分子解析の結果から、ATG6の欠損した花粉は発芽できないと考えられた。また、野生株でもPI3K阻害剤によって花粉発芽の阻害が起こることを確認している。以上の結果は、ATG6/VPS30を介したPI3Kのシグナリングまたは膜輸送が、花粉発芽に重要な役割を担っていることを示唆している。
  • 綿引 雅昭, Anthony J. Trewavas, Richard M. Parton
    p. 017
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    花粉管の伸長は一様ではなく速くなったり遅くなったりし(成長振動、タバコ花粉管の場合45秒)、それとともに先端部のカルシウム濃度が変化すること(カルシウム振動)が近年知られるようになった。われわれはカルシウムリポータータンパク質、Cameleonをタバコとユリ花粉管で発現させることでカルシウム振動をイメージングすることに成功し、成長振動との相関を確認した(Watahiki et al., 2004)。そこでカルシウム振動がどのような分子を介して花粉管の成長を制御しているのかを解明するため、花粉管で発現するカルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK又はCPK)をNicotiana plumbaginifoliaから単離同定した。NpCPK17cDNAとCFPの融合タンパク質を花粉管で発現させたところ先端部の細胞膜とvesicle cloudsに局在することが蛍光観察で判った。さらにNpCPK17-CFPの先端部での局在が成長振動と連動して変化する様子も観察された。これらの知見はカルシウムを介したタンパク質リン酸化と先端成長のフィードバック制御の可能性を示唆する。
  • 清水 徳朗, 遠藤 朋子, 島田 武彦, 藤井 浩, 吉田 俊雄, 大村 三男
    p. 018
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    果実の無核性は果樹品種の付加価値を決める重要な形質である。紀州ミカン‘平紀州’は有核性であるが、その変異種と考えられている‘無核紀州’(Citrus kinokuni hort. ex Tanaka cv. Mukaku Kishu)では受精しても接合体が発育しない結果、無核果実を生産する。 連鎖解析よりこの無核性には単一の優性遺伝子が関与していると考えられており、その特性を利用した無核性カンキツ品種がこれまでに育成されている。我々は受精胚の発育停止の分子機構を解明する目的で無核性遺伝子と連鎖が認められるDNAマーカーを得て連鎖地図上へのマッピングを進めている。今回、無核性の分子機構を明らかにする目的で、受精後8週間目の‘平紀州’、‘無核紀州’胚珠から抽出したRNAを用いて、suppression subtractive hybridization (SSH)法により両品種の胚珠で特徴的に発現している遺伝子の単離を試みた。MOS法により非特異的なcDNAをあらかじめ除き、正逆のそれぞれ約200クローンについて配列を決定した。クラスタリングにより各品種の胚珠に特異的と思われるクローンについて解析を進めており、その結果について報告する。
  • 風間 裕介, 小泉 綾子, 内田 和歌奈, Amr Ageez, 河野 重行
    p. 019
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
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    ヒロハノマンテマXY型の性染色体をもつ雌雄異株植物である。ヒロハノマンテマに黒穂菌が感染すると、葯には花粉ではなく胞子が形成される。雌花(XX)に黒穂菌が感染した場合でも雄蕊が誘導される。低真空SEMで観察すると、ステージ7までは正常雌と感染雌は同じで、中央に雄花よりも大きい雌蕊原基、その周りに雄蕊原基をつける。ステージ8では正常雌の雄蕊原基の伸長は起こらないが、黒穂菌感染雌の雄蕊は伸長する。形態観察に基づいて、各ステージにおけるB機能遺伝子PISTILLATAのオーソログ、SLM2の発現をin situ ハイブリダイゼーションで調べた。シロイヌナズナのPISTILLATAは雄蕊と花弁で特異的に発現する花形成遺伝子である。ステージ7までは、SLM2は、正常雌花と黒穂菌感染雌花ともに、予定花弁領域 (Whorl 2)と予定雄蕊領域(Whorl 3)で発現していた。ステージ8の正常雌花では、雄蕊の抑制とともに、SLM2の雄蕊原基での発現が抑制されていた。しかし、黒穂菌感染雌花では、雄蕊原基と花弁原基で同等のシグナルがえられた。黒穂菌感染雌花におけるSLM2の発現は擬似葯の成熟が完了するまで続いた。 正常雌花の雄蕊ではSLM2の発現が抑制され、その結果雄蕊の伸長が抑制されると考えられる。SLM2の発現抑制はY染色体の存在に関わらず黒穂菌感染によって解除されることが明らかとなった。感染雌の葯における雄性生殖器官の発達過程を調べるため、葯の成熟に関わる遺伝子群を単離している。
  • Amr Ageez, Yusuke Kazama, Ayako Koizumi, Shigeyuki Kawano
    p. 020
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    Two homeodomain leucine zipper (HD-Zip) genes were isolated and characterized from a cDNA library of the male flower buds of S. latifolia. Two genes, SlHDL1 and SlHDL2, encode proteins characterized as HD-Zip transcription factors. Seven cDNAs were isolated by cDNA subtraction of healthy male buds with the female buds infected with the dimorphic smut fungus Microbotryum violaceum. Five cDNAs are predicted to encode a chalcone-synthase-like protein, a glycosyl hydrolase family 17 protein, a proline-rich protein APG precursor, a strictosidine synthase family protein, and a mandelonitrile lyase protein. In situ hybridization showed that they are expressed in tapetum, tetrad and pollen grains between meiosis and microspore mitosis, timing that corresponds to a burst in tapetal activity in the developing anthers. The genes isolated will be useful for the isolation of tapetal-specific promoters, and revealing the interactions between the male-sterility restoration factor and the fertility related genes.
  • 青野 直樹, 小藤 累美子, 長谷部 光泰
    p. 021
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    花を形作る遺伝子が花を獲得する以前の植物でどのような役割を担っているかを明らかにすることは、花の進化を理解する上で重要である。花の形成に必須であるMADS-box遺伝子は花のないシダ植物やコケ植物でも発現していることが報告されているが、その機能は明らかとなっていない。我々は、遺伝子ターゲティングが容易なヒメツリガネゴケを用いて、コケ植物におけるMADS-box 遺伝子の機能を解き明かすことを目的として研究を進めている。
     セン類のヒメツリガネゴケには少なくとも13種類のMADS-box遺伝子が存在しており、遺伝子構造からMIKCc型とMIKC*型の2グループに分けられる。このうちMIKCc型MADS-box遺伝子であるPPM1、PPM2、PpMADS1に関して現在解析をおこなっている。各遺伝子の3’端にGUS遺伝子を挿入した系統を作出し、その発現を調べた。その結果、PPM1PPM2は茎葉体の茎頂、造精器、および胞子体で、PpMADS1は胞子体で発現していた。このことからコケMADS-box遺伝子が生殖および胞子体の発生に関与していることが示唆される。各遺伝子破壊株においてはこれまでのところ野生株との顕著な違いは検出できていない。現在、二重および三重変異株を作出中であり、これらの解析結果と併せて報告する。
  • Akiko Kozaki, Joseph Colasanti
    p. 022
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    The INDETERMINATE protein, ID1, plays a key role in regulating the floral transition in maize. ID1 is the founding member of a plant-specific zinc finger protein family that is defined by a highly conserved amino acid sequence called ID domain. The ID domain includes a cluster of three different type of zinc fingers separated from a canonical C2H2 finger by a long spacer; ID is distinct from other ID family proteins by having a much longer spacer.
    We determined the binding sequence of ID1 by in vitroDNA selection and amplification binding assays and analyzed the DNA binding properties of ID1 and ID family proteins. Our results demonstrate that maize ID1 and ID family proteins have novel zinc finger configurations with unique DNA binding properties.
  • 寿崎 拓哉, 鳥羽 大陽, 北野 英巳, 平野 博之
    p. 023
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     植物のシュートの頂端分裂組織や花分裂組織は,それぞれ葉や茎および花器官を形づくるために重要である.これまで,これらのメリステムの維持機構の解析は双子葉植物のシロイヌナズナを中心に進められてきた.しかし,シロイヌナズナを用いた研究から得られた知見が他の植物にも当てはまるかどうかは明らかになっていない.そこで,私たちは単子葉植物のモデル植物であるイネを用いて,イネのメリステムの維持機構の解析を行ってきた.イネのfloral organ number1 (fon1)変異体では花分裂組織のサイズの増大により,花器官数の増加が引き起こされる.私たちは,これまでに,FON1遺伝子がLRR型のreceptor-like kinaseをコードし,シロイヌナズナのCLAVATA1遺伝子のイネのオーソログであることを明らかにしてきた (Suzaki et al. Development 131:5649-5657, 2004).
     今回は,花器官数が増加するなどfon1変異体と類似した表現型を示すfon2変異体について,表現型の解析と原因遺伝子の単離とその機能解析を行った.これまでのFON1遺伝子の解析とともに,今回新たに得られた結果により,イネの花分裂組織の維持にCLAVATA シグナル伝達経路が保存されていることが強く支持された.さらに,イネとシロイヌナズナではメリステムの維持機構が一部異なっていることも示されたので,その違いについて考察する.
  • 漆川 直希, 高岸 愛, 村井 耕二
    p. 024
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    FLORICAULA/LEAFYFLO/LFY)は、双子葉植物のキンギョソウやシロイヌナズナにおいて、花芽運命決定遺伝子として花芽分裂組織の identity の決定を担っている。単子葉類のトウモロコシにおいても、FLO/LFYホモログであるZFLは小穂分裂組織原基および小花分裂組織原基で発現しており、花芽形成に関与すると考えられる。ところが、イネFLO/LFYホモログであるRFLはその発現パターンから見て、花芽形成ではなく枝梗形成に関与すると思われる。本研究では、トウモロコシやイネと同じイネ科に属する、しかし、穂の形態の異なるコムギにおけるFLO/LFYホモログの機能を解明するため、WFLWheat FLO/LFY)を単離し発現解析を行った。RT-PCRの結果、WFLは幼穂特異的に発現することが示された。また、in situ hybridization の結果、小穂分化期のコムギ幼穂では、将来、小穂原基となる二重隆起(double ridge)の上側の隆起での発現が抑制されることが明らかとなった。さらに発育の進んだ穎花分化期の幼穂では、発達中の内穎の基部でのみ特異的に発現していた。以上の結果は、WFLはイネと同様、花芽形成に関与するのではなく、穂分裂組織からの側性器官(コムギでは小穂)の分化形成に関与することを示唆する。さらに、WFLは内穎の形成にも関与することが考えられる。
  • 今井 章裕, 小村 水脈, 山本 興太朗, 高橋 卓
    p. 025
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    シロイヌナズナ花茎伸長欠損変異体acl5の原因遺伝子はスペルミン合成酵素をコードしている。ポリアミン(スペルミン、スペルミジン、プトレッシン)はあらゆる生き物の生体内に存在し、細胞分裂過程において重要な役割を持つことが知られているが、植物の形態形成にどのような機構で作用しているかは全く分かっていない。我々はこれまでにACL5と花茎伸長をつなぐ因子を探すため、acl5の抑圧変異体suppressor of acl (sac) 51d-54dを単離・解析してきた。本研究では、植物ホルモンの生合成欠損あるいは情報伝達異常による矮性形質がsac変異によって回復するかどうかを調べた。sac51d-54d変異をオーキシン情報伝達変異体axr2、ジベレリン情報伝達変異体gai、およびブラシノステロイド生合成欠損変異体dimに導入したところ、いずれにおいても花茎伸長の回復は見られなかった。このことから、sac51d-54d変異はこれらの植物ホルモンの作用とは独立にacl5変異体の花茎伸長欠損を回復させていることが示された。acl5では、もう一つのスペルミン合成酵素遺伝子SPMSによりスペルミンが合成されているため、それがsac変異による花茎伸長回復に利用されている可能性がある。そこで、スペルミンを全く合成しないsac acl5 spms三重変異体を作成して調べた結果も報告する予定である。
  • 桑原 明日香, 長田 敏行
    p. 026
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    水生異型葉植物Ludwigia arcuataは陸上では丸葉の気中葉を、水中では細葉の水中葉を形成する。これまでの解析から、3番目に若い葉は形態形成の可塑性を保持しており、この葉の基部は環境変化に応じて形態変化出来ることが示されている。本研究では、L. arcuataの葉形が横軸方向に配列する表皮細胞の数によって決定されることから細胞分裂に着目し、若い葉の基部が示す形態形成の可塑性の実体の解明を目指した。葉の横軸方向に並ぶ細胞数は、葉組織内での細胞分裂面の角度の分配に依存すると考えられる。L. arcuataではエチレンによって葉の横軸方向に並ぶ表皮細胞の数が減少することから、エチレンが葉組織内での細胞分裂面の角度に影響を与える可能性を検討した。葉組織内での形成直後の隔壁を検出し、葉の長軸方向に対する隔壁の角度を計測した。葉の全体で見ると、エチレン添加後48時間目から、葉の長軸と平行な細胞分裂面の割合が減少することが明らかになった。葉の部位ごとに見ると、葉の基部では葉の長軸に直角な細胞分裂面の割合が増加する一方、葉の中央部付近では葉の長軸に平行な細胞分裂面の割合が減少していた。エチレンに対する応答が葉の部位によって異なるのは興味深い減少である。このようにL. arcuataではエチレンによって細胞分裂面の方向が制御を受け、葉形が決定されることが明らかになった。
  • Ken Haga, Makoto Takano, Moritoshi Iino
    p. 027
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    The cpm1 mutant of rice is impaired in phytochrome-mediated inhibition of coleoptile growth and in the process of anthesis causing partial sterility (Biswas et al., 2003). The CPM1 locus was mapped to a 143cM region of chromosome 3, in which the ALLENE OXIDE SYNTHASE1 (AOS1) gene is located. The cpm1 mutant was found to have a point mutation in this gene, which is expected to alter one of the amino acid residues conserved in all the reported AOSs. We complemented the cpm1 mutant with the OsAOS1 genomic DNA that included the promoter region. The complemented mutant recovered the phytochrome response and complete fertility, demonstrating that OsAOS1 corresponds to CPM1. The cpm1 mutant had a normal level of OsAOS1 transcripts. It is expected that the mutated protein has a reduced enzyme activity. This possibility is now under investigation. We will also discuss the role played by OsAOS1 in photomorphogenesis.
  • 谷本 英一, 本間 知夫, 阿部 淳, 森田 茂紀, 松尾 喜義, ルックス アレキサンダー, ルクスソーバ ミロスラーバ, 稲永 忍
    p. 028
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    ジベレリンが葉条の栄養成長と開花を制御することは古くから多くの植物で知られており,また,根の伸長と肥大も制御することがいくつかの植物で報告されている。しかし,これらの知見の多くは,草本で得られたもので,木本での知見は少ない。そこで木本の成長にジベレリンがどの程度制御機能を果たしているかを明らかにするため,水耕栽培系で育てたチャノキ(Camellia sinensis cv. Yabukita) を用いて成長観察を行った。
     葉条の成長は根から与えたジベレリンによって促進され,ジベレリン合成阻害剤アンシミドールによって抑制された。根の成長は,アンシミドールによって抑制され肥大が起こり,ジベレリンが共存するとその効果は消失した。このようなジベレリンとアンシミドールによる肥大制御は主に皮層細胞の肥大によって起こっていた。ジベレリン単独では,根が細くなる傾向は見られたが,大きな伸長促進はみられなかった。これらの栄養成長の制御は,エンドウなどでみられる成長制御様式と同様であった。
     一方,アンシミドール処理によって花芽の誘導が強く促進された。顕著な場合には,処理を始めてから成長し始めた側芽が,すべて花芽に分化した。ジベレリンによるこのような花芽の誘導や葉条の成長制御は,交配など実生による繁殖の効率上昇や茶葉生産に有用かもしれない。
  • 朝比奈 雅志, 山口 信次郎, 山内 雪香, 神谷 勇治, 鎌田 博, 佐藤 忍
    p. 029
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    キュウリ、トマトの胚軸を用いた以前の我々の研究から、傷をつけた胚軸の皮層は切断後7日間で癒合すること、癒合過程の細胞分裂に葉からのジベレリンが必要であることが示された。本研究では、組織癒合に関わる遺伝子の機能解明を目的として、シロイヌナズナ切断花茎を用いたマイクロアレイ解析を行った。シロイヌナズナ花茎の第一または第二節間を、マイクロナイフを用いて半分まで切断処理を行い、一定時間後に切断部の上下約2-5mmの花茎を切り出し解析に用いた。その結果、非切断部の花茎と比較して二倍以上の発現上昇を示した遺伝子は、切断後1日目の花茎では621、3日目では773、5日目では663遺伝子であった。データベースを用いて、これら遺伝子を機能別にグループ化し、機能解析を行った。細胞分裂、細胞壁に関わる遺伝子に注目して解析を行ったところ、DNA合成、細胞周期の調節に関わる遺伝子は、主に切断後3日目の花茎で発現上昇が認められた。細胞壁に関わる遺伝子は、いずれの切断花茎でも発現が認められたが、細胞伸長・細胞壁多糖分解に関与すると予想される遺伝子は、主に切断後3、5日目で認められた。また、種子発芽時にジベレリンで発現が誘導される遺伝子との比較を行ったところ、発現が誘導された遺伝子のうち、3日目では26、5日目では24遺伝子が一致した。これらの遺伝子のうち、1/3~1/2が細胞分裂・伸長に関わる遺伝子であった。
  • 鈴木 一, 石山 賀奈子, 小林 正智, 小川 俊也
    p. 030
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    発芽オオムギより調製したRNAから、活性型GA(GA1)合成の最終ステップであるgibberellin 3β-hydroxylase(HvGA3ox)をコードするcDNAを取得した。大腸菌内で発現させたHvGA3ox-cDNAは、GA9、GA20をそれぞれ、GA4、GA1に変換する活性が認められた。取得したHvGA3ox-cDNAの推定アミノ酸配列は、最近Spielmeyerらによって報告された、HvGA3ox2と同一であった。HvGA3ox2の発現を、生育段階の各組織を用いて検討したところ、発芽時にのみ特異的に発現が認められた。発芽時にGA3、およびGA生合成阻害剤であるウニコナゾールによる処理を行いHvGA3ox2の発現を検討した所、顕著な発現変動は認められず、典型的なfeedback阻害は受けていないことが解った。発芽種子におけるHvGA3ox2の発現を詳細に解析したところ、Amy1発現に先立って、吸水後12時間で認められ、少なくとも吸水後3日目まで検出された。また、種子中の発現部位を、In situ hybridizationにより検討したところ、HvGA3ox2は胚盤上皮細胞でのみ発現することがわかった。これらの結果から、オオムギ発芽時の胚盤上皮細胞におけるGA合成が、Amy1発現に重要であり、HvGA3ox2の発現はそのGA合成に重要な働きをしていることが強く示唆された。
  • 辻 寛之, 上口(田中) 美弥子, 芦苅 基行, 北野 英己, 松岡 信
    p. 031
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    GAMYBは当初オオムギ胚乳においてジベレリン(GA)依存的にα-amylaseを活性化させる転写因子として見いだされ、現在までにその生化学的な特徴が精力的に解析されてきた。発表では、GAMYB及び類似のドメインを持つGAMYB-likeタンパク質両者の植物生長に対する機能やその制御について報告する。私たちは、GAMYB及びGAMYB-like遺伝子のmRNA配列中に、microRNAの一つmiR159の標的部位を見いだした。miR159を過剰発現する形質転換イネを作成したところ、これらの遺伝子のmRNAが減少し、gamyb変異体と同様の表現型及びそれよりシビアな表現型が花の形成や節間伸長において観察された。これらの結果から、GAMYB及びGAMYB-like遺伝子は共に花の形成および節間伸長に必須であり、これらの発現はmiR159による制御を受けていることがわかった。次いで、胚乳におけるこれらの遺伝子の機能を調べるため、gamyb変異体の胚乳を用いたマイクロアレイ解析を行ったところ、変異体ではほぼすべてのGA応答性遺伝子の発現がGAに応答出来なくなっていた。この結果から、花や節間と異なり、胚乳ではGAMYB単独でほぼすべてのGA応答性遺伝子を直接・間接に制御していることが明らかとなった。
    本研究の一部は生研機構の支援を得て行った。
  • 石田 さらみ, 湯淺 高志, 高橋 陽介
    p. 032
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    RSGはジベレリン(GA)内生量調節に関与するbZIP型転写活性化因子である。植物体においてその機能を阻害するとGA内生量が著しく低下し矮化形質を示す。これまでの解析により、1)真核生物に広く保存された制御因子、14-3-3タンパク質とリン酸化された114番目のセリン残基(S114)を介して相互作用すること、2)14-3-3タンパク質はRSGと結合するとRSGの核局在を阻害すること、3)RSGは14-3-3により細胞質に静的に拘束されているのではなく、核-細胞質間を高速にシャトルしていること、4)GA欠乏によりRSGは核に輸送され、GA刺激により核外に排出されること、5)この過程にタンパク質の分解は伴わないこと等を明らかとしてきた。GA刺激を受容しても14-3-3タンパク質と結合できない変異体RSGは核外に排出されないことから、GAによるRSGの細胞内局在変化には14-3-3タンパク質が関与することが示唆されている。この結果から、GA刺激によりRSGのS114のリン酸化状態が変化すると推測された。これを実証するため、S114がリン酸化されたRSGを特異的に認識する抗体を作成した。この抗体は、非リン酸化RSGとは交差しない。この抗体を使った解析の結果、GA内生量上昇により核外へ輸送される過程において、RSGのS114のリン酸化が経時的に亢進することが明らかとなった。
  • 山内 雪香, 小川 幹広, 桑原 亜由子, 花田 篤志, 神谷 勇治, 山口 信次郎
    p. 033
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    種子の休眠と発芽は様々な外的、内的要因により制御されている。我々は今までに、光や温度等の環境要因が内的要因であるジベレリン(GA)の生合成および不活性化を調節し、シロイヌナズナ種子の発芽制御を行っていることを明らかにした。赤色光は、GA生合成酵素遺伝子AtGA3ox1およびAtGA3ox2の発現を誘導するが、GA不活性化酵素遺伝子AtGA2ox2の発現を抑制する。これらの遺伝子のmRNAは、主に胚の皮層に局在する事から、皮層は活性型GAの内生量の調節に重要な部位である事が示唆された。また、AtGA3ox1は4 - 8℃の低温で、AtGA2ox2は常温(22℃)でmRNAレベルが高いことから、低温処理時の活性型GAの増加はGA生合成および不活性化の両ステップが関わっていると考えられる。最近、我々は活性型GA生合成の中間体GA12を基質とし、GA不活性化に働くGA 2-oxidaseをコードする新たな2つの遺伝子を同定した。これらの遺伝子の一方は種子の低温処理時にその発現が抑制されていることから、温度による活性型GA量の調節に働いていることが示唆された。以上の結果から、環境要因によるシロイヌナズナ種子の発芽制御には、GA生合成と不活性化の複数のステップが関わっている事が示唆された。
  • 伊藤 博紀, 佐々木 章江, 上口(田中) 美弥子, 芦苅 基行, 松岡 信
    p. 034
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    我々はイネ変異体を用いてジベレリン(GA)シグナル伝達の解明を目指している。今までに、GAシグナル伝達の抑制因子であるSLR1が、SCFGID2複合体を介してGA依存的に分解されることを明らかにした。さらに、F-box機能欠失変異体gid2において、リン酸化SLR1 (SLR1-P) がGA依存的に蓄積すること、DEAEカラムで分離したSLR1-Pが特異的にGID2と結合することから、SLR1のGA依存的リン酸化が分解の引き金になる可能性を提案した。今回は、SLR1のリン酸化部位を特定するとともに、上記の仮説の是非について考察した。
     32Pでin vivoラベルしたSLR1の分析からセリンがリン酸化されること、形質転換体の解析からリン酸化部位は、polyS/T/VとDELLAおよび(もしくは)TVHYNP領域に複数存在していることが解った。一方、1.gid2におけるSLR1-Pの蓄積は、GAによるSLR1の転写活性化に起因する 2.GA生合成変異体でもSLR1-Pは存在する 3.リン酸化阻害剤はSLR1の分解を阻害できない 4. DEAE分画後SLR1-PをCIAP処理してもGID2に対する結合能は維持される、等の結果から、SLR1のリン酸化はGA依存的分解に必須ではないと結論した。ただし、4.の結果からリン酸化以外の修飾もしくは、立体構造変化の重要性を考えている。本研究の一部は、生研機構の支援で行われた。
  • 島田 麻子, 伊藤 博紀, 上口(田中) 美弥子, 神谷 紀子, 芦刈 基行, 松岡 信
    p. 035
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    イネSLR1 (SLENDER RICE 1) 遺伝子は、DELLAタンパク質をコードしている。DELLAタンパク質は、GRASファミリーに属しジベレリン (GA) シグナル伝達のリプレッサーとして機能する。恒常的GA反応性変異体slr1の徒長表現型から、SLR1は、イネにおいて唯一のDELLAタンパク質型のGAシグナル抑制因子と考えられた。しかしながら、イネDNAデータベース検索の結果、イネゲノム中には、SLR1の相同配列SLR1-like (SLRL)が存在していることが新たにわかった。SLRLは、DELLAモチーフを持たないが、その一次構造は、DELLAタンパク質であるSLR1のC末端側と高い相同性を示した。SLRLタンパク質を過剰発現する形質転換イネは、矮性表現型を示し、OsGA20ox2遺伝子の発現が高くなっていた。従って、SLRLは、GAシグナルの抑制因子として働くと考えられた。また、SLRLは、GAレベルにより転写量が正に制御されており、生殖器官でより発現していた。これらの結果から、イネGAシグナル伝達におけるSLRLの役割について議論する。
    本研究の一部は、生研機構基礎推進事業の支援で行われた。
  • 松下 茜, 松永 祥子, 金本 理沙, 高橋 陽介
    p. 036
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    植物ホルモンであるジベレリンは植物の成長のさまざまな局面で作用する。したがって植物はジベレリンの内生量及びシグナル伝達を適切に制御していると考えられる。ジベレリン合成に関わる酵素のうち、ジベレリン3酸化酵素は活性型ジベレリンの合成の最終段階を触媒するため、ジベレリンの内生量の制御に特に重要である。実際にこの酵素の遺伝子発現は内生ジベレリン量に応じて負のフィードバック制御を受けることが知られている。我々はシロイヌナズナのジベレリン3酸化酵素遺伝子であるAtGA3ox1を用いて、この負のフィードバック制御の分子機構を解析している。まず5'欠損AtGA3ox1プロモーターを用いた解析により、負のフィードバックに必要なシス領域を決定した。このシス領域は最小プロモーターに結合することでジベレリンによる負のフィードバック制御を付与できた。次に、酵母1-hybridスクリーニングにより、このシス領域に結合するトランス因子として新奇AT-hookタンパク質を同定した。このAT-hookタンパク質は酵母内で転写活性化因子として機能し、またダイマーを形成した。さらにゲルシフト解析によりin vitroで上記シス領域にAT-hookタンパク質が特異的に結合することを確認し、結合に必要な塩基配列を明らかにした。
  • 児玉 悠一, 長屋 進吾, 新名 惇彦, 加藤 晃
    p. 037
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    シロイヌナズナにおけるクロマチン構造の凝集度合いと遺伝子発現との関係を解析するため、DNase I感受性を80 kbの染色体領域に渡り500 bpの解像度で評価した。このゲノム領域は葉において様々な発現レベルを示す30個の遺伝子を含んでいるが、全体的なDNase I感受性はすべての領域でほぼ同程度であった。しかし、興味深いことに、ほとんどの遺伝子の両端にDNase I高感受性部位(DNase I HS)が発現レベルに関わらず見出された。このDNase I HSが存在する意味、役割を調べるため、発現様式がよく調べられているHSP18.2H4PCNA1ADHV-ATPase遺伝子周辺のDNase I感受性を発現状態の異なる細胞で比較した。ADH遺伝子以外のプロモーターには発現状態にかかわらずDNase I HSが検出された。また、HSP18.2遺伝子のクロマチン構造を解析したところ、転写活性化に伴いDNase I HSが下流に広がることが認められた。一方、ADH遺伝子プロモーターについては、ABAにより転写誘導されない葉ではDNase I HSは存在しておらず、転写誘導される培養細胞や根では存在していた。同様に、ABAで誘導されるRD29b遺伝子プロモーターにはDNase I HSが存在しており、葉で誘導されないAt2S3遺伝子プロモーターには存在していなかった。以上の結果をまとめると、DNase I HSは遺伝子発現のポテンシャルを制御しているという可能性が考えられる。
  • 大濱 武, 山崎 朋人
    p. 038
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    Chlamydomonas reinhardtiiにおいて hairpin dsRNAを転写するように設計したinverted repeat DNA constructを導入することでRNAiを誘起することに成功した。標的遺伝子としてspectinomycin耐性賦与遺伝子aadAを、silencerとしてaadAのinverted repeatを用いた。しかし、RNAiによる標的遺伝子の不活性化は不完全で、かつ体細胞分裂を経るにしたがってRNAi効果が弱くなった株が増えた。300 micro g/mLのspc 含有プレートで生育可能であった元株は、RNAiの誘起によって、60 micro g/mLのspc 含有プレートが生育限界となった。しかし、30-50回の体細胞分裂後には、200 micro g/mLのspc 含有プレートでも生育可能となった細胞が約5%現れた。生育限界のの変化はdsRNA、siRNAの量に反比例し、dsRNA量の変化は、inverted repeat部分のシトシンへのメチル化の程度と相関関係があった。Target のaadA遺伝子では、メチル化が検出されないことからInverted repeat部のDNAメチル化はDNA-DNA interactionによってシスに引き起こされたと考えられる。このInverted repeat部のメチル化の程度が細胞分裂を繰り返す間に、細胞間でバラツキを生じ、ヒストン修飾を介したsilencerの発現量の差が顕著になったと考えられる。また、RNAi 効果が不完全で不安定な事からC. reinhardtiiではRNA dependent RNA polymeraseによるsilencer RNAの増幅やRNA dependent DNA modificationの機構は存在しない可能性が高い。
  • 大平 高之, 土本 卓, 大沢 勇久, 大坪 栄一, 大坪 久子
    p. 039
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    p-SINE1はRNA ポリメラーゼ III (pol III) によって転写されるイネのレトロポゾンである。我々は以前、 p-SINE1転写産物量がDNA メチル化阻害剤処理で顕著に増加することを示した。これは p-SINE1の発現抑制に DNA メチル化が関与することを示唆する。 p-SINE1転写産物と同じ配列を持つメンバーのDNAメチル化を調べたところ、p-SINE1配列特異的に、CG配列のみならずそれ以外の配列のシトシンも強くメチル化されていることがわかった。このメチル化の特徴は、short interfering RNA (siRNA)の関与する RdDM (RNA-directed DNA metylation)によるメチル化に類似している。そこで本研究では、p-SINE1 の発現制御へのsiRNAの関与を調べることを目的として、siRNAの解析を行った。その結果、p-SINE1由来のsiRNAがイネ細胞中で生じていること、及び細胞をDNAメチル化阻害剤処理すると、p-SINE1転写産物量の増加に伴い、siRNA量が顕著に減少すること、がわかった。これらの結果はsiRNAがp-SINE1の発現制御に関与していることを示唆する。
  • 平栗 章弘, 伊藤 陸, 近藤 直子, 野村 泰子, 村井 祐介, 福原 敏行
    p. 040
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    2本鎖RNAに特異的に結合するタンパク質が様々な生物で発見されている。RNAサイレンシングに関与するDICERなどもその例であり、2本鎖RNA結合モチーフ(dsRBM)を含んでいることがわかっている。我々は、シロイヌナズナにおけるdsRBMを持つタンパク質(DCL1-4, HYL1/DRB1, DRB2, DRB4, DRB5)の生化学的な解析を行った。これまでに、DCL1, DCL3, HYL1/DRB1ファミリーのタンパク質が実際に2本鎖RNAに結合することを報告した。
    既知の動物における2本鎖RNA結合タンパク質は、dsRBMを介して相互作用することが知られている。そこで、ファーウェスタン法によって相互作用活性を解析した結果、DRB4はDCL4と、HYL1/DRB1はDCL1と特異的に強く結合した。また、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在の解析によって、DRB4、DCL4、HYL1/DRB1、DCL1はすべて核に局在することが示された。
    これらの結果は、HYL1/DRBファミリーの2本鎖RNA結合タンパク質がDICERと相互作用することでDICERの機能を調節している可能性を示唆している。現在、免疫沈降法によって生体内での相互作用を解析しており、その結果もあわせて報告したい。
  • 岡野 陽介, 三木 大介, 島本 功
    p. 041
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     近年、分裂酵母とシロイヌナズナにおいて、内在性siRNAのシグナルが、セントロメアやトランスポゾンのヘテロクロマチン形成に関与していることが示唆されている。しかし、これらsiRNAのエピジェネティックな影響に関する知見は、非常に乏しいのが現状である。
     そこで、本研究では、siRNAのエピジェネティックな現象をさらに解析するため、プロモーター領域のsiRNAを高発現する形質転換イネを作出した。本研究では、標的遺伝子に、外来遺伝子である35S::GFPと、内在遺伝子として、恒常的に発現しているOsRacを用いた。その結果、35SプロモーターのsiRNAは、標的35S::GFPの顕著なサイレンシングを誘導したが、OsRacプロモーターのsiRNAは、標的OsRacのサイレンシングを誘導しなかった。続いて、siRNAが誘導するエピジェネティックな影響を調べたところ、興味深い結果が得られた。それは、de novo DNAメチル化は、35S::GFPOsRac、どちらの標的プロモーターDNAにも誘導されていたが、ヒストンH3の脱アセチル化およびK4ジメチル化は、顕著にサイレンシングしている35S::GFPの標的プロモーターにのみ観察された。 これらのことから、siRNAのエピジェネティックな影響において、外来遺伝子と内在遺伝子の間には、ヒストン修飾の分子機構に差異があることが推測される。
  • 中田 恵子, Markus Englert, Hildburg Beier, 赤間 一仁
    p. 042
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     真核生物において,イントロンにより分断された核tRNA遺伝子から転写された前駆体tRNAは核内でプロセシングを受け,成熟tRNAは細胞質に輸送される。出芽酵母では,スプライシング装置が核膜の内膜に局在することがすでに分かっている。しかしごく最近になって,酵母のtRNAスプライシング・エンドヌクレアーゼのサブユニットがミトコンドリアの外膜に存在することが示された。
     我々は植物における核tRNAイントロンの分子構造とそのスプライシング機構の解明を進めている:植物ではtRNATyrとtRNAMetをコードする核遺伝子のみがイントロンを保有すること,イントロンが参加した高度に保存された高次構造が植物tRNAエンドヌクレアーゼの基質認識と切断反応に要求されることをすでに本会で報告している。今回,植物tRNAスプライシング装置の細胞内局在を調べるために,エンドヌクレアーゼのサブユニットタンパク質をコードする遺伝子 (AtSen1AtSen2)とGFPとのキメラ遺伝子を構築し,融合タンパク質の細胞内局在を調べたので報告する。パーティクルガンを用いてこれら遺伝子をタマネギの表皮細胞に導入し,発現したGFP融合タンパク質の局在の蛍光観察を行った。この結果,酵母と同様に,いずれのサブユニットタンパク質ともにミトコンドリア局在が観察された。これと平行して,植物tRNAリガーゼの細胞内局在の解析を進めており,あわせて報告する予定である。
  • 藤田 清仁, 太田 にじ
    p. 043
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     植物において二酸化炭素の固定の酵素RuBisCOは rbcL, rbcSにコードされている。RbcLのアミノ酸配列を基に系統樹を作成すると、大きくプロテオバクテリア型(R型)とラン藻型(G型)に分かれることが報告されている。G型のRuBisCO遺伝子は rbcL-rbcS のオペロン構成をとっているが、R型のRuBisCO遺伝子は rbcL-rbcS-cfxQ オペロンとしてRuBisCO遺伝子の発現に必要と推測されている cfxQ が存在している。
     cDNAの塩基配列の解析及び Cyanidioschyzon merolae 10Dの核の全塩基配列から、核も cfxQ を単独でコードしていることがわかった。本研究では色素体及び核にコードされているそれぞれの cfxQ について機能を明らかにすることを目的として研究を進めている。
     CfxQのアミノ酸配列を基に系統解析を行った結果、色素体の cfxQ はプロテオバクテリア由来のものと考えられたが、核の cfxQ は早い段階で分岐していた。このことから、色素体の cfxQ は共生体由来、核の cfxQ は宿主由来であるという可能性もある。
     次に二つの cfxQ の転写発現についてノーザン解析を用い調べた。その結果、核及び色素体の cfxQ はどちらも転写されており、転写時期に差が見られたためそれぞれ異なる調節を受けている可能性が示唆された。
  • 寺坂 和祥, Angus S. Murphy, 佐藤 文彦, 矢崎 一史
    p. 044
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    植物はそのゲノム中に多数のABC蛋白質遺伝子を有しており、シロイヌナズナではデータベース上に約130種のABCタンパク質遺伝子が見出されている。本研究では、植物のABCタンパク質の中でも、特に最近オーキシン輸送の観点から注目されているPGP(P-glycoprotein-like)サブファミリーのAtPGP4に焦点を絞り、機能解析を行った。まず、AtPGP4遺伝子の発現組織及び発現の環境応答性を明らかにするため、Northern解析とAtPGP4プロモーターGUSレポーターコンストラクトを用いた解析を行った。その結果、AtPGP4遺伝子は植物体中では根で最も高い発現を示すこと、及び様々な化合物、特にオーキシンやサイトカイニンの添加に対して正の応答することを認めた。根における強い発現は基部から先端にかけて見られ、主に表皮に特異的であった。また、ショ糖密度勾配遠心法および免疫染色法により、AtPGP4の局在膜が細胞膜であることを明らかにした。次に、T-DNA挿入変異株の表現型解析を行なった結果、野生株と比較して根の発達に明確な遅延が観察された。さらに、T-DNA挿入変異株と過剰発現体を用いて植物体におけるオーキシン輸送活性の解析を行なったところ、過剰発現体でオーキシン極性輸送が顕著に増大した。現在、このオーキシン輸送活性について、さらに詳細な解析を行なっている。
  • 永野 惇, 松島 良, 西村 いくこ
    p. 045
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    ERボディはシロイヌナズナに存在する機能未知のオルガネラであり.傷害によって誘導されることから,生体防御に関与すると示唆されている.最近,我々はER ボディを欠失する変異体nai1の解析から,蓄積量が顕著に減少しているタンパク質としてPYK10とPBP1を同定した(1).PYK10は糖鎖を持つβ-グルコシダーゼであり,ERボディに局在している.PBP1はサイトゾルに局在するレクチンである.PYK10とPBP1は食害等で細胞が破壊されたときに出会って結合することが予測される.今回,PYK10の性質,およびPBP1の結合がPYK10に与える影響について報告する.根の抽出液のPYK10活性の経時変化から,PYK10には活性型と不活性型が存在することが分かった.活性型は不活性型に比べてわずかで,その9割以上が抽出後6時間以内に巨大なアグリゲートとなって沈殿する.また,PBP1がPYK10と結合することを免疫沈降で確認した.PBP1は不活性型PYK10の沈殿を促進し,一方,活性型PYK10の沈殿には関与しないことが分かった.PYK10がアグリゲートとなること,不活性型が多量に存在することの生態的意義について考察する.
    (1) Matsushima et al.(2004) Plant Cell 16,1536-1549.
  • 和田 慎也, 石田 宏幸, 牧野 周, 前 忠彦
    p. 046
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
     私たちは、暗所に静置したコムギ葉緑体の破砕液において、Rubisco 大サブユニット(LSU)がPhe40-Arg41間で切断され44 kDa の分解断片を生ずることを先に報告した(Kokubun et al., Plant Cell Physiol., 43, 1390-5, 2002)。本研究では、このLSUの分解を担う葉緑体プロテアーゼの精製と同定を目的とした。
     分解を担うプロテアーゼ活性を特異的に検出するために、LSUの切断部位周辺のアミノ酸配列をもとに消光性蛍光ペプチド(Nma-LAAFRVSK(DNP)rr-NH2)を作成し、これを基質として用いた。ホウレンソウの新鮮重500 g から可溶性タンパク質を抽出し、硫安分画に続き、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びゲルろ過により、最終的に15 μg の精製タンパク質を得た。最終精製画分のプロテアーゼ活性はEDTAやo-phenanthrolineによって抑制された。SDS-PAGEの結果、この画分には2種類のポリペプチド(MW 80 kDa, 103 kDa)が存在したため、これらを単離した後、それぞれの部分アミノ酸配列を決定した。そのうち103 kDa のポリペプチドの内部アミノ酸配列は、シロイヌナズナでその存在が知られている金属プロテアーゼの一つとその配列において一致した。
  • 村山 誠治, 半田 裕一
    p. 047
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    インベルターゼは、スクロースをグルコースとフルクトースに加水分解する酵素である。インベルターゼには多数のアイソフォームが存在し、反応の至適pHによって細胞壁や液胞に局在する酸性インベルターゼと細胞質に蓄積される中性あるいはアルカリ性インベルターゼとに分類されている。我々は、RT-PCRを用いてイネから新規の中性インベルターゼ(OsNInv)cDNAクローンを単離した。OsNInvタンパクの推定アミノ酸配列は、他の植物の中性・アルカリ性インベルターゼと高い相同性を示した。Semi-quantitative RT-PCRによりOsNInv遺伝子の発現を調べた結果、OsNInv遺伝子の発現量は非常に低く、また、組織特異性も見られなかった。3種類の予測ソフト、Predotar、TargetP、PSORTを用いてOsNInvタンパクの細胞内局在を予測した結果、非常に高い確率でOsNInvタンパクがミトコンドリアへ輸送されることが示された。そこで、OsNInvアミノ末端領域と緑色蛍光タンパク質(GFP)を結合させた融合タンパク質の一過的発現実験を行った結果、融合タンパク質が効率よくミトコンドリアへ輸送されることを見いだした。以上の結果は、OsNInvアミノ末端領域がミトコンドリアターゲティングシグナルとして働いており、OsNInvタンパクがミトコンドリアに蓄積していることを示唆している。
  • 滝元 宏治, 太田 にじ
    p. 048
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    細菌、植物におけるタンパク質のトランスロケーション経路に、Sec経路、Tat経路、SRP経路などが知られている。その中で、Sec経路では必須の成分SecAが存在する。SecAは、植物ではチラコイド内腔への前駆体タンパク質の輸送に機能している。ほとんどの生物で、secA遺伝子は一つだけ存在する。しかし、原始紅藻Cyanidioschyzon merolaeでは核と色素体の両方にsecA遺伝子が存在していた。本研究ではこれら2つのsecAの違いを明らかにすることを目的としている。そのために、それぞれのsecAについて系統樹の作成、逆転写PCR、リアルタイムPCR、大腸菌のsecA温度感受性変異における相補性解析を行った。これらの解析の結果、2つのsecAが発現していること、また、系統関係は異なっており、特に核のsecAは補助分泌因子であることが示唆されているマイコバクテリアのsecA2と系統的に近いことが明らかとなった。大腸菌に対する相補性解析では、どちらのsecAも温度感受性secA変異株を相補できなかった。また、正常な大腸菌で色素体secAを過剰発現させると致死となったが、核のsecAの場合、致死とはならなかった。このことから、2つのSecAは異なる機能を持つ可能性が示唆された。
  • 木村 智子, 柴垣 奈佳子, 林 浩昭, 米山 忠克, John P. Davies, 藤原 徹
    p. 049
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    高等植物における硫黄栄養応答は、硫黄代謝経路上で機能するタンパク質や化合物の働きが明らかにされる一方で、硫黄栄養状態を感知するメカニズムあるいは制御因子は見つかっていない。他の生物には存在する硫黄応答制御因子の相同遺伝子が、高等植物においても類似した機能を有するか否かを検証するために、本研究では、単細胞緑色藻類Chlamydomonas reinhardtiiのもつ硫黄応答制御因子Sac3に注目し、シロイヌナズナにおけるSac3相同遺伝子のうちの1つ、At5g66880について遺伝学的及び生理学的解析を行った。独立した2つの当該遺伝子破壊株においては、硫黄欠乏時に野生型株で見られる硫酸トランスポーターSultr2;2のmRNA蓄積増加が観察されなかった。また、硫黄欠乏応答のシグナル物質とされるO-アセチル-L-セリンの含量が、硫黄欠乏時に野生型株よりも増加していることが分かった。これらのことから、当該遺伝子は硫黄応答、特に欠乏応答に関与すると考えられ、異種生物間でも応答制御機構が保存されている可能性があることが分かった。
  • 出口 友美, 加藤 新平, 吉岡 博文, 道家 紀志, 川北 一人
    p. 050
    発行日: 2005/03/24
    公開日: 2006/01/11
    会議録・要旨集 フリー
    病害ストレスに応答して活性化されるタンパク質リン酸化酵素(MAPK)が植物の誘導抵抗反応の制御に深く関わっている。MAPKの活性化にはMAPKKによるスレオニンとチロシン両残基のリン酸化が必要とされ、一方、活性化されたMAPKはスレオニンあるいはチロシン残基の脱リン酸化により不活性化されるが、この脱リン酸化酵素の実体は明らかではない。今回、ジャガイモ疫病菌菌体壁成分エリシター(HWC)処理により活性化されるジャガイモ植物のMAPK (StMPK1)を不活性化する脱リン酸化酵素の性質について検討した。ジャガイモ懸濁培養細胞より調製した粗酵素標品とStMPK1を反応させたところ、StMPK1の活性は著しく低下した。阻害剤実験により本酵素はセリン/スレオニン型脱リン酸化酵素であると考えられた。また、脱リン酸化酵素の候補として、近年報告されたアルファルファMP2CのホモログをジャガイモcDNAライブラリーより単離し、ノーザン解析を行ったところ、HWCエリシター処理により誘導が認められた。また、その発現タンパク質を大腸菌を用いて作製し、StMPK1にジャガイモMP2Cを加えたところStMPK1は脱リン酸化され、不活性化された。現在、タバコ植物を用いてMP2Cホモログ遺伝子のサイレンシング株および過剰発現株を作出し、ジャガイモMP2Cのin vivoでの機能解析を試みている。
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