メタボリックプロファイリング研究の最終目的は，生物の持つ全ての化合物の種類と量（メタボローム）を迅速に把握することである．高分解能・高感度な分析を行うことが出来るFT-ICR MS（フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置）を用いることで，各種分離操作無しに試料中の化合物を一斉分析することが可能である．さらに，観測された精密質量から，分子式さらに化合物の推定が可能である．我々は，FT-ICR MS分析では不可避の精密質量値分析誤差や分析サンプル内におけるイオンサプレッション等の問題点を克服するためのメタボロミクス解析スキームを整備した．本スキームは，1）一分析あたり数秒のハイスループット解析，2）分析間に存在する精密質量の誤差を自動的に補正するデータ解析ツール（Dmass）開発，3）分析条件の最適化による分析間のイオン強度の再現性確認，4）多サンプル間でのメタボローム比較のための多変量解析，5）得られた精密分子量からの化合物データベース（KNApSAcK）検索による化合物推定，6）MSMS分析による化合物構造の解析から成る．その結果，粗抽出液の分析から化合物の同定までが簡便に行えるようになった．研究実例として，トランスクリプトーム情報との統合解析，安定同位体を用いた未知酵素の基質探索について報告する．

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昨年トマトの国際ゲノムプロジェクトがスタートし、トマトはナス科モデル植物として位置づけられている。一方代謝物解析に関しては、トマト果実の一次代謝産物は網羅的解析がなされているが、二次代謝産物は個別に解析されてきたに留まる。今後増加が予想されるトマトのゲノム情報を代謝物蓄積制御機構の解明に結び付けていく上で、トマト代謝物に関してより多くの解析情報が求められる。
本研究では、トマト果実の全代謝成分情報を抽出および整備することを目的とし、各成分の精密質量を求めることが可能なLC-FT-MS(MS/MS)を用いて、成熟段階の異なるトマト（Micro-Tom）果実を組織別（果皮と果肉）に分析した。m/z値が 80-1500の範囲の化合物から、溶出成分の保持時間、Full MS、MS/MS、 UV吸収などの情報を抽出し、組成式の推定を行なった。推定成分の検索には、天然物データベース（KNApSAcKおよびDictionary of Natural Product）を利用した。その結果、トマト果実全体で500以上の代謝成分の存在が確認でき、その中には多くの未知成分が存在することが示唆された。また、果皮部、果肉部いずれも成熟によって蓄積成分が大きく変化することが認められた。今後LC-FT-MSにより集積された代謝物の詳細情報は、データベースとして公開していく予定である。

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ガスクロマトグラフィー-質量分析機（GC-MS）は、植物のメタボローム解析において主要な分析機器の一つであり、高分解能、保持時間の高い再現性などの特徴を有する。GCで分離された分子はMS機器部分でイオン化され、開裂を経て複数の娘イオンとして検出される。開裂パターンはそれぞれの分子で特有であるため、標準物質のパターンとの比較によりピーク化合物を同定できる。しかし、植物代謝産物の全ての標品や開裂パターンデータは入手困難なため、現状では、植物試料における同定率は一般に10～20%程度である。代謝産物プロファイルを複数試料で比較するためには、未知化合物を含めてピークの対応関係を解析できるツールが必要である。そこで我々は、それを可能にするJavaソフトウェアを開発した。本ソフトウェアでは、ピーク検出とデコンボリューション、保持時間の補正、開裂パターンによるピークアラインメント等が可能である。GC-飛行時間型-MSを用いてシロイヌナズナ培養細胞の単一抽出試料を複数回分析して得られたデータを解析した結果、再現性の高いアラインメント結果が得られた。また、シロイヌナズナ培養細胞とミヤコグサの葉の分析結果から、両試料間での代謝産物プロファイルの比較を行うことに成功した。

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ポストゲノム時代の今日、代謝産物の網羅的解析いわゆるメタボローム解析が注目されている。メタボローム情報は、生命現象を様々な分子変動のネットワークとして記述するシステムズバイオロジーに必須な、重要な情報と位置づけられている。現在、代謝産物解析には質量分析計を用いた手法が主流である。しかし、代謝産物の化学的多様性や将来要求されるであろう反応動態の空間・時間分解能を見据えると、多様な計測機器を組み合わせた新規方法論の開発が望まれる。そこで、我々は多次元NMR法を用いた代謝産物解析法の開発、基盤整備を行っている。安定同位体標識を併用した多次元NMR計測では、非侵襲計測、化合物の原子毎の変動追跡、不溶物を対象にした計測など、ユニークな代謝変動計測が可能となる。また昨今、新たな測定方法、計測機器の開発もなされ、高感度化も飛躍的に進んでいる。我々はこれまでに、動植物の均一安定同位体標識化、代謝物抽出法の効率化、標準物質のNMRケミカルシフトデータベース構築、多次元NMR法による物質同定システムSpinAssignの開発、を進めてきた。本大会では、これらを紹介するとともに、ABA応答時のシロイヌナズナT87培養細胞の代謝・転写物変動解析、シロイヌナズナ遺伝子破壊系統の代謝物解析の試みについて報告する予定である。さらに今後の多次元NMRメタボロミクスの展開、可能性についても議論したい。

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近年、ゲノム科学の一分野としてのメタボロミクス研究は、機能ゲノミクスにおいてその重要性を増している。本研究では、代謝物間ネットワークを求めるためのGC-TOF/MSによるメタボロミクス方法論の確立を目的に行った。セリンアセチル転移酵素遺伝子の2重変異体serat2;1 serat2;2はターゲット分析により、硫黄同化系において重要な役割を果たしているO-acetyl-L-serine、cysteineおよびglutathioneの生産量が減少することが明らかとなっている。しかしながら生育状態や形態上の変化は全く認められないサイレントフェノタイプである。これらの植物中に含まれる代謝産物総体（metabolome）を一つの表現型ととらえると、metabolome量に何らかの変化が起こっていることは十分期待される。そこでserat2;1 serat2;2変異体および野生型の抽出物に対し、GC-TOF/MS分析を行った。分析データについてケモメトリクス法を用い各MSピークのアライメントをおよび標準化を実行し、根においては470ピーク、葉においては514ピークを得た。続いて本データを用いて多変量解析およびMSピークエリアの相関係数によるfunctional metabolic network解析を行った結果、変異体および野生型の代謝産物間において、数種のアミノ酸および糖の蓄積パターンに差異が認められた。本発表ではその方法論について報告する。

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【目的】我々は、フィードバック非感受性改変イネアントラニル酸生合成酵素遺伝子（OASA1D）の導入により、組織中Trp含量が100倍以上増加したイネを得ることに成功している。OASA1Dの導入がイネの代謝系全体に及ぼす影響を評価するためHPLC-PDAおよびHPLC-ESI-Q-MSを用いたノンターゲット代謝プロファイル分析を行った。
【方法と結果】発芽後2週間のイネ植物体を5倍量の80%メタノール水溶液中で抽出し、20倍に濃縮したサンプルをHPLC-PDA(波長200-400 nm)分析に供した。その結果、OASA1Dの導入はトリプトファンを除く主要な芳香族成分含量にほとんど変化を起こさないことが明らかとなった。さらに詳細な変化を調べるためにHPLC-ESI-Q-MS(島津LCMS-2010)で代謝プロファイル分析を行った。質量数100-700の範囲をスキャンし、分析計で得られたデータを自作perlスクリプトおよびCOWTOOLを用いて変換，解析して、約1600ピークを検出した．
各ピーク強度データに対して相関解析、 ANOVA、独立成分解析を行ったところ，OASA1Dの導入により含量が有意に増加する約20成分を見いだすことができた．LC-MS/MS解析からこれらの成分のいくつかはγ-グルタミルトリプトファンを始めとするインドール化合物であると同定した。またイネ植物体部位毎に比較すると、根に比べて葉の方が代謝プロファイルの変化が顕著であることが明らかになった。

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植物細胞のゴルジ複合体は、糖タンパク質糖鎖および細胞壁多糖の合成・修飾・構築ならびに、分泌・液胞局在型タンパク質の選別など行うための動的で複雑な構造を有している。本研究は、イネゴルジ複合体を高度に精製し、そのプロテオミクス解析を行うことを目的としている。我々は、シスゴルジ膜への局在が明らかにされているGFP-AtSYP31融合タンパク質をイネ培養細胞で発現させ、GFP指標シスゴルジ膜を単離することを試みた。調製したミクロソーム膜をショ糖密度勾配中でフローティングさせることにより、ミクロソーム膜画分よりもGFPの比蛋白濃度が20倍上昇したGFP-AtSYP31標識膜画分を得ることに成功した。この膜画分にはゴルジ IDPaseやER NADPH-Cyt c reductaseの活性は殆ど検出されなかった。得られたGFP/AtSYP-31標識膜画分のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、得られたすべてのタンパクバンドをLC-MSMS解析した結果、root hair defective 3や、COP1およびCOP2コートタンパク、YPT3などのsmall GTPaseがゴルジ膜局在タンパク質として検出された一方で、Bipやcalreticulin、Hsp90などのER膜局在タンパク質が検出された。この結果は、シスゴルジとERとの類似性、連続性を示唆している。

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植物は自らの置かれた環境に対して受動的に応答しているのみではなく、様々な物質を根圏に分泌することにより積極的に環境調節を行う能力を有している。その分泌物質のひとつにタンパク質があげられ、例えば低リン状態に応答して分泌される酸性ホスファターゼがある。これまでにもいくつかの根分泌タンパク質の分泌機構や活性の解析が行われているものの、根分泌タンパク質を網羅的に解析した例は少ない。そこで本研究ではプロテオーム手法を用い、モデル作物であるイネで栄養ストレスにより相対的な分泌量が変化するタンパク質のプロファイル作成を行った。
イネ(品種：みちこがね)を発芽処理後、コントロール、－P処理、－N処理の3種類の培養液で2週間水耕栽培した。培養液は毎日交換し、最後の1日の培養液を試料溶液として供試した。水耕液を透析チューブ、限外ろ過膜、TCA/acetone沈殿で順次濃縮し、7M Urea/2M Thiourea bufferで再溶解を行った。二次元電気泳動の泳動パターンによって、スポットを確認した。コントロールでも多数のスポットが観察されたことから、イネは構成的に根からタンパク質を分泌していた。また、-N, -P処理により分泌タンパク質の種類と量が変化することが示された。二次元電気泳動後のゲルから主要なスポット、処理間で差の認められたスポットを切り出し、MALDI-TOF-MSを用いたPMF法によりそれらの同定を進めている。

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マイクロアレイを用いたイネの低リン応答機構のトランスクリプトーム解析は、リン代謝のみならず解糖系などの様々な代謝系に大きな変動が生じることを明らかにしてきた。一方トランスクリプトームは必ずしもタンパク質レベルの変動に対応していないと考えられる。さらに、これまでイネ根を対象としたプロテオーム解析は抽出操作の困難さから研究例は少ない。本研究ではイネ根から得られた同じ試料を用いてトランスクリプトームとプロテオーム解析を行い、KaPPA viewによるパスウェイ解析を試みた。
リンを与え続けた区を対象として解析したときに、トランスクリプトーム解析の結果、1）解糖系に関連した遺伝子の発現、2）Sulfolipid, Glycolipid合成系の発現が高まり、3）TCAサイクルを構成する遺伝子の発現、4）アニオンチャンネルをコードする遺伝子の発現はかわらず、5）アミノ酸合成にかかわる遺伝子の発現は低下した。このとき一日間リンを再施与した場合には特に解糖系の遺伝子群の発現が低下した。一方プロテオ－ム解析からは解糖系に関しては同様の反応が認められたものの、アミノ酸合成に関しては逆の傾向が認められ、また、アニオンチャンネルが-P区で有意に高まる現象が認められた。このようにトランスクリプトームで得られた代謝の変動パターンとプロテオームで得られたパターンは必ずしも一致しておらず、両者の発現パターンをプロットすると相関は認められなかった。

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地衣類は菌類と藻類が共生して光独立栄養的に生育し、種によっては細胞が乾燥すると光合成を停止、水を吸収すると光合成を再開させることで乾燥耐性を獲得している。PAMによる蛍光変動測定や極低温での定常蛍光スペクトル測定から、乾燥時には吸収した光エネルギーを熱へ変換することで、過剰な酸化力・還元力の蓄積による光化学系の破壊を防ぐことが推定されている。しかし、エネルギー変換のメカニズムは不明である。緑藻を共生藻にもつ地衣類トリハダゴケの5 Kから室温での蛍光寿命をピコ秒時間領域で測定し、光エネルギーが熱へ変換される過程を直接観測した。乾燥させた細胞と、水を再添加し段階的に光合成機能を回復させた細胞で比較し以下の結果を得た。（1）乾燥時の光化学系IIは通常より10倍以上蛍光寿命が短くなる。（2）乾燥時でも光化学系IIコアアンテナ内での励起移動が起こる。（3）光化学系IIの蛍光寿命は水添加後1分以内に回復する。（4）光化学系Iの蛍光は乾燥時に短波長シフトし寿命も若干短くなるが、光化学系IIほどの大きな変化はない。これらの変化は他の地衣類でも同様に観測された。また、高濃度のトレハロースに懸濁し乾燥させたホウレンソウ光化学系2でも蛍光の短寿命化が観測された。これらの結果を元に、乾燥時の地衣類がエネルギーを散逸させるメカニズムについて考察する。

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タンパク質において、Tyrラジカルが酵素の機能に重要な役割を担っていることは広く知られている。水分解系酵素である光化学系IIには、redox activeな2分子のTyrがD1とD2タンパク質に存在し、P₆₈₀を中心として対称的な位置関係にある。それぞれのTyr残基を取り巻くアミノ酸の構造は非常に似ているにも拘わらず、D1のTyrZが光合成電子伝達に直接的な役割を担うのに対し、D2側のTyrDは安定なラジカルとして存在しているだけである。そのため、これらのTyrラジカルの酵素としての機能は異なり、少なくとも、それぞれのキネティクスおよび酸化還元電位は大きな違いが認められている。これらの違いを引き起こす理由について理解することが出来れば、タンパク質のどのような環境がどのようにしてTyrラジカルの反応性を制御しているのかを知ることができる。本研究では、好熱性ラン藻Thermosynechococcus elongatusのD1タンパク質に部位特異的変異を導入することによってTyrD周辺の水素結合ネットワークの構造を変え、TyrDのラジカル形成キネティクスやそれの性質についてEPR等を用いて調べた。本大会では、その構造変化のメカニズムへの影響について報告する。

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高等植物およびシアノバクテリアの光合成酸素発生は、光化学系II蛋白質複合体のMnクラスターで行われる。Mnクラスターは5種類の異なった酸化状態をとり、酸化程度の低い順にS_i (i=0-4) と表記される。Mnクラスターは2分子の水分子から電子を引き抜き、S₄状態で酸素分子を放出しS₀状態に戻る。暗所では、S₁状態が最も安定である。 反応過程においてどのように水が取り込まれ反応が進行するのかは明らかではない。
今回、S₀およびS₂状態のMnクラスターへの水分子の配位をENDOR測定（電子核二重共鳴）で調べた。S₀ S₂状態共に非常によく似た6組のENDOR信号が検出された。これらの信号はマンガンクラスターのスピン中心から6A以内のプロトンである。 また近傍2.7Aと3.3Aのプロトンは重水素置換により交換可能であった。 S₀状態ではこれらのプロトンは3時間以内の交換が確認された。一方S₂状態では3.3Aのプロトンは3時間以内の交換が見られたものの、2.7Aのプロトンの交換は大変遅く24時間を要した。 2.7Aのプロトンはマンガンクラスターに大変近く、マンガンに直接配位している水由来の可能性が高い。S状態に依存したプロトンの親和性の違いは酸素発生過程におけるMnクラスターの水分子の取り込みにおける過程と関係している可能性が高い。

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光化学系IIにおける酸素発生反応は、マンガンクラスターの5つの中間状態（S₀-S₄）の光駆動サイクル（S状態サイクル）によって行われる。Ca²⁺は酸素発生に必須であることが知られているが、Ca²⁺イオンとMn原子との構造的関係は未だ不明である。本研究では、ホウレンソウ及び好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatusから、Ca²⁺をSr²⁺に置換した光化学系II標品を調製し、そのフーリエ変換赤外（FTIR）スペクトルを測定することにより、マンガンクラスターの反応におけるCa²⁺の関与について調べた。マンガンクラスターの各S状態遷移（S₁→S₂, S₂→S₃, S₃→S₀, S₀→S₁）の閃光誘起FTIR差スペクトルにおいて、カルボキシル基のCOO^-対称伸縮振動領域（1450-1350cm^-1）に、Sr²⁺置換により著しく変化するバンドが観測された。それらの変化は、ホウレンソウとシアノバクテリアとでおおよそ共通であり、S₁→S₂及びS₃→S₀遷移において特に顕著であった。この領域のSr²⁺−Ca²⁺二重差スペクトルには複数のピークが確認されたことから、Ca²⁺自身またはMn原子上のいくつかのカルボキシル配位子がSr²⁺置換により影響を受けたと考えられる。これらの結果から、Ca²⁺はMnクラスターの構造と直接的に相互作用しており、そのS状態サイクルにおける反応に密接に関わっていることが示された。

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D1蛋白質の189番目のグルタミン酸（Glu189）の側鎖カルボキシル基は酸素発生触媒中心であるMnクラスターの配位子候補として提唱されている。本研究では、Glu189カルボキシル基の役割を明らかにするため、Glu189をカルボキシル基側鎖を持たないGlnに置換したSynechocystis sp. PCC 6803変異株（Glu189Gln）を作製し、変異が酸素発生機能に与える影響を検討した。Glu189Glnは光独立栄養的に生育し、単離した光化学系IIコア標品は野生株に対し約70%の酸素発生活性を示した。S₂状態のMnクラスターは正常なEPRマルチライン信号を示したが、熱発光Q-バンド (S₂Q_A^-)のピーク温度が野生株に比べ高温にシフトしており、Mnクラスターの酸化還元電位が低下していることが示された。また、変異株ではフーリエ変換赤外分光（FTIR） S₂/S₁差スペクトルの中波数領域（1800-1200 cm^-1）に現れる、金属に2座配位したカルボキシル基のバンドとカルボニル基のバンドと、低波数領域（650-350 cm^-1）に現れるMnクラスターの骨格構造に由来するバンドが顕著に変化した。以上の結果は、Glu189がMnイオンの2座配位子であることを示している。Glu189Glnではカルボキシル基に代わりカルボニル基がMnイオンの配位子として機能するため、Mnクラスターはほぼ正常な機能を保持しているものと考えられた。

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光合成酸素発生反応の触媒中心であるMnクラスターは、4原子のMnイオンと1原子のCaイオンから成る金属錯体であり、D1蛋白質のアミノ酸残基が主な配位子であるとされているが、詳細な配位構造や反応過程における配位構造の変化は不明である。推定アミノ酸配位子を同位体標識、或いは他のアミノ酸に置換したSynechocystis sp. PCC6803光化学系IIコア標品を用い、酸素発生過程におけるMnクラスターとアミノ酸配位子の相互作用を振動分光学的手法により詳細に検証することが可能である。Hisを選択的に¹⁵N標識した試料では、イミダゾール環のCN伸縮振動に由来するバンドがS状態間遷移に伴って可逆的に変化しており、反応に伴うHis332(或いはHis337)配位子の構造変化が示唆された。Alaを特異的に¹³C標識した試料では、D1-Ala344カルボキシレート配位子に由来するバンドの選択的測定が可能であり、S₁→S₂遷移で酸化、S₃→S₀遷移で還元されるMnイオンに単座配位していることが示された。Glu189Gln変異株ではMnイオンに2座配位したカルボキシレートの振動数領域にバンドの変化が観測された。一方、報告されたAsp170His変異株の赤外吸収差スペクトルには野生株との違いがみられなかった。赤外分光法により得られた結果と結晶構造データに基づいてMnクラスターの配位構造について考察する。

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植物は、生育温度に応じて生体内の構造・反応機構をその温度条件に適した状態に調節する(温度順化)。本研究では、常温性ラン色細菌Synechocystis sp. PCC 6803が温度順化することで、光化学系II(PSII)複合体の高温感受性にどのような変化が起こるのかを詳細に検証した。材料として25あるいは35度で培養した細胞のチラコイド膜および単離したPSII複合体を用い、酸素発生活性および反応中心活性の温度依存性を測定した。2, 5-dichloro-1, 4-benzoquinoneを電子受容体として用いた場合、チラコイド膜あるいは単離したPSII複合体の酸素発生活性の温度依存性は、培養温度の違いによる顕著な差は見られなかった。一方、duroquinoneを電子受容体として用いた場合、チラコイド膜では培養温度の違いで酸素発生活性の温度依存性に差が見られたが、単離したPSII複合体では差が見られなかった。また、チラコイド膜あるいは単離したPSII複合体における反応中心活性の温度依存性は、培養温度の違いによる顕著な差は見られなかった。さらに、異なる培養温度由来のチラコイド膜あるいは単離したPSII複合体のタンパク質組成にも顕著な違いはなかった。これらの結果より、酸素発生活性の高温感受性の変化はチラコイド膜脂質組成の変化によるものと推察した。

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光化学系IIタンパク質複合体（以下 PSII ）は 14～16 種の膜貫通サブユニットと3種の膜表在性サブユニットを含む分子量約 350 kDa の超分子複合体であり、光エネルギーの吸収と化学エネルギーへの変換、および水分解・酸素発生といった一連の重要な反応を触媒している。PSII の結晶構造はこれまで 3.2～3.7 A の分解能で報告されたが、これらの分解能は PSII の全アミノ酸側鎖や Mn クラスターの詳細な構造を解明するのに充分とは言えない。我々は好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus vulcanus 由来 PSII 結晶のX線回折分解能を向上させるため、 PSII 標品の精製・結晶化方法、X線回折実験のための抗凍結剤等の条件を改良している。標品の精製において従来のイオン交換カラム法を改良し、PSII 二量体から微量の PSII 単量体を除去し、また、結晶化においては従来結晶成長に 10～15 日間を要した微量透析法の代わりに蒸気拡散法を用いることで、2～3 日間で結晶を析出させることに成功した。さらに低温X線回折のための抗凍結剤への置換時間を短縮する等により、結晶の分解能を 3.3 A に向上させることに成功した。本発表では PS II の結晶化の現状について報告する。

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光合成の初期過程である光エネルギー変換が起こるチラコイド膜は、おもに光合成装置である超分子複合体と、二重層を形成する脂質分子から構成される。脂質分子は、光合成装置に足場を与えるのみではなく、光合成の初期過程における重要な調節因子であることが近年明らかにされつつあり、我々は、チラコイド膜に存在する唯一のリン脂質であるホスファチジルグリセロール（PG）に注目し、その機能について解析を進めている。これまでにラン藻Synechocystis sp. PCC6803を用いてPG合成欠損株を作製し、PGがその生育に必須であること、また、光化学系II（PSII）の電子伝達に重要であることを明らかにしている。
本研究では、PSII複合体におけるPGの機能を解明するために、PGを欠乏させた変異株より精製したPSII複合体の性質を詳細に解析した。変異株より精製したPSII複合体の光合成活性は、野生株のPSII複合体に比較して40％程度に低下しており、マンガンの遊離を伴った表在性タンパク質の解離が確認された。また、リンコマイシンを用いてタンパク質合成を阻害しても、PGを添加すると、解離していたPsbOサブユニットがPSII複合体へ再結合した。これらの結果は、PGがMn-クラスターの維持に必要な表在性タンパク質の結合において重要な働きを持つことを示している。

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PS1 RC complex(PsaA/B)にはChl類としてはChl aしか結合しておらず、アンテナ色素として機能するChl a’(Chl a epimer)は存在していない。PS1 RCからエーテル処理によってChl aの大部分を除去し、P700当たり10～14分子のChl aおよび1分子のChl a’しか含まない標品を調製した。(1)これにChl a’をリン脂質PGと共に加えて、P700当たり5-10分子のChl a’が結合した標品を得た。(2) P700の光酸化を測定したところ、その量子収率は結合したChl a’の分子数分増加した。また、常温におけるChlケイ光(Fl680)の収率をChlあたりで比較すると、Chl a’の結合により増加することはなかった。即ち、結合したChl a’は抽出されないで残っているChl aとほぼ同等のアンテナ機能を持つことが示された。(3)Chl aとChl a’を同量加えて結合する分子数を比較したところ、Chl a’の結合数が少なく、したがって、Chl a結合部位への親和性がChl aよりやや低いことが示された。(4)エーテル処理によるChl aの抽出率を高めるとChl a’はChl a結合部位へ正常に結合できなくなり、その結果、アンテナ機能は著しく低下することがわかった。

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紅色細菌の光合成電子伝達系において光酸化された反応中心複合体に対する電子供与体として可溶性チトクロムc₂が良く知られている。我々はβグループの紅色細菌Rubrivivax gelatinosusにおいては可溶性の鉄-イオウタンパクであるHiPIPが主にその機能を担っていることを欠損株の作成を通じて明らかにしてきた。さらにR. gelatinosusではHiPIP以外にも酸化還元電位の異なる2つの可溶性チトクロムc₈が反応中心への補助的な電子供与体として働くことも示してきた。R. gelatinosusにおける光合成電子伝達経路の全容を明らかにするために、これら3種類の電子供与体遺伝子の様々な多重欠損株を作成したところ、全てを除去した3重欠損株も光合成による生育が可能であった。この3重欠損株生細胞に対する閃光照射実験で新たに553 nmにピークを持つチトクロムの光酸化が観察された。そのチトクロムを精製したところ約25 kDaの分子量を持つC型チトクロムで、膜標品との再構成実験を行うと反応中心への良い電子供与体として働いた。N末端のアミノ酸配列に基づいて遺伝子のクローニングを行い、全配列を決定したところ、C型ヘムの結合モチーフが2つあり、相同性検索ではチトクロムc₄に最も似ていた。現在この新規チトクロムの遺伝子破壊株を作成し、機能をさらに詳しく調べている。

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ヘリオバクテリアはグラム陽性菌に属する嫌気性光合成細菌で、主要な光合成色素としてバクテリオクロロフィル g を持つ。ヘリオバクテリアの光化学反応中心 (RC) は、光化学系 Ι や緑色硫黄細菌の RC と同様の鉄硫黄型反応中心に属する。鉄硫黄型反応中心は、フェレドキシン（Fd）を直接光還元できる。これまでに我々は、ヘリオバクテリア H. fasciatum から 2[4Fe-4S] 型の Fd を4 種類 (Fd A、Fd B、Fd C、Fd D) 単離し、その性質を前回報告した。今回は、H. fasciatum からRCを単離・精製し、その性質を調べた。また、精製した RC と4種の Fd との電子伝達反応を、ホウレンソウの FNR を介した NADP⁺ 光還元活性で調べたので報告する。嫌気下で単離・精製したRCに Fd BまたはFd Dを加えて光照射したところNADP⁺ の光還元が観察された。一方、同条件で Fd A または Fd C を加えて光照射したところ NADP⁺ の還元は観察されなかった。現在単離・精製した RC にどのような鉄硫黄クラスターが結合しているか、液体ヘリウム温度下での ESR 測定によって調べている。

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緑色硫黄細菌は鉄硫黄型の光化学反応中心を持ち、硫化水素を電子供与体として光合成を行う。そのうちChlorobium limicola f. thiosulfatophilumやChlorobium tepidumなどは硫化水素の他にチオ硫酸塩も電子供与体として利用できるが、その酸化機構に関しては不明な点が多い。今回、我々はC. tepidumの細胞からチオ硫酸塩酸化酵素を単離、精製したので報告する。細胞抽出物を、40-80%飽和硫安分画後、陰イオン交換クロマトにかけたところ、通過した画分はウマのシトクロームcの還元活性を指標としたチオ硫酸塩酸化活性を示した。これを、陽イオン交換クロマトに吸着、直線的NaCl濃度勾配で溶出させたところ、複数の蛋白質ピークが分離されたが、いずれのピーク画分も単独では活性を示さなかった。そこで複数の画分を混合したところ、高い活性を示した画分の組み合わせが得られたので、これらの画分をさらに精製後、そこに含まれるペプチドのN末端を決定した。C. tepidumuの全ゲノム配列情報からこれらのペプチドをコードする遺伝子は遺伝子クラスターとして存在し、これはα—プロテオバクテリアに属する Paracoccus pantotrophusで報告されているsox (sulfur oxidation)遺伝子クラスターとよく似たクラスター構造であった。今回精製された成分が光化学反応中心への電子供与に関与しているかどうか現在検討している。

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Excited-state dynamics of all-trans-spheroidene was studied by time-resolved fluorescence up-conversion method. In order to completely remove fluorescent impurities, spheroidene was purified by two series of alternate alumina and silica-gel chromatography. We used TOPAS, whose repetition rate is 1KHz, as our laser source. The laser output was separated to two beams, one worked as gating pulse, the other was frequency doubled by BBO crystal and was used as pumping pulse. The fluorescence and the gating pulse mixed inside the BBO crystal to generate up-conversion signal. Single photon counting system was used to acquire data. The fluorescence kinetics at different wavelengths was different from each other. The lifetimes of different wavelengths were in between 0.18ps to 0.33ps. After doing dispersion correction and intensity calibration, time-resolved fluorescence up-conversion spectra of all-trans-spheroidene was reconstructed. Single value decomposition followed by global fitting will be used to analyse the spectra.

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光合成系におけるカロテノイドからクロロフィルへのエネルギー伝達は、カロテノイドの内部転換に競合して起こる。カロテノイドのエネルギー準位は分光学的に決定されており、これらのエネルギー準位間の内部転換の時定数は、エネルギーギャップ則に従うものと推測される。本実験では共役二重結合数が11～13のリコペン、アンヒドロロドビブリン、スピリロキサンチンを対象とし、フェムト秒時間分解吸収スペクトルを測定した。上記のエネルギーダイヤグラムにより、共役二重結合数が11～13のカロテノイドの内部転換は、1¹B_u⁺ → 3¹A_g⁻ → 1¹B_u⁻ → 2¹A_g⁻ → 1¹A_g⁻の順に起こることが期待される。各内部転換の時定数はエネルギーギャップ則であらわされる各内部転換ステップのエネルギー差に依存しているはずである。上記の3種類のカロテノイドの時間分解スペクトルは、上記の4種類の一重項励起状態の存在を示している。特異値解析とグローバルフィッティング法を用いて、各電子状態のスペクトルパターンと寿命を決定し、エネルギーギャップ則との関係を検証する。

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アンテナ複合体における全トランスカロテノイドからバクテリオクロロフィルへの一重項エネルギー移動には、カロテノイドの1B_u⁺状態からバクテリオクロロフィルのQ_x状態や2A_g^-状態からQ_y状態といったチャンネルが存在する。共鳴ラマン励起プロフィールなどの分光法により共役二重結合数n = 9-13のカロテノイドで1B_u⁺, 2A_g^-状態間に3A_g^-や1B_u^-状態があることが知られており、2A_g^-がこれらの電子状態を経由する1B_u⁺からの一連の内部転換により生じると推測していた。
私たちはn = 10のスフェロイデンをRhodobacter sphaeroides 2.4.1より、n = 11のリコペンをトマトピューレより抽出後、2回のアルミナカラムと再結晶により精製した。ラマンシグナルの検出光として2つのパルスを用いて高い時間分解能を実現したサブピコ秒時間分解ラマンを、1B_u⁺の高い振動準位へ励起してこれらの測定を行った。遅延時間の異なるC=C伸縮ラマン線を帰属し1B_u⁺→3A_g^-→1B_u^-→2A_g^-という内部転換が起きていると解釈した。0-0遷移で励起した場合については、現在測定中である。
今後、特異値分解とグローバルフィッティングにより各励起状態のラマンスペクトルと寿命を決定し、内部転換の各遷移に関するエネルギー間隔と励起状態の寿命との関連を調査する方針である。

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   光合成系カロテノイドは、光反応中心(RC)では光保護作用を、アンテナ複合体(LH1,LH2)では補助集光作用を主に担っている。コア複合体はRCとLH1が結合した色素蛋白複合体であり、その中に含まれるカロテノイドは、各々の複合体に結合した状態でその機能を発現していると考えられる。今回、共役二重結合数nの異なるカロテノイドを含むRba. sphaeroides G1C, Rba. sphaeroides 2.4.1, Rsp. molischianum, Rps. acidophila 10050, Rsp. rubrum S1からコア複合体を調製し、脱気とアルゴンガスバブリングを行い、脱酸素の下で可視領域のサブマイクロ秒時間分解吸収スペクトルを測定し、三重項カロテノイドの寿命を決定した。
   還元剤アスコルビン酸ナトリウムを加えない場合には、コア複合体内のカロテノイド組成を反映したall-transタイプのT_n ← T₁吸収が現れ、これらはLH1由来の三重項カロテノイドのみであると考えられる。その寿命はnと直線関係になっており、nが増加するほど短くなっていた。一方、還元剤存在下では15-cisタイプのT_n ← T₁吸収が現れたことから、これはRC由来の三重項カロテノイドであると考えられ、その寿命はnに依らず一定であった。

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光合成系にあるカロテノイドは、光反応中心(RC)において光保護作用(三重項エネルギーの散逸)を担っている。RCでは電荷分離反応に始まる一連の電子伝達が起こっており、これは電子の蓄積状態を反映する酸化還元電位によって支配されているものと期待される。そこで、RCにおけるカロテノイドの三重項エネルギーの寿命を決定し、その寿命が還元剤の添加によってどのように変化するかを調べた。今回、Rhodobactor sphaeroides 2.4.1からRCを単離し、スペシャルペアバクテリオクロロフィルを励起して、可視領域のサブマイクロ秒時間分解吸収スペクトルを測定した。還元剤アスコルビン酸ナトリウムを50, 100, 200, 400 mM添加すると、三重項状態のカロテノイドのシグナルが大きくなり、ラジカルカチオンのシグナルは小さくなった。また、カロテノイドの三重項状態の寿命は順次短くなった。これらは、三重項状態の減衰速度が、生成した三重項状態の量に依存して増大していることを示している。このような三重項寿命の酸化還元電位依存性の報告例はない。現在、Rhodospirillum rubrum S1のRCについて調査しているところである。

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   緑色硫黄細菌Chlorobium limicolaのアンテナ複合体「クロロゾーム」は、光エネルギーを捉えて、光反応中心に一重項エネルギーを伝達している。クロロゾーム内には「ロッドエレメント」と呼ばれるバクテリオクロロフィル(BChl) cの高次会合体が存在しており、会合体特有の励起状態のダイナミクスが存在すると期待される。そこで今回は、近赤外領域における励起状態のダイナミクスを、サブピコ秒時間分解吸収分光を用いて追跡した。
   クロロゾームのSoret帯を励起して行った実験では、励起後直ぐにブロードな過渡吸収が近赤外領域に現れ、∼1 psの間に減衰した。また、クロロゾーム様のQ_y吸収帯をもつ高次会合体でも、クロロゾームと同様のダイナミクスが観測できた。それらとは対照的に、BChl cをメタノールに溶解した単量体でも測定を行ったが、クロロゾームとは異なるダイナミクスを示した。このことは、クロロゾーム特有の会合構造に起因すると考えられ、その詳細な励起状態のダイナミクスについては、現在検討中である。

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   緑色光合成細菌はクロロゾームというアンテナ複合体を持ち、光エネルギーを吸収して光反応中心に伝達する。その構造はバクテリオクロロフィルc (BChl c)異性体混合物の高次会合体であると考えられている。同位体置換したBChl cおよび置換していないBChl cを用いることで、in vitroで自己会合したモデル系BChl c会合体の構造は、ほぼ明らかになっている。同様の手法によってクロロゾームの構造を決定するには、再構成が必要不可欠である。再構成の確認は電子吸収分光、円偏光二色性(CD)スペクトルおよびショ糖密度勾配遠心で行った。
   Chlorobium limicola由来のクロロゾームからクロロホルム/メタノールによりBChl cを抽出し、脂質を含んだ緩衝液中に注入することにより、クロロゾーム様会合体を調製した。これに加えて、様々な方法を用いてクロロゾーム様会合体の作製を現在検討中である。

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円石藻のココリスは非常に微細かつ精巧な立体構造を有し、その形成機構は有機－無機複合ナノ結晶形成のモデルとして注目されている。これまで細胞内における結晶成長制御の詳細な分子機構は不明であるが、ココリス表面や細胞内のココリス形成部位に局在するα-1,3-マンナンを主鎖とする酸性多糖が結晶成長の制御に関与すると考えられている。我々はin vivoでの酸性多糖の機能を明らかにすることを目的とし、Emliania huxleyiのEST配列から酸性多糖合成に関わる遺伝子の同定を試みた。その結果、マンナン合成の基質となるGDP-Manを供給するGDP-Mannose pyrophosphorylase cDNAのホモログを特定し、クローニングすることに成功した。配列解析の結果、このcDNAは40.9 kDaのタンパク質をコードし、既知のGDP-Mannose pyrophosphorylaseと高い相同性を示すことが分かった。E. huxleyiのESTにはGDP-Mannose pyrophosphorylase cDNAが1種類しか見つからず、この酵素がココリス中の酸性多糖合成系に関わることが示唆された。本遺伝子の発現とココリス形成の関係について解析し、ココリス結晶形成における酸性多糖の機能について考察する。

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現在知られているラン藻の多くのグリセロ脂質のsn-2位はほとんど炭素数16の脂肪酸で占められており、それを決定しているのはリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT, EC 2.3.1.51)である。ラン藻Synechocystis sp. PCC6803 は3つのアシルトランスフェラーゼ様遺伝子sll1848、sll1752 、slr2060をもっている。これらはいすれも生存に必須ではないが、sll1848破壊株（Δ1848、 Δ1848 Δ2060）ではsn-2位の炭素数18脂肪酸の割合が増加し、sn-1位の脂肪酸の不飽和度の減少もみられた。Δ1848 、Δ1848 Δ2060ではクロロフィル量、光合成活性が減少し、生育速度の低下が起きた。また、低温感受性の増加もみられた。Δ1848 Δ2060ではsll1752遺伝子の発現が増加しており、炭素数18脂肪酸を基質にしたときのLPAAT活性が上昇していた。sll1752タンパク質は炭素数18脂肪酸特異的LPAAT活性を示し、大腸菌LPAAT変異株の温度感受性を相補した。以上の結果からsll1752は炭素数18脂肪酸特異的LPAATであり、ラン藻の生育に十分であるが、光依存的生育には最適ではないことが分かった。

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スルフォキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）は葉緑体に存在する主要膜脂質の中で唯一、硫黄を含む。我々は緑藻クラミドモナスにおける硫黄欠乏条件下でのSQDG代謝系の制御について解析した。クラミドモナスを硫黄欠乏条件に移行するとSQDGは6時間で移行前の10％程度に分解された。このSQDG分解の誘導は、転写阻害剤アクチノマイシンDもしくは翻訳阻害剤シクロヘキシミドの添加によって抑えられたことから、核コード遺伝子の転写・翻訳を必要とする事が示唆された。一方、6時間後以降でも3％程度のSQDGが保持されていた。これに対応して、硫酸イオンを基質としたin vivoでのSQDG合成活性は維持され、またSQDG合成に関与する酵素遺伝子SQD1 mRNAの転写産物が蓄積した。このSQD1 mRNAの発現誘導は、翻訳阻害剤の添加実験から核コードタンパク質の新規合成が必要であると考えられた。これらの結果から、硫黄欠乏条件下においてSQDGの分解系・合成系の遺伝子発現が核遺伝子の制御下で共に誘導されることが示唆された。

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高等植物の葉緑体とシアノバクテリアでは、その約50％を、ガラクトースを含む糖脂質、モノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)が占める。このMGDGの生合成は、高等植物では、UDP-ガラクトースとジアシルグリセロールを基質とし、MGDG合成酵素による1ステップの糖転移反応によって行われる。一方、シアノバクテリアでは、UDP-ガラクトースの代わりにUDP-グルコースを基質とし、モノグルコシルジアシルグリセロール(MGlcDG)がMGlcDG合成酵素により生成され、その後さらに異性化酵素が働き、最終的にMGDGが生成するという、2ステップであることがこれまでにわかっている。16S rRNAを用いた分子系統樹においてもっとも初期に分岐したシアノバクテリアであるGloeobacter violaceus PCC 7421では、ゲノム情報が既知のシアノバクテリアの中で唯一、シアノバクテリア型MGlcDG合成酵素遺伝子と植物型MGDG合成酵素遺伝子の両方が存在しているということがわかった(Awai et al., unpublished)。そこで我々は、これらの遺伝子をクローニングし、大腸菌で蛋白質発現させ、酵素活性を調べた。その結果、両遺伝子産物ともに、UDP-グルコースを基質としたMGlcDG合成酵素活性を持つが、UDP-ガラクトースを基質としたMGDG合成酵素活性は持たないことがわかった。発表では、さらに精製した酵素を用いた生化学的解析の結果についても報告する。

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モノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)は高等植物の葉緑体チラコイド膜において50%以上を占める主要膜糖脂質である。我々はシロイヌナズナより3つのMGDG合成酵素遺伝子（atMGD1、atMGD2、atMGD3）を単離し、その発現や機能の解析を行っている。その内、atMGD2, 3が葉緑体外包膜に局在しているのに対し、atMGD1は内包膜に局在し、また、光合成組織で最も高い発現を示すことから、チラコイド膜の構築に主要に寄与していると考えられている。このように、atMGD1は植物の生育に重要であると考えられるが、atMGD1の変異体はこれまでノックダウン体しか報告されておらず、その役割は未だ未解明な部分が多い。そこで、我々はatMGD1のノックアウト変異体(mgd1)を単離、解析したのでその結果を報告する。
mgd1は緑化できず、光合成活性もほとんど認められなかった。また、生育も非常に遅く、約4週で矮小なまま生育が止まった。mgd1の脂質解析をしたところ、MGDGの割合が極めて低くなっていたことから、atMGD1はMGDG合成の大半を担っていることが示された。この変異体では、胚発生の段階で既に生育阻害が起こっていたことから、atMGD1は発芽後の生育のみならず、胚発生時の形態形成にも重要な役割を担っていることが示唆された。

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We previously reported isolation and characterization of an Arabidopsis freezing tolerance 1 (frt1) mutant that showed mature-leaf-specific enhancement of the degree of freezing tolerance due to soluble sugar accumulation. Here, we showed that this mutant shows "restricted sucrose export" phenotypes. Thus, we renamed this mutant rsx1. As reported previously, the rsx1 mutant showed mature-leaf-specific accumulation of transitory starch. We also showed that GUS expression in the rosettes of RSX1promoter:GUS plants occurs in a basipital mode along the leaf vein, suggesting the correlation between RSX1 expression and the expression of source leaf functions. In accordance with this, ¹⁴C-sucrose-feeding experiments revealed that rsx1 plants are restricted in the sucrose export out of mature leaves. We also present some transmission electron micrographs, which strongly supported our hypothesis that RSX1 is a genetic factor involved in the establishment of sucrose translocation pathway in the source leaves of A. thaliana.

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高等植物において、ポリプレノールやドリコール等のZ,E混合型ポリイソプレノイドは、炭素数50-60、70-120という多様な鎖長分布で存在しているが、その生理的意義については不明な点が多い。我々はZ,E混合型ポリイソプレノイドの生理機能解明を目的として、基本骨格生合成を触媒するシス型プレニルトランスフェラーゼ（CPT）をコードするcDNA群をシロイヌナズナより単離し、環境ストレス下における発現応答を解析した。また、遺伝子ファミリーのなかでも、特にAtCPT5の機能解析を行った結果について報告する。
シロイヌナズナゲノム上に存在する9種のシロイヌナズナCPT相同遺伝子（AtCPT）について、乾燥、塩、低温、傷害などの環境ストレスを与えた実生における発現応答をRT-PCRによって解析した。その結果、AtCPT5は低温処理で、AtCPT8およびAtCPT9は塩処理で顕著に遺伝子発現が誘導されることが明らかとなった。酵母で発現させたAtCPT8およびAtCPT9は、C_75-110の長鎖ポリイソプレノイドを合成する活性を示すが、AtCPT5の酵素機能を解析したところ、C_30-35のポリイソプレノイドを合成する新奇な生成物鎖長特性を示す酵素であることが明らかとなった。これらの結果から、AtCPT5とその反応生成物が低温ストレス応答に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。

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シロイヌナズナのPHOSPHORYLETHANOLAMINE CYTIDYLYLTRANSFERASE 1 (PECT1)は，ホスファチジルエタノールアミン(PE)の主要な生合成経路であるCDP-エタノールアミン経路の鍵酵素をコードする遺伝子である．我々はPECT1の弱い変異アリルであるpect1-4とヌルアリルであるpect1-6の交配によってpect1-4/pect1-6 F1植物を作出した．この植物では，野生型に比べてPE含量が低下し，ロゼットや花茎の矮小化や花器官の発達異常がみられた．また，ロゼット葉では細胞数，細胞体積および細胞間隙の減少がみられ，花茎では髄の軽微な細胞伸長阻害と，垂直方向の細胞数の大きな減少がみられた．また，pect1-4/pect1-6 F1植物では，根端の分裂領域の範囲が狭くなっていることがわかった．さらに，Pro_PECT1:PECT1-EYFP:Ter_NOS融合遺伝子の発現は，あらゆる組織で認められたが，細胞増殖の盛んな領域で特に強かった．以上の結果から，細胞増殖におけるPECT1の機能の重要性が示唆された．一方，花茎やロゼット葉での細胞伸長の阻害や・細胞間隙の減少，花器官の異常は，細胞分裂以外のプロセス，例えば膜の分泌などに異常があるためと推察された．したがって，PECT1は，細胞の増殖・分化を通して正常な個体発生に寄与していることが示唆される．

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本演題ではトランスポゾンタグラインから単離した表皮細胞のクチクラが欠損した変異体cof1 (cuticular defect and organ fusion)を報告する。cof1変異体は本葉で器官の融合を示し、また不稔であった。トルイジンブルーテストやSEM、TEMによる観察からこの変異体では茎や葉のクチクラが減少していることが明らかになった。さらに、表皮細胞のワックス成分をガスクロマトグラフィーを用いて成分分析したところ、野性株と比べてクチクラ層を構成する主要な脂質成分、特にアルカンが著しく減少していた。このcof1変異体の原因遺伝子はWBCサブファミリーに属するABCトランスポーターであり、クチクラ欠損変異体cer5の原因遺伝子AtWBC12と相同性が高い遺伝子AtWBC11であることが分った。CER5は茎の表皮細胞の細胞膜に局在し、ワックスの成分である脂質を細胞内から細胞外へと輸送するのではないかと考えられている。またCFPとAtWBC11の融合タンパク質を用いてAtWBC11の細胞内での局在を調べたところ、細胞膜に局在すると考えられた。これらの結果からCOF1/AtWBC11はクチクラのワックスの輸送に関与することが強く示唆された。

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ラン藻Synechocystis sp.PCC6803のヒスチジンキナーゼ(Hik)とレスポンスレギュレータ(Rre)の網羅的な機能解析により、我々は様々な環境条件で機能するセンサー、シグナル伝達系を明らかにしている。そのうちHik33は低温、酸化、高浸透圧、高塩ストレスなどの複数の環境変化に応じて様々な遺伝子の発現を制御するマルチストレスセンサーとして働く、大変興味深いHikである。また、Hik33に相互作用する新規の因子（Ssl3451）が酵母2ハイブリッド法により得られている。
我々はSsl3451のHik33シグナル伝達系に関わる機能を明らかにするため、膜貫通ドメインを欠損したHik33(Hik33-c)とSsl3451を大腸菌内で大量発現し、精製した。Hik33-cは試験管内でATPに依存して自己リン酸化し、その放射活性は10分以内に最大値に達し、その後60分まで一定に推移した。この反応系にSsl3451を添加するとHik33-cのリン酸基取り込み活性は5～10倍に上昇した。パルスチェース実験の結果、Ssl3451はHik33の脱リン酸化への影響には関与しなかったため、Ssl3451はHik33-cの自己リン酸化活性を調節すると結論した。Hikのリン酸化活性を調節する因子はこれまで報告はなく、Ssl3451は初めて同定されたHikの活性調節因子である。

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ラン藻Synechococcus elongatus strain PCC 7942には、ABC型の硝酸イオン・亜硝酸イオン輸送体(NrtABCD)に加えて、潜在的に硝酸イオンを輸送することのできるSulPファミリー輸送体(LntT)が存在する。我々は、レスポンスレギュレーター(LntA)がハイブリッドヒスチジンキナーゼ(LntB)によりリン酸化されている時に、LntT輸送体は活性化されていることを昨年の本学会で報告した。lntAB遺伝子クラスターの下流には、自己リン酸化ドメインを欠いたハイブリッドヒスチジンキナーゼをコードしている遺伝子(lntC)が存在する。そこで今年は、LntT輸送体活性制御機構におけるLntCの役割について報告する。in vitroリン酸転移反応実験の結果、LntBが自己リン酸化したリン酸基は、LntAを介してLntCのヒスチジン残基に転移されることが明らかになった。またLntCのヒスチジン残基は、in vivoでLntT輸送体を活性化するのに必須であった。さらにLntCのC末端にはユニークな領域があり、この領域を二量体を形成することが知られているグルタチオン S トランスフェラーゼとの融合タンパク質としてラン藻細胞内で発現させると、LntT輸送体が活性化されることが示された。これらの結果から、LntCがLntBとLntAによりリン酸化されることによって二量体となることが、LntT輸送体を活性化するのに重要であると推定された。

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シロイヌナズナのAtMID1A遺伝子産物（AtMid1A）はCa²⁺透過性伸展活性化陽イオンチャネル活性に関与することが示され（2004年度年会）、そのホモログであるAtMID1B遺伝子産物（AtMid1B）と共に機械刺激センサーとして細胞内にCa²⁺シグナルを発生させると考えられている。我々は昨年度の年会において、atmid1a/b二重欠損株の生育が、培地中の高濃度のMg²⁺によって野生型株の生育よりも著しく抑制され、この生育抑制が培地CaCl₂を添加することにより緩和されることを示した。本年会では、培地中のCaCl₂濃度を低下させた場合に、生育抑制に必要なMgSO₄の濃度が低下することを示す。この結果は、培地中でCa²⁺に対するMg²⁺の濃度比が高くなると、atmid1a/b二重欠損株に生育抑制が起こることを示している。このようなatmid1a/b二重欠損株の表現型の説明として2つの可能性が考えられる。すなわち、(1) Mg²⁺は天然のCa²⁺チャネルブロッカーなので、Mg²⁺がAtMid1A/B以外のCa²⁺透過チャネルをブロックし、細胞内Ca²⁺濃度を低下させる。(2) 取り込まれたMg²⁺が細胞内におけるCa²⁺のはたらきを妨げる。本発表では、以上二つの可能性について解析し、その結果を議論する。

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伸展活性化Ca²⁺透過チャネルは、機械刺激のセンサーの1つと考えられている。我々は出芽酵母の伸展活性化Ca²⁺透過チャネル候補の変異株（mid1）の致死性を相補するシロイヌナズナの遺伝子2つ（AtMID1AとAtMID1B）を特定することに成功した（第45回年会）。根の接触刺激応答を調べるために二層寒天法を開発した。この方法では1.6%寒天培地を下層に、0.8%寒天培地を上層にした。二層寒天法を行った結果、atmid1a株およびatmid1a atmid1b株では根が下層に移行できない割合が野生株およびatmid1b株に比べ高かった。根におけるCa²⁺蓄積量を測定した結果、AtMID1A高発現株は野生株と比べて顕著に高かった。また、AtMID1A高発現株の根におけるCa²⁺蓄積量は伸展活性化イオンチャネルの阻害剤であるGd³⁺で阻害され、電位依存性Ca²⁺チャネルの阻害剤であるverapamilでは阻害されなかった。これらの結果は、AtMid1Aが根の接触刺激応答とCa²⁺取込みに関与する伸展活性化Ca²⁺透過チャネルの構成成分であることを示唆する。

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イネ完全長cDNA配列データ（32,127）について、BLAST等を用いて、動植物の既存の膜輸送遺伝子との相同遺伝子を検索し構造比較することにより、各生物における膜輸送の調節機構の特異性について考察した。
高等植物の膜輸送タンパクの種類数は、ヒト、ハエ、線虫とほぼ同数であり、酵母、カビ、細菌の2倍以上であり、動物ではチャンネルが植物ではポンプとトランスポーターが組織及び発生ステージ特異的に多様化していることが判明した。また、2次能動輸送系では動物がNa ^＋勾配を利用する輸送系を植物がH ⁺勾配利用系を発達させていることが認められた。そして、水輸送チャンネル、プロトンポンプ、トランスポーター（薬剤、アミノ酸、カチオン、etc）の種類が植物で豊富な一方で、電位依存チャンネル、Na ⁺/K ⁺ポンプ等は動物特異的な発達がみられた。遺伝子構造の比較より、植物では複数のポンプやトランスポーター間では基質が異なっていても基本構造が類似していることや、多くのチャンネルは動物のものよりも簡略化した構造であることなどが判明した。更にイネとシロイヌナズナにおいて比較解析を行った結果、イネではP-ATPase, CNGC, K ⁺ channel, MATE等の種類が少ない一方で、Carbohydrate Transporter等がより組織及び発生ステージについて多様性を示した。

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アブラナ科植物の自家不和合性における花粉－柱頭間の自他識別は、柱頭の細胞膜上の受容体型キナーゼSRKと花粉表層タンパク質SP11のSハプロタイプ特異的な相互作用を介して行われていることがこれまでに明らかとなっているが、自己花粉の吸水・発芽阻害に至るSRK以降の情報伝達系に関しては依然未解明である。近年、我々は自家和合性変異株Yellow salsonの解析から、膜結合型キナーゼMLPK（M-locus protein kinase）を同定したが、その機能については明らかとなっていない。
今回我々は、MLPKが転写開始点の異なる2つの転写産物（MLPKf1、MLPKf2）により翻訳されていることを見出した。また、タバコ培養細胞での一過的発現系を用いることによって、MLPKf1はN-ミリストイル化を介して、また、MLPKf2はN末端の疎水性領域を介してと、それぞれ異なる機構で膜に結合していることを示した。
さらに、MLPKf1のミリストイル化モチーフに変異を入れたコンストラクト（MLPKf1G2A）を構築し、MLPK欠損株の乳頭細胞に一過的に発現させることで、野生型MLPKを発現させた場合とは異なり、MLPKf1G2Aには、MLPK欠損株を相補する活性がないことを示した。以上の結果は、MLPKが自家不和合性の情報伝達系において機能するためには、MLPKの膜局在性が必須であることを示唆する。

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COP9シグナロソーム（CSN）は、タンパク質分解系を介して植物の光形態形成を抑制する核内タンパク質複合体であるが、その機能はさらに多岐にわたると考えられている。動物CSN1サブユニットのN末部位（CSN1N）はJNK1/SAPK情報伝達経路においてJNK1の転写を抑制する。この抑制機能は阻害剤などを用いた実験の結果、タンパク質分解系を介さないことが強く示唆された。この新規機能を解析するため、CSN1Nに直接結合する因子（NBP）群を探索した。
得られたNBPの一つであるSAP130はSF3b複合体のサブユニットであり、スプライソソームのU2 snRNPやSTAGA複合体と相互作用することから、CSNがSAP130などを介してmRNAの代謝調節を担っていることが伺える。植物においても類似の機能が存在するか否かを解析するために、シロイヌナズナよりSAP130相同遺伝子AtSAP130を単離・同定した。AtSAP130遺伝子は第3染色体に2コピー存在し、それらがコードするタンパク質は同一のアミノ酸配列であった。この知見をもとに、形質転換植物の作成とその解析を進めている。今回、植物のCSN1NとAtSAP130の相互作用について解析した結果を報告する。

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The SNF1/AMPK kinases are highly conserved in eukaryotes. Protein kinases of this subfamily exist as catalytically active hetero-trimeric complexes consisting of α, β and γ subunits. Previous reports indicate that interaction between α and γ subunits of SNF1 kinase are strongly in accordance with the deprivation of glucose in the growth medium. Our yeast two-hybrid experiments with the three subunits rice SnRK1 complex convincingly show that the interaction not only between α and γ, but also β and γ subunits is mediated by deprivation of glucose in the growth medium. Some of the experimental evidences also suggest that both dimeric and trimeric forms of protein complexes may exist in vivo .These findings suggest that the regulatory γ subunits of rice SnRK1 may recognize specific signals and interacts with the dimeric complexes comprising of α and β subunits and thus stimulate the catalytic activity of the enzyme complex.

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Using a dynamic method which enabled simultaneous measurement of the cell length and turgidity of Characean internode, a rectilinear correlation was found between them, within 4 sec or so immediately after the step change in outer osmotic pressure. By studying the time dependency of these parameters, the velocity of the water flow V across the cell membrane can be observed instantaneously. Further, the absolute water conductivity Lp can also be estimated from V and the shift in water motive force across the membrane. Then the difference in Lp was accomplished by comparing the effluxing and influxing situations through changing π_e from the holding osmotic pressure of 150 mM mannitol solution to either 200 mM or to 50 mM. There was no significant difference in Lp between them suggesting that the membrane itself is not a rectifier for the water flow.

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ヨシ(Phragmites communism)は耐塩性植物であり、塩類集積土壌においても地上部Na濃度を低く保つことができる。これは根から吸収されたNaを茎基部（根と地上部の境界）で再び根に送り返す機構を持つためとされている。本研究では塩感受性のイネ (Oryza sativa)を対照植物とし、イネ基部、ヨシ茎基部のイオン移行抑制能を定量的に評価した。ヨシ茎基部はイネ基部よりもイオン移行抑制能が高く、特にNaCl処理において抑制は顕著だった。細胞内Na^＋特異的蛍光プローブを用いた蛍光顕微鏡観察を行ったところイネ基部では蛍光が組織および細胞に広がっていたが、ヨシ茎基部では維管束周辺の細胞内に顆粒状の構造物が観察され、その顆粒と蛍光の位置は一致していた。顆粒の成分は糖が78％(w/w）で、グルコースのみが検出され、グルカン鎖長分布から主成分は澱粉であることが示された。この顆粒のNa含量は0.21%(w/w)で茎基部の澱粉含量より換算すると、ヨシ茎基部中の全Naのうち少なくとも17％が顆粒に含まれていることになる。また顆粒のK含量は0.22%(w/w)でNa含量と同程度だが、この実験に使用したヨシ茎基部の全Na含量は全K含量の1/10であった。以上のことからこの顆粒はNaを選択的に集積しており、ヨシ茎基部のNa移行抑制機構の中核を担っていることが示唆された。

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ヨシは高塩濃度条件下でも地上部の塩含有率を極端に低く抑えることが出来る耐塩性植物である。我々はヨシが茎基部でNaCl特異的にイオンの地上部移行を抑制することを定量的に示した(2005年日本植物生理学会新潟大会)。このNa⁺地上部移行抑制能は茎基部のホットガードリングやATPase阻害剤により失われることが知られている。つまり、ヨシ茎基部では導管からNa⁺を強力に回収するために、Na⁺特異性を持つトランスポーターやチャネル等が発達していると推測される。我々はこのNa⁺地上部移行抑制機構に関わる輸送担体の特定を試みており、その候補の一つとしてヨシからNHX1様遺伝子のcDNA全長とゲノミッククローンの一部を単離し配列を決定した。イネのOsNHX1と比較したところヨシNHX1様cDNA配列は88%、アミノ酸配列では81％の相同性があった。サザン解析で、ヨシのゲノム上にはNHX1様遺伝子が少なくとも2つ存在すると推測され、ゲノミッククローンの部分配列解読により2種の高い相同性を示す遺伝子の存在が強く示唆された。ノーザン解析によりヨシNHX1様遺伝子は、塩濃度に関係なく地上部で発現し、茎基部では弱い塩誘導性がある事が示された。従ってヨシのNHX1様遺伝子は茎基部での地上部移行抑制機構に関与していると共に地上部で少量移行したNa⁺の液胞内への隔離に関与している可能性が示された。ヨシNHX1様のNa⁺輸送能及び茎基部での他カチオンとの競合特性についても考察する予定である。

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我々は植物およびラン藻のNa⁺/H⁺アンチポーターの機能解析を進めている。Synechocystis PCC 6803には、少なくとも5種類のNa⁺/H⁺アンチポーター遺伝子が存在するが、その中のNhaP型Na⁺/H⁺アンチポーター(SynNhaP1)は、植物、動物、バクテリアのものと相同性が高い。一方、NapA型アンチポーターについては、その性質や生理的機能などほとんど明らかになっていない。
今回、耐塩性ラン藻であるAphanothece halophyticaからNapA型Na⁺/H⁺アンチポーター遺伝子を単離し、性質を調べた。2つのNapA型アンチポーター遺伝子(ApNapA1-1, ApNapA1-2)を単離したところ、ApNapA1-1はApNapA1-2よりもSynechocystisのNapA(SynNapA1)との相同性が高かった。ApNapA1-1, ApNapA1-2, SynNapA1の性質を比較したところ、3つのアンチポーターは全て大腸菌変異株のNa⁺およびLi⁺感受性を相補し、強いpH依存性の交換活性を示したが、ApNapA1-2の活性は他の2つより低かった。ApNapA1-2のみがK⁺取り込み活性を欠失した大腸菌の変異株を相補した。これらのアンチポーターの構造と機能の関係について解析した結果についても報告する。

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