単面葉とは，葉身が一般的な葉（両面葉）の背軸面に相当する組織だけで構成される，背腹性を持たない葉のことである．興味深い事に，このような葉を持つ植物は，単子葉植物で何度も繰り返し進化している．また，一般に葉身の平面成長は，葉の向背軸の境界部で促進されると考えられているが，単面葉を持つ多くの植物においても，独自の平面成長機構により，平らな葉が形成される．我々は，この単面葉における葉身の背軸側化機構および葉身の平面成長機構を解明するために，イグサ属植物のコウガイゼキショウ（Juncus prismatocarpus）をモデルとして研究を進めており，現在までに，遺伝子発現解析や，近縁種間の比較分子遺伝学的解析などを行い，その発生制御に深く関与すると考えられる，主要な遺伝子候補群を同定してきた．
今回，未知の因子を同定し，さらに単面葉の発生機構を遺伝学的に解明するために，コウガイゼキショウにおける突然変異体の単離系を構築し，発生遺伝学的解析を試みた．まず，効率的な突然変異体単離のための変異源処理条件を確立し，現在までに，葉鞘が向軸側化する変異体，葉身の平面成長性に異常をしめす変異体など，複数の興味深い変異体を単離する事に成功している．本報告では，これらの変異体を用いた発生遺伝学的解析と，これまで得られた分子遺伝学的知見を統合し，単面葉の発生進化機構を議論する．

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リボソームタンパク質の欠損変異株や、リボソーム合成に関わるタンパク質の欠損異株は、しばしば、葉が菱形に尖るという特徴的な表現型を示す。我々はこれまでに、20系統以上の葉が尖る突然変異株を単離し、その表現型解析を進めてきた。その過程で、これらの変異株の幾つかが、軽微な向軸側の欠損を示すasymmetric leaves1 (as1)/as2変異株の表現型を強く促進することを見いだした。これに関連した解析をさらに進めたところ、葉が尖る突然変異株の全てが、背腹性異常を促進する訳ではないことが明らかになった。また、背腹性異常の促進効果にも強弱が認められた。そこで、向背軸異常の促進効果の違いが生じる原因を明らかにするために、これらの突然変異株における変異部位の特定を進めた。その結果、表現型の促進効果を示すものは、リボソームの60Sサブユニットの構成因子やリボソームの生合成に関わる因子の欠損変異であることが明らかになった。表現型の促進効果が認められないものについては、原因遺伝子のクローニングを進めている。これらの結果を踏まえ、葉の背腹性の制御に関わる遺伝子の、リボソームを介した特異的発現制御機構に関して議論する。

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葉の向軸側・背軸側それぞれに必要な生長制御因子が局在することで、その正常な発生・分化が起こる。しかしながら、葉原基での向背軸領域の境界決定機構は不明なままである。本研究ではシロイヌナズナを用い、向軸側鍵因子PHB、PHBの発現抑制に関わるmiR165/166、背軸側鍵因子FILに着目し、その境界決定機構を解析した。まず始めに、プロモーター・蛍光タンパク質の融合遺伝子を導入した形質転換体を用いてPHBとFILの発現様式を調べたところ、PHBの発現が背軸側の一部で見られ、両者の発現領域が部分的に重なっていた。一方、miR165/166によって発現抑制を受けるGFPを強制発現させると、そのGFP蛍光は向軸側に見られ、FILの発現領域とは完全に分離する。そこで、レーザーマイクロダイセクション法と半定量的RT-PCR法を用いてmiR165/166の局在を調べた。葉原基の向軸側・背軸側それぞれを切り出したサンプルからRNAを抽出し、ゲノム上に9つあるpre-miR165/166の発現を調べた。その結果、6つの遺伝子座が背軸側でのみ発現していた。以上の結果から、葉原基の背軸側でmiR165/166が特異的に発現することで、そこでの不要なPHBの発現が抑制され、向背軸境界が形成される事が示された。また背軸側におけるPHBの発現抑制機構についても議論する予定である。

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植物の地上部は茎頂分裂組織から向背性をもつ葉が規則正しく形成されることによって連続的に発生を行う。我々は茎頂分裂組織および向背軸に異常を示すシロイヌナズナ変異体enf1変異体の単離・解析を行ってきた。この変異体の原因遺伝子ENF1は一次代謝の酵素をコードしていたことから、茎頂分裂組織や葉の形成に関わる新たな物質が存在し、その物質自体あるいは前駆体の量や分布が異常になり形態異常を引き起こしたと考えた。
そこで野生型とenf1変異体の地上部全体および茎頂部とにおいて変化している代謝物をGS-MS法を用いて調べた。enf1変異体においてクエン酸回路に含まれる代謝物量が茎頂部で特に大きく減少していたことから、ENF1は茎頂部でクエン酸回路への物質の供給に関わることが示唆された。一方、多くのアミノ酸類は変異体により多く蓄積していた。
さらに代謝異常と形態形成異常とのつながりを明らかにする目的でトランスクリプトーム解析をおこなった結果、enf1変異体では多くの転写制御因子の発現の上昇が観察された。これらの中には発生に関わる既知の転写因子も含まれている。以上のことから、代謝異常が本来発現が制限されている転写因子群の発現を促進することで、形態形成異常を引き起こした可能性が示唆された。

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多くの植物の葉では、柵状組織と海綿状組織など、向軸側(表側)と背軸側(裏側)で異なる細胞分化が見られる。このような細胞分化が起こるのは、向軸側または背軸側の領域でのみ発現する遺伝子が、それぞれの細胞分化を促すためだと考えられている。しかし、これら遺伝子の発現領域がどのように決定されるのかはあまりわかっていない。
我々は背軸側だけで発現する遺伝子の一つ FILAMENTOUS FLOWER (FIL)の発現領域を決定する機構を明らかにするため、分子遺伝学的な解析を行っている。我々が単離した新規突然変異体 enlarged fil expression domain2 (enf2)は FIL の発現領域が野生型よりも広くなることから、その原因遺伝子 ENF2 は FIL の発現領域を狭くする機能を持つと考えられた。
しかし FIL の発現パターンをより詳しく解析すると、葉の発生の極初期においては、野生型と enf2 変異体の間で FIL の発現領域に差はなく、ともに葉原基の大部分に及んでいることがわかった。つまり ENF2 遺伝子は、発生の進行に伴って FIL の発現領域を次第に狭めてゆく機能を持つと考えられた。
現在、野生型における FIL 発現領域の変化を経時的に解析するとともに、その過程が ENF2 遺伝子によってどのように制御されているのかを明らかにしようとしている。

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ASYMMETRIC LEAVES2 gene is one of key regulators of morphogenesis of leaves in Arabidopsis thaliana. It encodes a protein with a AS2/LOB domain that consists of the C-motif, the conserved glycine residue and the leucine-zipper-like sequence. The AS2/LOB domain includes a short stretch of basic residues in the C-motif. The AS2 protein localized to a sub-nuclear body that is adjacent to nucleoli and we designated this body as the AS2 body. In order to identify the signal in AS2 required for the localization to the AS2 body, we have made DNA constructs that encoded mutant AS2 proteins with various deletions and amino acid substitutions in the AS2/LOB domain and we have investigated sub-nuclear localization of the mutant proteins. We also have examined whether the localization to the AS2 body might be required for AS2 function in morphogenesis of leaves. We will present latest results of these experiments.

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植物の葉は茎頂メリステムから発生し、基部先端部軸、向背軸、中央側方軸に沿って成長する扁平で左右相称的な器官である。シロイヌナズナのasymmetric leaves1 (as1)とas2変異体はこの三つの軸すべてに異常を示し、葉身の左右非対称的な切れ込みや上偏成長、弱い背軸側化、基部先端部軸方向の成長抑制が認められる。我々はこれまでに、マイクロアレイとクラスタリングを行い、AS1とAS2の下流因子を網羅的に調べた。クラスタリングを行うにあたって、知識ベースに基づいた新規クラスタリング手法KB-FuzzyARTを開発した。解析の結果、AS1とAS2はclass 1 KNOX遺伝子であるBP, KNAT2, KNAT6の発現を抑制しているだけでなく、葉の背軸側因子であるETTIN (ETT), YABBY5 (YAB5)の発現も抑制していることを報告した。これら因子の遺伝的な関係を明らかにするため、as2 bp knat2 knat6四重変異体やas2 ett arf4三重変異体におけるBP, ETT, YAB5の発現レベルをreal-time PCRで調べた。その結果、AS1とAS2はBP, ETT, YAB5を独立に抑制していることを示唆するデータを得た。AS1とAS2は複数の遺伝子経路を抑制することによって、扁平で左右相称的な葉の形成に関わっていることが考えられる。

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シロイヌナズナにおいて、扁平で左右対称な葉の発生に必要であるAS2遺伝子は、植物に固有の新奇なタンパク質をコードしており、AS1遺伝子と共に、class 1 KNOX遺伝子を含む複数の遺伝子の発現制御に関わることがわかっている。これまでの我々の解析から、器官の背軸化に関わるETT/ARF3, KAN2, YAB5遺伝子が、class 1 KNOXとは独立の経路でAS1とAS2によって制御されていることが示された。35S:AS2-GR形質転換体において、DEX投与によるAS2の機能誘導後のこれらの遺伝子の発現量の変化を解析した結果、ETTは2時間以内に発現量が減少した。さらにシクロヘキシミドを同時に加えた場合も発現量が減少したことから、AS2によるETTの抑制にはタンパク質合成を必要としない事が示唆された。ETTとARF4は共に、trans-acting siRNA (tasiR-ARF)による分解制御を受けることが知られる。本発表ではAS2がどのようにETTを制御しているかについて議論したい。

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シロイヌナズナでは、葉の形成に複数の遺伝子と複数の制御系が関与することが明らかになりつつある。asymmetric leaves2 (as2)変異体は、左右非対称な葉の切れ込み、葉脈パターンの乱れ、葉身の上偏成長など、葉の形態に多面的な表現型が認められ、複数の系路に関与すると考えられる。AS2遺伝子はcisteine repeatsとleucine zipper様配列を含む植物固有のAS2ドメインをもつタンパク質をコードする。AS2は茎頂メリステム特異的なclass I knox遺伝子群の発現を抑えるだけでなく、葉の裏側化因子ETTIN、KANADI2、YABBY5を抑制することにより葉の表側細胞分化を促進すると考えられるが、その分子機構は不明な点が多い。我々はAS2とともに葉の形態形成に関わる新奇因子を同定するため、as2-1の亢進変異体の解析を進めてきた。as2亢進変異体#27は単独変異体ではやや下向きの葉を形成し、成長が遅くなるが、as2-1 #27二重変異体は葉身のある葉を数枚形成した後に棒状の葉を形成する。従って#27変異はas2-1の葉の表側細胞分化の低下を亢進していると期待される。さらにAS2とともに機能すると考えられるASYMMETRIC LEAVES1と#27の二重変異体も棒状の葉を形成する。今回は#27変異体の表現型とその原因遺伝子について報告する。

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イネの種子形を制御する遺伝子を同定し、その生化学的機能を解明することは、種子形デザインの可能性を広げると考えられる。我々は、Taichung 65を親品種にもつ、イネ短粒変異体small and round seed1-1 (srs1-1) の変異原因遺伝子をマップベースクローニング法によって同定した。srs1-1 の変異は弟7染色体長腕97.4cM近傍に座乗するcDNA(AK120310)内に存在する可能性が示唆された。アグロバクテリウム法によってsrs1 にcDNA(AK120310)を用いて、相補実験を行ったところ、形質転換体の表現形は野生型に回復した。以降、cDNAをコードする遺伝子をSRS1 と呼ぶ。SRS1 は、10個のエキソンから構成され、全長cDNAは1366アミノ酸をコードしていた。N末端180アミノ酸領域にCIP7と相同性が見られたが、CIP7においては、この領域は機能ドメインではなかった。srs1-1 は第7エキソンに38塩基の欠失が生じていた。cDNA(AK120310)の情報に基づいて関連する短粒変異体を解析したところ、新たに4種類の短粒変異体 (srs1-2, srs1-3, srs1-4, srs1-5) がsrs1-1 のアリルであることが明らかになった。現在、SRS1タンパク質の生化学的解析を進めている。

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イネ種子の縦方向の伸長に関与する遺伝子として、3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子、ブラシノステロイド生合成パスウエイを触媒するD11やD2遺伝子などが報告されている。今回は、イネ種子の縦方向の伸長が抑制された新規変異体、TCM1173の変異原因遺伝子を同定したので、その結果を報告する。TCM1173の変異原因遺伝子はマップベースクローニング法により同定した。その結果、変異原因遺伝子は第5番染色体に座乗し、推定遺伝子領域Os05g06280.2と一致した。以降、この変異体をsmall round seed 3-1(srs3-1), 正常型遺伝子をSRS3と呼ぶ。データベース解析によって、この遺伝子産物は、キネシンスーパーファミリーに属するキネシン13グループに分類された。SRS3は12個のエキソンより構成され、全鎖長cDNAは819個のアミノ酸をコードしていた。モータードメイン領域はエキソン3からエキソン10に位置した。srs3-1 は、モータードメイン領域内の、第9エキソン内に1塩基置換を生じ、その結果、ロイシンがフェニルアラニンに変化していた。アグロバクテリウム法にて、SRS3の全鎖長cDNAをsrs3-1 に導入し、相補テストを行った結果、srs3-1 の表現型は野生型に相補した。

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イネの低温下における発芽性は、寒冷地における直播適性確保のために重要な形質である。低温発芽性に優れるヨーロッパ産品種と日本産品種、「Dunghanshali」×「かけはし」のQTL解析によって、低温発芽性に優れるヨーロッパ産品種由来のQTLを3箇所見いだした。このうち、低温下における発芽と初期成長の良さに強く連鎖していた3番染色体のQTL領域についてシークエンス解析を行ったところ Histone-like 領域を持つ転写因子のサブユニットと思われる遺伝子上にアミノ酸置換を伴う塩基置換が起こっていた。この遺伝子のシロイヌナズナ相同遺伝子について破壊株を用いて発芽性試験を行ったところ、破壊株では野生型に比べて適温、低温下ともに発芽の遅延が見られた。また、破壊株では芽生えの生育が低温条件で強く阻害された。これらのシロイヌナズナの破壊株の形質は、イネにおいてヨーロッパ産品種に比較して日本産品種で見られる形質に似ていることから、日本産品種のイネではこの遺伝子の機能が失われる、または弱くなることによって低温発芽性に劣った形質を示したと推察される。

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高温による種子発芽の抑制（高温阻害）は、冬生1年生草本種子が生育に適切な秋に発芽することを可能としている。高温阻害の分子機構を理解するため、これまでに高温阻害に耐性を示すシロイヌナズナの突然変異、および発芽可能な上限温度で発芽しない突然変異を選抜し、解析してきた。ここでは、コロンビア系統種子の高温阻害を緩和する化合物および発芽可能な上限温度（28℃）で発芽を抑制する化合物を選抜した。また、高温耐性発芽突然変異、trg1種子の32℃における発芽を抑制する化合物の選抜も行った。おもしろいことに、28℃における発芽を抑制する化合物は、22℃での発芽を抑制しなかった。また、このほとんどはtrg1種子の高温耐性発芽を抑制せず、trg1種子の高温耐性発芽を抑制する化合物のほとんどは野生型種子の発芽を抑制しなかった。これらのヒット化合物は、発芽の高温阻害機構の理解に有用であると共に、作物種子の発芽を制御する薬剤の開発に利用できると期待される。

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種子休眠性は植物体の生長に不適な環境での発芽を抑制し、繁殖の可能性を高めるための植物の重要な適応形質の一つである。種子の休眠と発芽には、拮抗的な作用を持つ植物ホルモン・アブシジン酸(abscisic acid: ABA)とジベレリン(gibberellin: GA)が深く関与する。前回我々は、2つのAPETALA2ドメインを持つ転写因子をコードするシロイヌナズナCHO1遺伝子(At5g57390)の変異が、種子発芽におけるABA感受性の低下の他、種子休眠性の低下をもたらすことを報告した。野生型の休眠性は種子採取後に乾燥保存(後熟)を経ると低下するが、cho1種子ではより短期間の後熟によって休眠性が喪失する。逆に、CHO1を過剰発現した形質転換種子では、長期の後熟を経てもABAに高感受性を示す。異なる後熟期間を経た種子を用いた遺伝子発現解析では、cho1種子の休眠性の低下は、吸水過程におけるGA生合成遺伝子、ABA異化代謝遺伝子の発現レベルの上昇と、ABA生合成遺伝子の発現レベルの低下と相関していた。また、これと一致してcho1吸水種子では、後熟を経ないでも、野生型に比べて内生GA₄レベルが上昇しABAレベルが低下していた。今回はこれらの結果を踏まえ、ABAを過剰蓄積するcyp707a2変異体、ならびにGAを欠損するga1-3変異体バックグラウンドにおける解析結果を報告する。

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シロイヌナズナの種子成熟・発芽におけるアブシジン酸（ABA）活性化型SnRK2タンパク質リン酸化酵素SRK2D、SRK2E、SRK2Iの機能を調べた。これらの遺伝子は種子成熟・発芽時に発現し、タンパク質は核に局在していた。srk2d srk2e srk2i三重変異体では、種子成熟時に乾燥感受性が見られ、莢の生長阻害や種子成熟阻害が見られた。srk2d srk2e srk2i三重変異体は他の二重変異体やabi変異体に比べはるかに強いABA非感受性を示した。また、この三重変異体では高湿度条件下で穂発芽が見られた。ABI5断片を基質にしたゲル内リン酸化実験を行ったところ、srk2d srk2e srk2i三重変異体種子では42-kDのリン酸化が見られなくなったことから、三重変異体種子ではABI5のリン酸化が阻害されていることが示唆された。トランスクリプトーム解析により、三重変異体種子では、ABI5によって制御されていると考えられる多くのABA応答性遺伝子の発現レベルが低下していることが明らかになった。さらに、それ以外の多くのABA関連遺伝子の発現も大きく変化していることが示された。すなわち、三重変異体の種子ではABAシグナル伝達が完全に止まっており、正常な種子成熟・発芽制御が妨げられていることが示唆された。

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シロイヌナズナにおいて、26Sプロテアソームの各サブユニットの欠損が引き起こす表現型は一様ではない。このことは、サブユニットの組み合わせにより複合体の性質が異なる可能性、または個々のサブユニットが単独で機能を有する可能性を示唆している。我々は、種子発芽においてABA高感受性を示すシロイヌナズナのahg12変異体を分離し、26SプロテアソームのサブユニットであるRPT5aをコードする遺伝子にミスセンス変異を同定した。ahg12変異体はABA高感受性以外にも休眠性の低下や光による種子発芽誘導性の低下など多面的な表現型を示し、その組み合わせは他のサブユニットの変異体とは異なっていた。また、ahg12変異体では26Sプロテアソームの基本的な機能には大きな影響がないと考えられ、RPT5a欠損株とも表現型が異なることから、RPT5aの機能の一部のみが変化していると考えられる。ahg12変異はこれまでに報告のない優性のミスセンス変異であるため、サブユニットの分子機能に関して、欠損変異の解析では得られないような情報の取得が期待できる。現在、ahg12変異がタンパク質分解の選択性に寄与する可能性について検証し、表現型とタンパク質分解の接点を探索している。

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高等植物において発芽直後の成長は個体の生存にとって重要である。発芽直後の植物体はエネルギーの大部分を成長のために分配し、脂質やデンプンなどの貯蔵物質合成への分配は少ない。我々はシロイヌナズナにおいて発芽直後における炭素分配を制御する分子機構を明らかにするため、CRES-T法により転写因子の機能を抑制させた変異体ライブラリーから発芽直後の生育にスクロースを要求するものを選抜した。その結果、zinc fingerドメインをもつ転写因子の1つが発芽直後の貯蔵物質への炭素分配を制御していることが示唆された。我々はこの転写因子をLOG1（low growth 1）と名付けた。log1はスクロース非添加培地においてWTと比べて成長が遅いものの、スクロース添加培地ではWTと同程度の成長を示した。またlog1は播種3、5日目の個体において、WTと比べて可溶性糖含量が低く、デンプン含量が高いことが示された。さらにlog1ではデンプン合成の鍵酵素であるADP-glucose pyrophosphorylaseのlarge subunitであるAPL3、4の発現量増加が認められた。以上よりlog1は発芽直後の植物体において、APL3、4の発現を負に制御することでデンプンの蓄積を抑制し、貯蔵物質への炭素分配を制御していることが示唆された。

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シロイヌナズナの未熟種子は，分化した5つの細胞層からなる珠皮をもつ．最も外側の珠皮細胞層である外珠皮第2細胞層は，種子形成に伴ってムシラーゲと呼ばれるペクチン性多糖を大量に蓄積する特徴がある．我々は，植物特異的なNAC転写因子ファミリーに属する2遺伝子が，機能重複して種子形成を制御することを最近明らかにした（1）．NARS1およびNARS2と命名したこれら遺伝子は，ともに未熟種子の外珠皮細胞特異的に発現しており，nars1 nars2二重変異体の外珠皮第2細胞ではムシラーゲの蓄積異常を示す．NARSが制御するムシラーゲ蓄積の分子機構を明らかにするために，NARSの下流で機能する因子の探索を行った．DNAマイクロアレイ解析から，nars1 nars2二重変異体では300を超す遺伝子が発現量を大きく低下させることが判明した．ムシラーゲ蓄積に特化して機能する因子を絞り込むため，ttg1-1変異体に着目した．ttg1-1変異体は，nars1 nars2二重変異体と同様にムシラーゲの蓄積異常を示す．nars1 nars2二重変異体とttg1-1変異体では，15遺伝子の発現が共通して低下していた．これらの因子は，ムシラーゲ蓄積に関与すると考えられる．
(1) Kunieda et al., Plant Cell, 2008. doi: 10.1105/tpc.108.060160.

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高等植物の種子は成熟時に脱水して休眠し、その後再吸水して発芽する。そのため、胚の発生・発達には、細胞内外での水の移動が重要であると考えられる。一般に、生体膜を介した水の移動は、膜タンパク質であるアクアポリンによって促進されることが知られている。胚の発生・発達においても、アクアポリンが何らかの生理的役割を果たしていると考えられる。今回は、液胞膜アクアポリン（Tonoplast intrinsic protein：TIP）をコードする遺伝子DcTIP1について、植物胚発生のモデルであるニンジン（Daucus carota）不定胚系での解析結果を報告する。RT-PCRによる発現解析の結果、成熟種子と不定胚でDcTIP1の高い発現が見られた。対照的に、実生、本葉、葉柄、根での発現は低かった。アブシシン酸（ABA）を処理すると、不定胚ではDcTIP1の発現が増加したが、本葉では発現の増加は見られなかった。また、DcTIP1のプロモーター領域には、胚で顕著な発現を示すC-ABI3やDcECP40のプロモーターと高い相同性を示す領域が含まれていた。これらの結果から、ニンジンの液胞膜アクアポリン遺伝子DcTIP1は、C-ABI3やDcECP40と類似の機構によって発現調節され、胚組織においてABA誘導性の乾燥耐性などの生理現象に関与している可能性が示唆された。

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染色体は分裂期に紡錘体によって分配される。動物細胞での研究から、分裂後期の染色体の移動は紡錘体微小管の動態を反映して二つの過程からなることが知られている。一つは動原体微小管が短縮することによって染色体が極方向へ移動する後期Aであり、もう一つは重複域微小管同士の押し離しと星状体微小管の引き離しによって両極が離れることにより染色体が移動する後期Bである。酵母や動物細胞においては、染色体移動時に後期B、つまり紡錘体伸長が明確に観察され、その機構も明らかにされてきている。一方で高等植物細胞では紡錘体の伸長過程については統一した見解がない。我々はこれまでに、タバコ培養細胞BY-2を用いて微小管と染色体を可視化した細胞株を作出し、後期紡錘体の伸長距離の測定を行った。その結果、紡錘体伸長による染色体移動への寄与が明確に示された。そこで本研究では、紡錘体伸長が細胞形態に影響される可能性の検証を目指した。BY-2と同様に微小管と染色体を可視化したシロイヌナズナ植物体を作出し、根端の各組織毎の細胞における紡錘体の伸長距離を測定した。細胞サイズと紡錘体の伸長距離との関連性を示すとともに、紡錘体伸長の制御機構を考察したい。

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気孔とは一対の孔辺細胞に囲まれた間隙であり、日周期などの環境変化に応じて開閉運動を行う。細胞骨格のひとつであるアクチン繊維は気孔開閉運動への関与がさまざまな実験系から示唆されているが，その動態と役割に関して統一的な見解は得られていない．本研究では，GFP-ABD2により標識したシロイヌナズナ孔辺細胞のアクチン繊維を日周期を通して撮像し，独自に開発した画像解析系によって気孔開閉運動におけるアクチン繊維の配向，束化，密度を定量的に評価した．その結果，気孔開口過程において一過的なアクチン繊維の束化が生じることを見出した．次に，この束化の役割を知るため，GFP-mTn発現株の解析を行った．GFP-mTnは汎用的なアクチン繊維プローブであるが，近年では過剰な束化が誘導されることも報告されている．GFP-mTn発現株で同様の解析を行った結果，GFP-ABD2発現株に比べ束化レベルが恒常的に高くなっていること，気孔開口が抑制されていることがわかった．以上の結果から，一過的なアクチン束の形成が気孔開口運動の促進に重要な役割を果たすことが示唆された．本発表ではアクチン束の生体膜との相互作用の可能性から，気孔開口運動の促進機構について議論したい．

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微小管は植物細胞における主要な細胞骨格として植物細胞形態形成に関与しており、その構造構築にはアクチン繊維の関与が示唆されている。そこで、微小管構造構築におけるアクチン繊維の役割を解明するために微小管マーカーとして微小管プラス端結合タンパク質EB1を、アクチン繊維マーカーとしてフィンブリンのアクチン結合領域を用いて微小管とアクチン繊維とを生細胞で同時に可視化するタバコBY-2形質転換株を作出した。細胞周期進行に伴う微小管とアクチン繊維との相互作用の動態を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、S期からG2期にかけては微小管もアクチン繊維も細胞表層に分布はしているものの、両者の分布はあまり一致していないように観察された。いっぽう、アクチン繊維は細胞質糸を維持し、細胞核から細胞表層への微小管伸長の通路を確保しているように観察された。G2期が進行するとやがて前期前微小管束（PPB）が形成されるが、アクチン繊維はPPB内に多く存在するというよりは、PPBを避けるように分布していた。さらに、細胞分裂期後期に形成される隔膜形成体（フラグモプラスト）の成長先端では微小管はアクチン繊維に沿って伸長し、フラグモプラストが成長する様子が観察された。これらの観察から、微小管は細胞質中ではアクチン繊維を足場としながら伸長、構造構築をしているのに対し、細胞表層では独自に構造構築をしていると考えられる。

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植物細胞に特徴的な細胞内構造の一つである表層微小管は、セルロース微繊維の沈着方向を制御することで細胞の形態を決定する重要な構造である。表層微小管はM期の開始前後に消失し、G1期の開始時に再構築されるが、その制御機構については未だ不明な点も多い。そこで我々は、高度な分裂同調培養が可能であるタバコBY-2細胞に、GFPと微小管プラス端結合タンパク質であるEB1（End Binding protein 1）の融合タンパク質を発現させた細胞株（BY-GEB1細胞）を確立し、微小管のプラス端を追跡することで表層微小管再構築機構の解析を行った。その結果、再構築の初期段階においては、表層微小管はおおむね細胞端部方向に伸長しつつも、かなりのばらつきがあった。この特異的な伸長パターンはプロトプラストから液胞を取り除いたミニプロトプラストを調製し、表層微小管を消失させた後の表層微小管再構築過程でも確認された。さらに現在、プラス端の動きを経時的に追跡することで微小管の伸長方向を測定するプログラムを作成し、この現象を定量的に検証している。本発表では表層微小管再構築の初期段階では細胞長軸方向の微小管が存在するという従来の知見を再検討するとともに、不規則な配向の伸長から細胞短軸方向に配向が整うメカニズムを考察したい。

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植物細胞は動物細胞のような決まった微小管形成を持たないが、既存の微小管に分散して存在するγチューブリン複合体から微小管を形成する。我々は植物微小管形成の機構や役割を明らかにするため、微小管を標識するmCherry-TUB6と微小管重合核を標識するAtGCP2-GFPを同時に発現するシロイヌナズナ形質転換体を作製した。生細胞内で微小管重合核を介した微小管形成を可視化することにより、間期表皮細胞において以下の3つの微小管形成機構が観察された。（1）既存の微小管から約40°の角度を持って分岐するように新規微小管を形成する。（2）既存の微小管に平行に新規微小管を形成する。その結果即座に束化が形成される。（3）微小管非依存的に細胞膜から新規微小管を形成する。微小管重合阻害剤により微小管を消失させても、細胞膜に微小管重合核が確認された。これらの結果から、微小管重合核が表層微小管との相互作用のほか、細胞膜に微小管非依存的に相互作用する機構の存在が示唆された。現在、微小管切断タンパク質カタニンの活性を持たない変異株における微小管形成についても動態解析を行っている。これにより、微小管の配向化に微小管形成がどのように寄与するかが明らかになることが期待される。

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道管を構成する細胞である管状要素には、植物の発達段階に応じて適切なパターンの二次細胞壁が沈着する。我々は、転写因子VND6を利用した細胞分化誘導系を独自に開発し、後生木部様の二次細胞壁パターンの形成機構を解析している。今回、表層微小管や、アクチン繊維に着目して解析を進めた結果を報告したい。この分化誘導系では、網紋や孔紋様の二次細胞壁が高頻度かつ同調的に形成されるが、表層微小管は二次細胞壁が形成される領域にのみ観察された。より詳細な観察を行ったところ、二次細胞壁が形成されない領域では、表層微小管が速やかに脱重合およびスライドを起こしていることが判明した。アクチン繊維の脱重合処理を行ったところ、このような微小管の分布は阻害され、二次細胞壁のパターンが失われた。興味深いことに、アクチン繊維を脱重合すると同時に微小管脱重合阻害を行った結果、比較的正常な二次細胞壁パターンが形成された。アクチン繊維は二次細胞壁と共局在を示さなかったことから、アクチン繊維による間接的な表層微小管の制御が二次細胞壁形成に必須である可能性が示された。以上の結果から、二次細胞壁パターンの制御機構に関して考察する予定である。

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シロイヌナズナ花茎が重力方向の変化を感受するには，内皮細胞内のアミロプラストが重力方向へ移動することが重要である。我々は重力感受メカニズムを解明するために重力屈性能が低下したsgr9変異体の解析を行なっている。sgr9変異体ではアミロプラストの重力方向への移動に異常がみられること，また，SGR9はアミロプラスト上に局在するタンパク質であることから，SGR9がアミロプラストの沈降制御に関与していることを昨年度の本大会で報告した。これまでの研究から，アミロプラストの動態にはアクチンフィラメント(F-アクチン)が関与することが示唆されている。そこで，F-アクチンとSGR9の関係を調べる目的で，まず，内皮細胞のF-アクチンを観察したところ，sgr9では野生型よりも多くのアミロプラストがF-アクチンに取り囲まれていた。また，F-アクチンの形成が抑制されるアクチン優性変異fiz1をsgr9に導入したところ，このアミロプラストを取り囲むF-アクチンが明らかに減少した。さらにこの時，sgr9の重力屈性能とアミロプラストの重力方向への移動は回復していた。以上のことから， SGR9はアミロプラスト上に局在して，アミロプラストとF-アクチンとの相互作用を調節することで，アミロプラスト動態を制御すると考えている。

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アクチン繊維は，オルガネラの動きや細胞の形態形成等に関わる重要な構造である。例えば原形質流動はアクチン-ミオシン系に依存して起こっている。一方，苔類ゼニゴケの細胞では明瞭な原形質流動が観察されない。我々は，ゼニゴケのアクチン繊維がどのように組織されているのかを明らかにするため，Lifeact-Venusを用いてアクチン繊維の可視化を試みた。その結果，束化されたアクチン繊維が非常にダイナミックに運動していること、その運動がミオシンに依存し微小管に依存しないことなどが明らかとなった。一般に，アクチン繊維はオルガネラに結合したミオシンがその上を移動するためのレールとして認識されている。しかしゼニゴケにおいては，アクチン繊維があたかもオルガネラ上に存在するミオシン分子上を滑り運動しているかのように観察された。その他にも，アクチン繊維束が解離し枝分かれする様子や，合流する様子も観察された。
プローブとして使用したLifeactは，酵母のAbp140タンパク質に由来する17アミノ酸のアクチン結合ペプチドであり，動物細胞のアクチン繊維の動態観察における強力なツールとして報告されたものである。今回の研究により，植物細胞においてもその使用が可能であることが示された。本プローブの特徴と植物のアクチン解析における有用性等についても議論したい。

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植物にとって、細胞内での葉緑体の位置は、光合成のためのCO₂の吸収効率や受光量の調節に関わる重要な因子である。葉緑体の位置決定にアクチン細胞骨格が関与することを示唆する報告はあるが、具体的な関与様式は不明である。我々は、葉緑体はアクチン細胞骨格によって表層細胞質にアンカーされるという仮説をたて、ホウレンソウ葉肉細胞プロトプラストから、細胞膜の細胞質側を露出させた細胞膜ゴーストを調製し、解析を行っている。細胞膜ゴースト上の葉緑体の数がCa²⁺処理によって減少し、アクチン細胞骨格の構築がCa²⁺-カルモデュリンによって制御されている可能性が示唆された。そこで、Ca²⁺-カルモデュリンに依存したアクチン脱重合活性を持つアクチン結合タンパク質であるビリンの関与を想定した。ホウレンソウ葉に120 kDaと135 kDaの2種類のビリン様タンパク質が存在すること、細胞膜ゴースト上の葉緑体の周囲に局在していること、これらのタンパク質の葉肉細胞内での局在が異なることを示唆する結果を得た。さらに、抗ビリン抗体処理によってアクチン細胞骨格の構築が乱れ、細胞膜ゴースト上の葉緑体数の減少が観察された。

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我々は、タバコ培養細胞BY-2をカバーガラスに貼り付けて遠心すると、通常は細胞長軸に対して垂直に並んでいた表層微小管がランダムな配向へと変化すること、さらにランダムな配向はしばらくすると回復することを見出した。本研究ではGFP-tubulin発現株であるタバコ培養細胞BY-GT16を用いた。ランダムへの配向変化はGd3+によって阻害されることから、伸展活性化チャネルの関与が示唆された。ガラスとの接着の影響を調べるため、パーコール中に細胞を浮かべて遠心すると表層微小管の配向は変化せず、その配向変化は遠心により細胞がガラスとに接着面で引っ張られるストレスを受け、それにより伸展活性化チャネルが開くことによるものであると考えられた。
また、Taxol存在下ではランダムへの配向変化は阻害されたが、ランダムな配向からの回復は阻害されなかった。このことから、ランダムな配向からの回復には重合・脱重合のdynamicsは関与していないことが示唆された。
本研究の系は表層微小管の構築制御機構の解析に有効と考えられる。ランダムへの配向変化と配向の回復について、リン酸化や脱リン酸化、アクチン等の関与について解析を進めており、その結果を報告する。

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我々は緑色蛍光タンパク質(GFP)によりペルオキシソームが可視化された形質転換シロイヌナズナ(GFP-PTS1)を親株として変異処理を行い、GFPの蛍光パターンが親株と異なるapm (aberrant peroxisome morphology)変異体を多数選抜し、ペルオキシソームの形成に関わる因子の同定と機能解析を行っている。
apm3突然変異体では、GFP-PTS1より大きなペルオキシソームが観察され細胞内の数が減少することから、ペルオキシソームの分裂が抑制された変異体であると考えられる。マッピングの結果、APM3遺伝子は、Peroxisome membrane protein 38 (PMP38)であることが明らかとなった。PMP38プロモーターとGUS融合遺伝子の解析から、PMP38は様々な組織、成長段階で発現しており、発現部位では巨大化したペルオキシソームが存在していた。PMP38はMitochondria carrier familyのATP/ADP transporterのグループに分類されているが、今回、ATPおよびADPは輸送しないことが明らかとなり、他の低分子を輸送している可能性が示唆された。既に報告した別の分裂抑制変異体apm1との二重変異体の解析も合わせて報告する。

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高等植物のペルオキシソームは脂肪酸代謝や植物ホルモンの生合成、光呼吸といった代謝系を担う重要なオルガネラであり、その機能は外的環境の変化や植物組織によって転換し得る柔軟性を備えている。ミトコンドリアや葉緑体とは異なり、ペルオキシソームは独自のゲノムを持たないため、ペルオキシソームの機能、形態維持に必要な遺伝情報は全て核にコードされている。すなわち、ペルオキシソームの柔軟な機能制御には、サイトゾルで合成されたペルオキシソームタンパク質が正確にペルオキシソームへ輸送される機構が必須である。この一連のペルオキシソーム形態形成を担う因子を明らかにするため、我々はシロイヌナズナaberrant peroxisome morphology（apm）変異体のスクリーニングおよび解析を行ってきた。
apm9変異体はペルオキシソームタンパク質輸送効率が低下する変異体として単離された。マップベースクローニングにより原因遺伝子を同定したが、APM9遺伝子は植物ゲノムにのみ保存された機能未知遺伝子であることが明らかとなった。さらに興味深いことに、APM9ノックアウト株は胚性致死を示し、このことからAPM9遺伝子が種子形成において重要な役割を担うことが示唆された。今回は、ペルオキシソームタンパク質輸送におけるAPM9遺伝子産物の機能について報告する。

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シロイヌナズナ葉肉細胞内においてペルオキシソームは葉緑体近傍に局在する。我々はこの現象を明らかとするためにペルオキシソーム局在異常変異体 (peup: peroxisome unusual positioning mutant) を複数単離した。葉肉細胞内においてpeup1ではペルオキシソームが凝集を示し、peup4では葉緑体から離れ細胞質中を浮遊しており、いずれも葉緑体との接着機構に欠損が生じていると思われた。また、ペルオキシソームの運動に関与するミオシン変異体を用いて解析を行ったが葉緑体との接着機構には影響は見られなかった。これはアクチン繊維を重合阻害剤で破壊したときの結果と一致する。現在までにペルオキシソームと葉緑体との接着機構の役割については明らかになっていない。今回我々はpeup1、4とミオシン変異体を用いて強光条件下での成長解析を行った。野生株と比較してpeup1、4いずれも光強度に応じた障害が観察され、クロロフィル量の減少と光合成効率の低下が生じた。また、一過的な強光（1200μmolm^-2s^-1）では葉の白化が生じ障害が顕著となった。他方ミオシン変異体に関しては野生株と同じかもしくはそれよりも強光耐性をもつことが示唆された。これらの結果はペルオキシソームと葉緑体との接着が光合成効率に関与しており、接着機構が植物の環境適応において重要であることを示唆した。

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細胞核を包む核膜には多数の孔が存在しており，核膜孔と呼ばれている．核膜孔は細胞質と核を結ぶ唯一の通り道であり，膨大な数の分子の選択的な通過を可能にしている．このような分子流通業務は植物の高次生命現象に重要な役割を担っているものと予想されるが，その詳細な分子機構は全く不明である．核膜孔は約30種類のNucleoporinと呼ばれるタンパク質群によって形成される巨大複合体である．核膜孔の機能と植物体におけるその生理学的役割を明らかにする目的で，シロイヌナズナNucleoporinを解析している．
シロイヌナズナのNucleoporinとGFPとの融合タンパク質をそれぞれ発現させ，生細胞内での動態解析を詳細に行った．最初に免疫沈降実験により，GFPと融合させたNucleoporinは内在性のNucleoporinと複合体を形成していることを確認した．形質転換体を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ，核膜上にドット状の蛍光が見られた．細胞分裂M期においては，核膜崩壊後から再形成時に，それぞれのNucleoporinが異なる局在パターンを示していた． Nucleoporinを過剰発現する形質転換植物体では，細胞核の形状変化や器官発生の顕著な異常が観察された．このことは核膜孔複合体が核の形作りだけでなく，植物個体の形態形成において重要な機能を担っていることが示唆している．

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原形質流動は古くから知られる植物特異的な細胞内運動であり，約50年前に「すべり説」が提唱された．モータータンパク質であるミオシンがアクチン繊維に沿ってオルガネラを運ぶことにより原形質流動が起こると考えられるが，具体的な分子の単離・同定はほとんど進んでいない．我々は，小胞体が激しく流動する現象に着目し，シロイヌナズナを用いて蛍光タンパク質で小胞体を可視化し，その分子機構を解析することにした．小胞体の流動は方向性をもち，非常に速くて絶え間ない．この動きは，蛍光タンパク質で可視化した細胞質ゾルの流動パターンと一致しており，アクチン繊維脱重合試薬やミオシン阻害剤により抑制された．植物ミオシンは独自のクラス（VIII，XIおよびXIII）を進化させ，その中のミオシンXIがオルガネラの運搬を担っていることが示唆されている．シロイヌナズナは13種類のミオシンXIをコードしており，これらのミオシン変異体を用いて，小胞体の流動に関わるミオシンを逆遺伝学的に同定することを試みた．その結果，1つのアイソフォームの変異体で小胞体の流動が著しく抑制されることを見出した．更にこのアイソフォームを含む多重変異体を作製したところ，小胞体の流動がさらに抑制され，小胞体の形態にも異常が観察された．これらの結果から，小胞体の流動には複数のミオシンXIが相補的に機能していることが示唆された．

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小胞体はチューブ状構造とシート状構造が three-way junctionと呼ばれる三叉の接続を介して複雑に組み合わさったネットワーク状の構造をとっている．この形態の形成・維持に寄与する因子を同定するため，小胞体の形態に異常を示す変異体を3系統単離し，endoplasmic reticulum morphology（ermo）と命名した．ermo1とermo2では，小胞体に由来する1 μm前後の球状構造体が数多く観察され，ermo2ではそれらが細胞内の一カ所に凝集していた．一方ermo3では球状の構造体は観察されず，小胞体が一カ所に凝集していた．これらの変異体では異常な構造・凝集体の他に正常なネットワークも観察された．マッピングの結果，ermo1とermo2は小胞体ーゴルジ体間の輸送においてそれぞれCOPI小胞とCOPII小胞の出芽に関わると考えられている遺伝子の変異であることがわかった．しかし，これらの変異体において細胞内輸送に明らかな異常は観察できていない．このことから，ERMO1およびERMO2は小胞体の形態維持に関わる新奇機能をもっている，あるいは変異体における輸送異常は検出できないレベルだが，小胞体ーゴルジ体間の輸送が小胞体形態に重要であることが考えられた．また，ERMO2およびERMO3はオルガネラを細胞内に分布させるのに必要であることが示された．

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葉緑体は光合成細菌の共生により誕生したオルガネラである。元来葉緑体ゲノムにコードされていた遺伝子の多くは、宿主細胞の核ゲノムに移行しており、正常な葉緑体発達が成されるためには両ゲノムにコードされた遺伝子の協調的な発現が必要である。この様な協調的遺伝子発現を司るシグナルとして、葉緑体から核へと伝達されるプラスチドシグナルの存在が提唱されているが、その実態が明らかになった経路は一部にすぎない。我々はこれまでに、シロイヌナズナの葉緑体タンパク質透過装置であるToc159タンパク質が欠失した変異体 (ppi2変異体) では、一部の核コード葉緑体タンパク質遺伝子の発現が低下していることを見いだした。今回我々はプラスチドシグナルに応答し、核内での光合成関連タンパク質遺伝子の発現を制御していると考えられるAtGLK1（Golden2-like1）について詳細な解析を行ったので報告する。ppi2変異体においてAtGLK1を過剰発現させたところ、本来発現抑制される遺伝子群の部分的な発現回復が観察された。加えて、AtGLK1過剰発現体ではクロロフィルの蓄積も回復しており、これらのことからAtGLK1はプラスチドシグナルの下流において光合成関連タンパク質遺伝子の発現を制御していることが示唆された。また、既知のプラスチシグナル伝達経路との遺伝学的相互作用についても併せて報告する。

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ミトコンドリアDNA（mtDNA）の複製・転写・修復は、生体内においてタンパク質で高次に組織化されたミトコンドリア核様体内で制御されている。我々は、mtDNAの機能発現に関与するタンパク質を同定するため、大型核様体をもつ真正粘菌を用いて、その構成タンパク質を解析してきた。
本研究では、高いDNA結合能をもつ核様体構成タンパク質である56kDaタンパク質（p56）について解析を行った。p56の遺伝子を決定した結果、N末端側にmtDNAの酸化的ダメージ修復への関与が示唆されている、酵母や細胞性粘菌のMgm101に高い相同性があった。ゲルシフト解析の結果、p56はmtDNAと配列非特異的に結合し、C末端側はDNA結合能を上昇させることがわかった。また細胞免疫染色においてp56は核様体全体に局在することが示唆された。細胞内でのp56の発現量は、酸化誘導剤により細胞に酸化ストレスを与えることで増加した。さらに、遺伝子導入系の改良とマイクロインジェクション法の開発を行い、遺伝子発現阻害を試みた結果、p56の発現量低下に伴って、酸化誘導剤によるDNA変異量が増加した。さらに他のDNA修復タンパク質（RecA）の発現量の増加もみられた。以上より、p56はRecAと共にmtDNAの酸化的ダメージ修復に関与している可能性が示唆された。現在、それらの相互作用について解析している。

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高等植物の液胞は，植物個体の成長と発達に必須なオルガネラで，実に多様な機能を持つ．液胞膜はしばしば丸くスムーズな表面を持つオルガネラとして想定されがちだが，実は内部に非常に複雑な陥入構造（原形質糸）を伴うダイナミックな構造である．私たちは，シロイヌナズナの子葉の表皮細胞で，内外二層に折り畳まれ球状をなし，液胞の内腔に突出した構造bulbを見出し報告した（Saito et al. 2002）．その後，bulbの生物学的意義を探るべく，「更なる構造的な証拠」，「連続した液胞膜内における膜タンパク質の選択的濃縮排除の直接的な証明」，「機能の手がかりを得る」，ことを目標に研究を進めてきた．吸水直後の種子や花器官でも広くbulbが観察されるような形質転換ラインを得て，子葉以外の組織でも広くbulbが出現することを見出した．Bulbは組織が急激に伸長する直前に高頻度に観察された．遺伝学的にbulbの出現頻度が異常になるものを探索した．その結果，花茎内皮細胞の液胞膜の形態に異常のある，zig-1/atvti11 とsgr2-1において，bulbの頻度が激減していることを見出した．現在，高圧急速凍結固定による電子顕微鏡観察を進行中で，それについても併せて報告したい．

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地球温暖化対策の一つとして、植物バイオマスの燃料・工業原料化が注目されている。しかし、穀類に含まれるデンプンを原材料とする現行法は、食糧問題の一因ともなっており、非食用植物に含まれる細胞壁成分（セルロース、ヘミセルロース）を低コストかつ効率的に糖化して活用するための技術革新が求められている。我々は、耐熱性を有した細胞壁糖化酵素群を大量発現する形質転換植物を作出し、これを粉砕・加熱処理することによって、植物が自己分解して糖質を生産する「自己糖化型エネルギー作物」の開発を進めている。本研究では、古細菌(Pyrococcus horikoshii)由来の超耐熱性セルラーゼを大量発現する葉緑体形質転換タバコを作出した。この形質転換タバコの緑葉では、目的酵素がRubisco大サブユニットに次ぐレベル（SDS-PAGE後、CBB染色によってバンドが確認できるレベル）蓄積しており、その酵素活性は風乾させた葉や茎でも安定に保持されることが分かった。さらに、少なくとも寒天培地での栽培では、植物の生育や形態に顕著な異常は認められなかった。以上の結果は、葉緑体が細胞壁糖化酵素を大量生産するバイオリアクターとして有望であることを示している。

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光化学系I複合体（系I複合体）の分子集合に必須なYcf4は、1000 kDa以上の大きな複合体（Ycf4複合体）の成分である。これまで、TAPタグを融合したYcf4を発現する緑藻クラミドモナスの形質転換株のチラコイド膜可溶化物から、2段階のアフィニティーカラムクロマトグラフィーでYcf4複合体を精製し、Ycf4複合体には、レチナール結合タンパクであるCop2と系IのサブユニットPsaFが存在することを既に明らかにした。今回は、Ycf4複合体に含まれるタンパク質組成の解析をウェスタン解析と質量分析によって進めた。その結果、Ycf4複合体にはPsaFに加えて系I反応中心サブニットPsaAとPsaBおよびPsaDが存在することがわかった。これらのサブユニットはクロロフィルタンパク質複合体を形成しており、Ycf4複合体から容易に解離する。したがって、Ycf4複合体上で分子集合されつつある前駆体であると考えられる。³⁵Sによるパルスチェイス実験から、新規に合成された系I複合体のタンパク質とYcf4複合体は相互作用することが示唆された。以上の結果から、Ycf4複合体は光化学系I複合体の分子集合過程の効率化に必要なスキャフォールドとして機能していると考えられる。

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高等植物の光化学系I（PSI）は14-15種のサブユニットと4-6種の集光性タンパク（LHCI）からなる巨大な複合体を形成する。エンドウのPSI-LHCIの結晶構造では、4種のLHCIがテトラマーを形成している。テトラマーの一方の端はPsaGの、他方の端はPsaKの近傍に存在する。緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのPSIは高等植物のPSIとほぼ同様のサブユニット組成をもつが、LHCIは9種も存在する。これほどの多くのLHCIがとる構造は不明のままである。そこで、我々はクラミドモナスのLHCIとPSIのサブユニットの抗体を作製し、単離したPSI-LHCI標品のサブユニットを化学架橋することによりLHCIの複合体内での配置の解析を行った。9種あるLHCIのうち、量が少ないLhca2と Lhca9は架橋し、さらにLhca9はPsaGと架橋した。一方、PsaKはLhca3と架橋した。オリゴマーLHCIの中心付近に存在するPsaFはLhca8と架橋した。その他に、LHCI同士の架橋産物として、Lhca4-8、Lhca5-6が検出された。以上の結果から、9種のLHCIサブユニットの部分的な配置が明らかにされた。

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光環境馴化の一つであるステート遷移は、光化学系I（PSI）とII（PSII）の励起のバランスを保ち、電子伝達反応を効率化する機構である。PSIとPSIIの間の電子伝達を仲介するシトクロムb₆f複合体の還元がシグナルとなり誘導されるステート2では、PSIIの集光性複合体（LHCII）の一部であるモノマーLHCIIのCP26, CP29, LhcbM5がPSI-LHCI複合体に可逆的に結合し、PSI-LHCI/II超分子複合体を形成することを報告した。本研究では、PSI-LHCI/II超分子複合体に結合するモノマーLHCIIの量と機能について報告する。PSI-LHCI/II超分子複合体をNaCl存在下で解離させて得られたPSI-LHCIとモノマーLHCIIのクロロフィル量比を求めたところ、100 : 36 であった。またP700光酸化量を分光学的に求めると、P700あたりのクロロフィル存在量は、PSI-LHCI/IIではPSI-LHCIのおよそ1.2倍に増加していた。さらに閃光強度を変えてP700の光酸化強度を測定すると、PSI-LHCI/IIではPSI-LHCIよりアンテナサイズが大きいことが示された。これらの結果は、ステート2でPSI-LHCIに結合するモノマーLHCIIは、PSI-LHCIのアンテナとして機能し、そのサイズを20-40 %増加させることを示している。

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光エネルギーを化学エネルギーに変換する光合成においてクロロフィル色素（Chl）は主要な役割を担う。これまで、全ての酸素発生型の光合成生物では、Chl aは光を獲得しエネルギー変換において必須で例外はないとされてきた。しかし、1996年に発見された光合成生物Acaryochloris marina (A.marina)は、Chl dを主要色素とし、Chl aより遠赤色光を利用して光合成を行うことが報告され、既知の酸素発生型の光合成生物よりも10％ほど低いエネルギーで駆動する光合成の存在が明らかになった。A.marinaにおいて光合成の初期反応を担う光化学系I複合体については、これまでアミノ酸配列が同定や分光学的測定がなされているが、その詳細は明らかにされていない。
本研究では、A.marinaの光化学系I複合体の色素の配向や分光学的特徴について、円二色性(CD)、直線二色性(LD)スペクトル測定、極低温での定常状態での吸収と過渡吸収を用いて調べた。P740の酸化還元差スペクトルにおいては、高い波長分解で測定することができた。この結果、これまで730nm付近での褪色だと報告されていたバンドについて、短波長側に正のバンドを見られ、シャープなバンドシフトである可能性が高いことがわかった。これらの結果をChl dを持たない光合成系と比較し議論する。

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珪藻の光化学系I(PS I)では、二種類の周辺アンテナFCP(fucoxanthin-Chl binding protein) I-1とFCP I-2がコア部分(PS I-Core)を取り巻いている。励起エネルギー移動過程を明らかにするために、珪藻C. gracillisから単離したFCP-PS I超複合体、PS I-Coreのみ、FCP I-1およびFCP I-2複合体のみの合計4種類の標品で、フェムト秒時間分解蛍光スペクトルをアップコンバージョン法とストリークカメラ法により測定した。エネルギー移動の速度が遅くなる極低温17 Kで測定を行い、結果を5つの指数関数の和としてglobal解析した。FCP内にのみ存在するChl cを460 nmで選択的に励起した場合と430 nmによりChl aを励起したときに観測される時定数5 psの主要蛍光減衰成分がみられない。このことからPSIコア内部のエネルギー移動は5 ps程度で起こると推測された。460 nm励起では、430 nm励起時に見られなかった0.86 ps と14 psの2成分が観測された。これらは、二種類のエネルギー伝達経路(FCP I-1⇒コア、FCP I-2⇒コア)を各々反映すると考えられる。これらの結果をもとにモデルを立て、シミュレーションを行い珪藻のPS Iでのエネルギー伝達経路と速度を明らかにした。

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光化学系I(PS I)反応中心における室温での励起エネルギー捕集、初期電荷分離のダイナミクスは、1) 多くのクロロフィル(Chl)分子のスペクトルが重なる、2) 各Chl間のエネルギー移動が高速でフェムト秒の時間分解能でも検出できない、3) エネルギー捕集と初期電荷分離が同じ時間スケールで起こるため分離が難しい、といった困難のため未だ完全には解明されていない。極低温では、スペクトルがシャープになりエネルギー移動も劇的に遅くなるため、上記1)、2)の克服が期待できる。我々は、PS Iの励起エネルギー捕集、初期電荷分離のダイナミクスの完全解明を目指し、15 Kにおける超高速時間分解蛍光法による研究を行った。
測定の結果、15 Kでは所謂red Chlへのエネルギー移動速度が室温での数psから30 psへと劇的に遅くなる、690 nm付近の大部分のChlからの蛍光は5 ps程度の非常に高速な時定数で減衰する、室温では見られない300 ps程度の蛍光減衰成分が現れる、ことが明らかとなった。この結果は、極低温ではP700へ5 psでエネルギーを渡すChlグループ、300 psでP700へエネルギーを渡すChlグループ、P700ではなくred Chlへ30 psでエネルギーを渡すChlグループ、に分かれることを示す。講演では、これらのChlグループの分子数比について議論する。

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緑藻クラミドモナスの表在性蛋白は、高等植物と同じPsbO, PsbP, PsbQからなるが、その結合様式は高等植物と異なり、それぞれが単独でPSII膜蛋白と結合する。しかし、これらの表在性蛋白がPSII膜蛋白のどのサブユニットと結合しているか不明である。そこで、この点を明らかにする目的で、静電的結合部位にアタックし架橋する水溶性カルボジイミド(EDC)を用いてクラミドモナスPSIIを処理した。架橋処理したPSIIをTris処理して未架橋の表在性蛋白を遊離させた後、Blue-Native PAGE にかけPSII coreを調製した。こうして得られたPSII coreに表在性蛋白の架橋したバンドが存在するかどうか抗体を用いて検出した結果、PsbO, PsbP, PsbQの全ての表在性蛋白がPSII coreを構成する膜蛋白と架橋することを見出した。これらの表在性蛋白が、PSII coreを構成するどの膜蛋白と架橋したかについても解析したので、その結果について報告する。さらに、EDC架橋後、Tris処理により遊離した表在性蛋白を用いて各表在性蛋白との抗体反応を行った結果、PsbPとPsbQからなる架橋バンドが検出された。このPsbPとPsbQの架橋部位も同定することができたので、合わせて報告する予定である。

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Ycf12は近年、光化学系II複合体(PSII)のサブユニットであることが報告された低分子量膜貫通タンパク質であるが、その存在位置は不明である。我々はThermosynechococcus elongatus(T. elongatus)のYcf12欠損株から、PSIIダイマーを精製し、結晶化し、X線結晶構造解析を行った。野生株PSIIとの差フーリエ電子密度から、Ycf12はPSIIの外縁部、PsbK、PsbZの近傍に位置することが判明した。これはベルリンのグループが報告した3.0Å分解能の構造において、未同定へリックスX1に対応する。この結果と我々がすでに報告したX2=PsbYの結果を考え合わせると、残る未同定のサブユニットX3はPsbXであることが推測された。また、我々はPsbZ欠損株よりPSIIダイマーを精製、結晶化したが、得られた結晶の格子定数が野生株のものと大きく異なっており、PsbZがPSII結晶中のダイマー同士の相互作用に関わっていることが示唆された。PsbZがYcf12のPSIIへの結合に必要であることは、PsbZ欠失株から精製したPSIIではYcf12とPsbKが脱落していることから示されたが、Ycf12欠失PSIIの結晶が野生株と同じ格子定数を持つことから、Ycf12はPSIIへのPSbZの結合に必要ないことが示唆された。

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PsbM, PsbIは光化学系II複合体（PSII）の低分子量サブユニットであり、PSIIの3.0 Å分解能結晶構造において、PsbMは2つのPSII単量体をつなぐPSII二量体の中心部に存在するのに対し、PsbIは二量体の周辺、D1サブユニットの近傍に存在する。これらの存在部位はそれぞれの欠失変異株の結晶構造解析からも確認され、PsbMは二量体の形成・安定化に何らかの役割を持っているが、PsbIは二量体の形成や安定化に直接的な役割を持っていないことが推測された。しかし、それぞれの欠失変異株のチラコイド膜をClear-native-PAGEを用いて分析した結果、いずれの変異株においてもPSII二量体の量が減少し、単量体が増えたことがわかった。従って、PsbM, PsbIのいずれもPSII二量体の形成・安定化に何らかの役割を持っていることが推測された。変異株から精製したPSII二量体をLDAOで処理したところ、PsbM欠失二量体は単量体化したが、PsbI欠失二量体は野生株と同様に単量体化しなかった。これらのことから、PsbMは2つのPSII単量体をつないで安定的な二量体を形成するのに必要であり、一方、PsbIはin vivoでのPSII二量体のアセンブリに必要であるが、一旦形成された二量体はPsbIが結合していなくても安定であることが示唆された。

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これまでに三つのグループから好熱性シアノバクテリアの光化学系II複合体（系II複合体）の二量体の結晶構造が報告されている。また、われわれはこれまでに系II複合体の小サブユニットの変異株を作製し、その機能解析から多くの小サブユニットが二量体の安定化に関与していることを示してきた。今回われわれは、このような系II複合体の二量体構造の安定性を生化学的に検討した。材料として、好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus BP-1のチラコイド膜を用い、n-dodecyl-β-D-maltopyranoside（DM）で可溶化して、二量体と単量体の回収率をblue-native PAGEによって検討した。その結果、低濃度のDMでは単量体の回収が高く、高濃度では単量体が減少し二量体が増加した。これらの標品を二次元PAGEに展開したところ、系II複合体のタンパク質組成に単量体、二量体による有意な差は見られなかった。これらの結果は、系II複合体の二量体化がDMにより引き起こされる可能性を示唆している。今回の結果に基づいて、系II複合体の安定性と生体内での状態について議論する。

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グルタチオンは葉緑体に多量に存在するトリペプチドで、光合成によって産生されるATP依存の2段階の反応で合成される。これまでの結果からグルタチオン合成の律速で二酸化炭素固定能が低下し、光化学系電子伝達の低下が起きることと考えられた。そこで、グルタチオン合成が律速されている変異体を用いて、カルビン回路の律速反応を触媒すると考えられているRubiscoと内生グルタチオンとの関係について解析した。内生グルタチオン量が低下したシロイヌナズナ変異体では、葉面積あたりの二酸化炭素固定速度が野生型の80-90%を示した。一方、Rubisco量あたりのRubisco活性は、野生型の80-90%を示したが、葉面積あたりのRubisco活性は野生型と有意な差を示さなかった。以上のことから、グルタチオン量の低下はRubiscoの活性化率の低下を引き起こすが、グルタチオン量低下による二酸化炭素固定速度の低下はRubisco以外にグルタチオンが作用するためであると考えられた。他のカルビン回路酵素アルドラーゼがグルタチオンによって制御されることから、グルタチオン量低下による葉面積あたりの二酸化炭素固定速度の低下はRubiscoではなくアルドラーゼである可能性が考えられる。本発表では、アルドラーゼの量および活性の結果も合わせて、グルタチオン量とカルビン回路の関係について考察する。

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