【はじめに】特定外来生物のマングースは，大規模な防除事業により沖縄島北部や奄美大島などでは低密度化を達成することに成功した．その結果，罠による捕獲効率が低下し，新たな個体数抑制手法の開発が求められている．われわれは，免疫学的に繁殖を抑制する避妊ワクチン開発のための研究を行ってきた．前大会では，抗原候補として着目している本種の卵透明帯蛋白（ZPC）の塩基配列を解読し，マウスとヒトのZP3，イヌ，オコジョおよびネコの ZPCの配列との相同性，加えて同配列中の精子卵結合部位のアミノ酸配列における相同性の比較結果を第一報として報告した．本大会では，精子卵結合部位のアミノ酸配列を元にして合成したタンパク質を用いてウサギへの免疫接種を行い，精製したポリクローナル抗体を ELISA法によって確認した結果などを報告する．
【方法】われわれの研究グループが明らかにしたマングース ZPC完全長配列（1,336bp）中の精子卵結合部位と考えられるアミノ酸配列 (23AA)とその直後のアミノ酸配列 (5AA)を元にして，それぞれ8AAの共通部分を持つ 2種類の合成タンパク質 A,B(共に 19AA)を作成した．これらをそれぞれウサギ 2羽に，開始日を 0日目とし，0，14，28，42日目に接種した．また，各接種前に採血して得られた血清を用い，合成タンパク質 A,Bに対する抗体を検出するために ELISA法を行った．
【結果・考察】合成タンパク質 Aを接種したウサギ 2羽，Bを接種したウサギ 1羽において有意な抗体価の上昇が認められた．よって，合成タンパク質 A,B共にエピトープ部位を含み，抗原候補として有用であるものと思われた．今後，最終の免疫接種を行って得られた血清を用いてマングースおよび他種の野生動物の卵透明体に対する免疫組織化学を実施し，合成タンパク質 A,Bのワクチンとしての有効性および種特異性を確認する予定である．

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【はじめに】アライグマは防除実施計画の認定・確認が最も多い特定外来生物であるが，わが国では根絶を達成しえた地域はまだない．その一因は，農作物被害の防除を目的とした箱罠捕獲が中心となっている地域が多く，計画的・効率的な個体数管理が実現されていないためであろう．この現状を打開する一助として，本種の効率的な個体数抑制のため，捕獲をすることなく免疫学的に繁殖を抑制しうる経口避妊ワクチンの開発に向けた基礎研究を行ってきた．とくに，抗原候補として受精に関与する卵透明帯（Zona pellucida; ZP）蛋白に着目しており，本大会ではその塩基配列の解読結果や今後の課題を報告したい．
【方法】既報のネコ目（イヌ，ネコ，マングース，オコジョ）における ZP蛋白の 1種である ZPCの塩基配列を基にプライマーを作成し，アライグマの卵巣を用いて RT-PCR法を行った．さらに RACE法によりアライグマの ZPCの完全長配列を解読し，既報の他種（イヌ，ネコ，マングース，オコジョ，マウス，ヒト）の同蛋白塩基配列との相同性を比較した．また，同配列のうちで精子卵結合部位と考えられるアミノ酸配列 23AAを解明して他種との相同性も比較した．
【結果・考察】アライグマの ZPC完全長配列 1,279bpが明らかになった．また，同配列における他種との相同性は，イヌ86.4%，ネコ82.9%，マングース86.4%，オコジョ92.2%，マウス72.2%，ヒト78.5%であった．精子卵結合部位のアミノ酸配列 23AAでは，イヌ19AA，ネコ11AA，マングース16AA，オコジョ18AA，マウス4AA，ヒト 8AAでのみ一致し，同部位はワクチン抗原として種特異性を有しているものと考えられた．今後は，in vivoによる避妊効果および同所性に生息する在来他種への影響の評価，野外での効果的な投与方法などについても検討する必要がある．

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 Dehydroepiandrosterone-Sulfate（DHEAS）は主に副腎から分泌され，ヒト血中に最も多く存在するステロイドホルモンである．
 DHEASはテストステロンやエストロジェンの前駆物質であり，ヒトでは Adrenarcheの発現，老化時の性ホルモンの補充，また，神経ステロイドとしての役割も担っていると報告されている．さらに，ヒト血中 DHEAS量は新生児期に最も多く，その後劇的に減少するが，Adrenarcheの発現に伴い再び増加，20代から 30代にピークを迎え，老化に伴い緩やかに減少することが知られている．しかし，ヒト以外の霊長類では DHEASの役割やその機能に関して確かな結論は得られていない．また，これまでヒト以外の霊長類の DHEAS量測定は血中放射免疫測定法が主で，そのため，採血ができない野生個体では測定も不可能であった．さらに，サンプル採取に伴うストレスにより DHEAS量の変化も考えられ，非侵襲的な測定法の確立が求められる．そこで，ELISAによる糞中尿中 DHEAS測定法の確立を目的として実験をおこなった．
 3頭の成熟メスニホンザルに，DHEASを投与し，その後経時的に血液，尿，糞を採取，それらのDHEAS量を測定した．ELISAは DHEA-3-Succinate-BSAのウサギ免疫抗体と DHEA-3-Glutarate-HRPを用いた競合反応によっておこなった．
 その結果，本法によりニホンザル尿中糞中の DHEAS量が測定可能であることが分かった．また，糞中尿中の測定値は血中の DHEAS量とよく相関していた．これらのことから，本法を用いてヒト以外の霊長類の DHEASの役割や機能についての研究が進むことが期待される．

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 有蹄類の個体群動態の予測において，繁殖率や死亡率などに影響を及ぼす栄養状態の把握は非常に重要であり，個体群の栄養状態を知ることで，その個体群が生息する環境の質を知ることができる．その指標としては脂肪の蓄積が主に用いられる．餌資源が不足したとき，脂肪の動員は皮下脂肪，腹腔内脂肪，骨髄内脂肪の順に起こることから，腎周囲脂肪指数（以下RKFI），大腿骨骨髄内脂肪指数（以下FMFI）が利用される．これらの指標は捕殺することで栄養状態が判断できる指標で精度も高いが，捕殺することのできない個体群では利用できない．
 それに対して，血液などの生化学的分析によって算出された指標は捕殺することなく栄養状態を判断することが可能であると考えられる．そして，脂肪蓄積量を利用した指標と同様，信頼に足るものとして約束されてきた．しかしながら，これらの手法による栄養状態の判断は飼育下の個体の制限した条件下での実験で精度を実証しているものがほとんどである．そのため，野生下の個体の栄養状態を推定する際に利用した時の有効性の範囲が不明瞭である．
 そこで本研究では，野生個体群である山口県西部に生息するニホンジカ Cervus nipponの雌の成獣において，血清成分を利用することで，栄養状態をどの程度まで判断することが可能か，血清成分の指標の有効性の範囲の検討を目的とした．本大会では，血清成分である総タンパク，アルブミン， A/G比，遊離脂肪酸，ケトン体，尿素態タンパクと，体重，RKFI， FMFIとの関係を解析した結果を報告する．

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 アザラシの寒冷環境における体温保持には皮下脂肪による熱放散の抑制が有効であるとされており，成獣は 4cm以上の厚い皮下脂肪を蓄積する．しかし，ゴマフアザラシ ( Phoca largha:　以下，本種 ) の新生児 は，流氷上へ産み落とされるため出生に伴い 40度弱の寒冷曝露を受けるが，皮下脂肪は 1cm未満と薄い．そのため，十分な断熱効果を得られていないと考えられ，発熱により体温を保持している可能性が推察された．そこで本研究では，寒冷環境で発熱を行うのに有効である，褐色脂肪組織 (BAT) に注目し，本種における BATの存在を明らかにすることを目的とした．さらに，他の大型哺乳類のBATは成長に伴い退縮していくことから，本種の成長に伴う BATの有無の変化を知ることにより，成長に伴う体温保持機構を考察した．本種の新生児，幼獣，成獣それぞれ 3頭を解剖した結果，頸部，腋下，肩甲骨間，心臓周囲，腎周囲，鼠径部には，皮下脂肪よりも褐色の脂肪組織が存在した．これらの組織において，HE染色，ウェスタンブロット法による Uncoupling protein 1 (UCP1) タンパク質の検出及び UCP1mRNAの検出を行った．HE染色の結果，全ての個体の全ての部位で BATの特徴である多房性の細胞が存在したが，腎周囲及び鼠径部は，他の組織に比べて脂肪滴が肥大していた．さらに，新生児の頸部，腋下，肩甲骨間，心臓周囲のみで UCP1タンパク質が検出されたが，幼獣及び成獣はどの部位からも UCP1タンパク質は検出されなかった．これらのことから，本種の新生児にはBATが存在し，BATの発熱により出生に伴う寒冷曝露から体温を保持している可能性が示唆された．さらに，新生児以外の個体では UCP1タンパク質が検出されていないことから，成長に伴い体温保持機構を発熱から熱放散の抑制に変化させていると推測された．

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 京都市嵐山で餌付けされているニホンザルでは，出産が何年も見られていない高齢個体であっても，頻繁に交尾行動を行う個体が観察される．これらの交尾行動は，加齢に伴う生殖機能の衰えから，繁殖に結びつく可能性が低いと考えられる．そこで本研究では，高齢個体に見られる交尾行動と内分泌動態との関連について解析したので報告する．
 嵐山Ｅ群の高齢個体（25才以上） 13個体を対象に，交尾行動の観察および糞サンプルの採取を行った．観察期間は 2012年 10月 30日から 12月 30日までの 61日間で，対象個体の発情兆候，交尾栓や交尾行動の有無，交尾行動のパートナーや射精の有無をアドリブ方式で記録すると同時に，10分おきのスキャンサンプリングを行い，視野にいる対象個体の行動も記録した．また，採取した糞サンプルから，EIA法により糞中性ホルモン代謝物である Estrone conjugates (E1C)と Pregnanediol glucuronide (PdG)量を測定し，これらのホルモン動態と行動観察のデータを併せて関連性を検討した．
 これらの結果，3個体（32才，32才，26才）で交尾行動が観察され，別の 1個体（33才）では交尾栓が確認された．これらの 4個体の糞中性ホルモン動態の変動については，いずれの個体においてもE1C，PdG値ともに緩やかで，排卵の有無は推定できなかった．また，観察された交尾行動は，E1Cが高値を示している時期にまとまって観察されていた．さらに，E1C値の上昇に伴う交尾パートナー数の増加，同性愛行動やオスへのマウントなどの交尾行動以外の性行動が長期間観察されるなどの傾向もみられた．
 これらのことから，高齢になり明確な排卵周期がなくなることが，交尾行動やその他の性行動の発現に影響を与えていることが考えられた．今後，高齢でも交尾行動を示さない個体との比較や，加齢に伴い変化する他種のホルモンの測定を行い，高齢個体の性行動についてより詳細に分析する必要があると考えられる．

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 The Iriomote cat is a highly endangered felid endemic to Iriomote-jima Island, with a population of around 100 individuals. To minimize disturbance, non-invasive genetic methods were developed to distinguish between Iriomote cats and domestic cats and to identify sex of Iriomote cats. Scats were collected throughout Iriomote-jima Island for DNA extraction. Scats were separated according to degree of freshness (scat category) and preservation method to compare between results of the different genetic methods. Multiplex PCR using mtDNA 16S was developed obtaining a success rate of 99.4% in identifying Iriomote cats. One scat sample was identified as belonging to both species, possibly due to the proximity of latrine sites. The SRY gene, found exclusively in males, was amplified using PCR, from 25.0% of the scat samples. The ZFY marker using PCR-RFLP with Dde I digestion was performed obtaining reliable results in 43.2% of scat samples. This method was determined to be more e.cient than the SRY marker to distinguish between the sexes, and therefore, it could prove effective for studying several sex-specific ecological traits of the Iriomote cat to aid in its management and conservation.

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 近年，味覚受容体が舌だけでなく消化器系やその他の臓器にも存在していることが，各種哺乳類において報告されている．本研究では，ニホンザルとコモンマーモセットを中心に， RT-qPCR法を用いて，味覚情報伝達に関わるであるＧタンパク質 α -gustducinとTRPM5，および各種味覚受容体などの存在量を定量解析した．その結果，コモンマーモセットで特異的にこれらの mRNAが，盲腸や大腸などで，舌と同量もしくはそれ以上に発現していることが確認された．また，免疫組織染色法を用いて，これらのタンパク質が存在している細胞の特定を試みた結果，特徴的な細胞に陽性シグナルが観察された．
 コモンマーモセットで観察された盲腸・大腸における味覚情報伝達分子群の特異的な発現は，マカクに加えてリスザルやヒヒなどでも観察されなかったことから，霊長類の中でもマーモセット科に特殊な現象である可能性が高い．マーモセットは樹脂や樹液を摂取し，盲腸で発酵することが知られている．盲腸における味覚情報伝達タンパク質群の発現は，この食性に関係しているかもしれない

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 生物の環境適応の進化過程を理解する上で，ニオイ受容に関わる嗅覚受容体遺伝子や色素タイプの決定に関わるメラノコーチン受容体遺伝子など，環境応答に直接関わる受容体遺伝子群の進化的動態は注目されている．クマネズミ類 (= Rattus属及びその近縁属 ) はその種数が約 200種と著しく多く，その一員であるドブネズミ Rattus norvegicusは現在全ゲノム配列が解読されているため，遺伝子の進化的動態を詳細に探る上で優れた研究対象であると目されている．本研究では，上述の２種の受容体遺伝子について，その進化的動態の概要を解明することを目的として研究を行った．嗅覚受容体遺伝子は遺伝子重複によって生じた大規模な多重遺伝子族を形成し，その重複数は哺乳類ゲノムの中で最大であることが知られているが，嗅覚受容体遺伝子それぞれの機能や進化に伴う遺伝子の獲得・消失の詳細については未だ不明な点が多い．ハツカネズミ Mus musculusとの分岐後に遺伝子重複によってコピーされたと考えられる特定の遺伝子に着目し系統学的解析を行ったところ， Rattus属の分岐後に重複が起きた可能性が示唆された．さらに，重複直後に複数のアミノ酸の置換が認められ，遺伝子変換の関与の可能性も示唆された．一方，毛色において多様なクマネズミ類において，毛色関連遺伝子 Mc1r (melanocortin 1 receptor) のコード領域全長配列 (954 bp)を約 20種について解読を行った．現在，系統ごとのアミノ酸置換速度の違いについて検討している最中である．本研究を通して，クマネズミ類は多様性科学において極めて有用な研究対象であることを部分的にでも実証できるものと考えている．

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 アルファサテライト DNAは，霊長類のセントロメアで主成分となる反復配列である．ヒトのアルファサテライト DNAは 2量体～ 15量体といった高次構造をとることが知られている．この高次構造はチンパンジー・ゴリラ・オランウータン等の大型類人猿にも存在する．ただし，ヒトほど複雑ではない．これらのヒト科とおよそ 1400万年前に分岐したとされるテナガザル科に関しては，探索はなされているものの高次構造が未だに見つかっていない．このため，高次構造はヒト科とテナガザル科が系統分岐した後に，ヒト科の系統で生じたと考えられている．本研究の目的は，テナガザル科でのアルファサテライト DNA高次構造の有無を詳細に分析し，高次構造の起源をより正確に推定することである．　そのために，テナガザル科 4属 (Hylobates, Hoolock, Symphalangus, Nomascus) 各 1種のゲノム DNAから，アルファサテライト DNAをクローニングして，その塩基配列を解析した． Symphalangus syndactylus（フクロテナガザル）のアルファサテライト DNA約 9kbからは，4量体と 6量体からなる高次構造が見つかった． Nomascus leucogenys(クロテナガザル )のアルファサテライト DNA約 12kbでも 9量体を形成していた．しかし，この 2属に関してはアルファサテライト DNAに高次構造があっても，セントロメア領域アルファサテライト DNAだとは断定できない．テナガザル科 4属の内この 2属において，染色体末端付近のサブテロメア領域でアルファサテライト DNAが増幅しているからである．これは，テナガザル科の活発な染色体構造変異の影響だと考えられている．　サブテロメア領域かセントロメア領域かは未だに明らかでないものの，テナガザル科のアルファサテライト DNAにも高次構造があることが確認できた．そのため，アルファサテライト DNAの高次構造はヒト科とテナガザル科の共通祖先において出現したことと推測される．

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 動物が高密度に生息する地域において，集団の血縁関係を明らかにすることは，その地域を利用する個体毎の繁殖，行動および分布様式を解明する上で重要である．そこで知床半島ルシャ地区におけるヒグマの繁殖，行動および移動分散様式を解明することを目的として，個体識別調査および集団遺伝学的解析により，個体間の血縁関係を解析した．材料は，同地区でヘアートラップ，ダートバイオプシー等により収集された遺伝子材料 51頭（雄 21頭，雌 30頭）分と，周辺地区（斜里，羅臼および標津地区）で学術捕獲あるいは捕殺個体 164頭分の遺伝子材料および各種メディアの情報を利用した．遺伝子解析には 22座位のマイクロサテライト領域を利用した．その結果，ルシャ地区には 15頭の成獣メスと，その子供からなる集団が生息しており，血縁は大きく２つの母系集団に分かれていた．また，最大で 3世代が共存していた．ルシャ地区で繁殖に関与する父親は，現在までに 5頭認められ，近親交配やマルチプルパタニティーが存在することが明らかになった．ルシャ地区を利用する個体の中で，5頭の亜成獣オスが斜里および羅臼地区側へ移動分散して捕殺されていることも明らかになった．このように，高密度に生息する知床半島ルシャ地区でのヒグマ集団の血縁関係を明らかにすることは，従来の野外調査では明らかには出来ないヒグマの繁殖システムの解明に寄与するだけではなく，繁殖個体の周辺地域への移動分散を明らかにすることができる．尚，本研究はダイキン工業寄附事業　「知床半島先端部地区におけるヒグマ個体群の保護管理，及び，羅臼町住民生活圏へ与える影響に関する研究」の一環として行われたものである．

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 霊長類の色覚と化学物質感覚（ケミカルセンス）は相互に関連して進化してきたと考えられている．しかし，その実態や食性との関連での適応的意義は明らかでない．新世界ザルは色覚の種間・種内変異が顕著であり食性も多様であるため，その優れた研究モデルとなる．苦味受容体は遺伝子数が約 20と比較的少なく，イントロンレスで遺伝子単離が容易であり，マカクやチンパンジーでの種内変異やヒトにおけるリガンド特性の先行情報が利用できるため，研究対象とした．昨年の本大会で我々は，コスタリカ・サンタロサ保護区に生息するノドジロオマキザルとチュウベイクモザルの野生集団に対して，数種類の苦味受容体遺伝子の塩基多型調査を行なったことを報告した．その中で TAS2R1に，リガンド結合に関与が予想されているアミノ酸サイトや，保存的なアミノ酸サイトに，種間・種内変異を見出した．　本大会では，TAS2R1及びヒトにおいて TAS2R1とリガンドの共通性のある TAS2R4に焦点を絞り，色覚や食性が異なるノドジロオマキザル（3アレル 2色 -3色多型色覚，果実・昆虫食），チュウベイクモザル（2アレル 2色 -3色多型色覚，果実食）コモンマーモセット（3アレル 2色 -3色多型色覚，昆虫・樹液食），ヨザル（夜行性完全色盲，果実食）の，間で，ヒトでいずれかの受容体で感受性が確認されているリガンドとの反応性をカルシウムイメージングにより定量し，比較した．その結果，パルテノリド，コルヒチン，樟脳などいくつかのリガンドに対して，反応性に種間の顕著な相違があることが明らかになった．リガンド感受性の大きな種間相違はこれまでに知見がなく，新世界ザル類という近縁種間で相違を示したことは，今後の色覚や食性との関連への研究展開に重要な一歩といえる．

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 マイクロサテライトマーカーは様々な野生生物の集団解析や家系解析，個体識別などに利用されているが，近縁種で開発されたものや 2塩基繰り返しのものを使用することが多く，正確なタイピングが困難な場合があった．近年，次世代シーケンサーの急速な普及によって短期間で大量の遺伝子情報を得ることが可能となり，マイクロサテライトマーカーの単離も容易となった．そこで本研究ではトドを例に，次世代シーケンサーを用いて新たに繰り返しが 3塩基以上であるマイクロサテライトマーカーを探索し，得られたマーカーを用いたトドの遺伝子解析への応用を検討した．　北海道で採取されたトド 1個体から抽出した粗 DNAを用い，454RocheGLXによってシーケンシング分析を行った．得られた塩基配列の中からタンデムリピートファインダーによってマイクロサテライトを含む配列を探索した結果，2～5塩基の繰り返し配列を含むマイクロサテライト領域が 886座位得られた．このうち 3～5塩基の繰り返し配列 655座位中 20座位について同じく北海道で採集された24個体分の試料を用いて増幅の確認と多型の検証を行った結果，8座位で多型性が認められ，対立遺伝子数は 2～4個で平均 2.63であった．ヘテロ接合体率の平均は観測値 Ho=0.54，期待値 He=0.47であった．トドの複数の個体群を対象としたマイクロサテライトマーカー 6座位による集団解析の先行研究では，個体群あたりの平均対立遺伝子数は 4.75であり，本研究で開発したマーカーは変異性がやや小さいものと考えられた．一方，開発した 8座位の組み合わせによって 24個体全ての識別が可能であった．今後分析個体数を増やし，集団解析等への応用の可能性について更に検討する予定である．また，今回検討したのは得られた 3~5塩基繰り返し座位の 3.1%に過ぎず，より変異性の大きいマーカーが得られる可能性も考えられた．

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 クマネズミ (the Rattus rattus species complex)は世界中に広く分布する侵略的外来種であるが，その起源はアジア亜熱帯域にあり，これまでの mtDNA変異を基づいた研究によると，6つの地域系統群が存在し，さらにヒトに随伴し，分布域を拡大しているのはインド・ヨーロッパの系統Ⅰ，ミャンマー・南中国の系統Ⅱ，東南アジアの系統 Ⅳであることが示されている．日本には系統 Ⅱに属する集団が生息しているが，東京，小笠原諸島および小樽で系統 Ⅰの個体が見つかっている．またクマネズミの毛色には通常の茶色型と変異型の全身黒色型があり，我々はこれまで，沖縄島で発見された全身黒色型は， Asip (agouti signaling protein)上に責任変異があることを明らかにした．しかし，沖縄島の全身黒色型の系統的起源については明らかにされていない．そこで本研究では，Asipのexon 2 (401 bp)， exon 3 (367 bp)，exon 4 (347 bp)の３つのコード領域周辺をマーカーとして用い，系統Ⅰ，Ⅱ， Ⅳに属するクマネズミ 58頭を対象に系統地理学的解析を行った．連結配列 (ハプロタイプ；1115 bp)を用いて Splits Tree4で描いた Neighbor Net法によるネットワークにおいて，クマネズミの配列は 4つのクラスターに分かれた．２つのクラスターは系統Ⅰ，系統 Ⅳに相当し，残り２つは沖縄産黒色個体を含む日本産クマネズミを代表するクラスターであった．このことから，mtDNA系統 Ⅱに属する日本産クマネズミは，核遺伝子変異に基づくと，２つの別個の地域系統の複合系統として位置づけられることが示唆された． Asipの変異に見られた系統 Ⅱの融合の歴史を解明するために，現在， Asipハプロタイプ間の組換えに注目し解析を行っている．

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