In GLP safety assessment studies, by comparison to other route of administration, inhalation can exhibit a relatively high level of variation in dosage due to the intrinsic characteristics of inhalation study technology. To generate aerosols, different air flow rates must be carefully and consistently controlled. Any change of air flow will cause instant changes of aerosol concentration leading to variation of dosage received by the animal. Most Inhalation delivery systems require a high level of manual intervention to control and adjust air flow; monitoring of the system is manual and often not continuous. This approach is both labor intensive and liable to mistakes. It also lacks precision. An important issue for study integrity is that if the air flow is not continuously monitored and a record maintained, the dosing process becomes a kind of “black box”. Any variation of the flow rate may not be identified immediately resulting in an inability to quantify the extent of a deviation, and leading to GLP compliance problems. Our inhalation system applies an automated control and recording system, which allow us to control, continuously monitor, and retain raw data of all exposure parameters for air flow and concentration of oxygen, carbon dioxide, temperature, humidity throughout the aerosol exposure process. The system will alarm, immediately prompting remedial/corrective action, should any parameter go out of pre-specified range and maintain an audit trail of this. This type of automated inhalation delivery system results in better animal welfare, more complete and reliable study data and excellent GLP compliance.

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Risk assessment of chemical is a key knowledge for the protection of human health. The aim of this study was to establish online course for the self-study of chemical risk assessment. The course outline was divided into 5 lessons consisting of hazard identification, hazard characterization, exposure assessment, and risk characterization. The audio lectures attached with reading materials were added in each lesson. The online qualitative and quantitative course data were evaluated by learners in term of self-learner’s performance and their satisfaction. The demographic data of 20 learners, who enrolled in our course aged between 20 – 30 years old, were post-graduate degree students. Based on the data, 50% of learners rated “fair” about their background knowledge in chemical risk assessment, whereas 25% learners rated “good” and 20% rated “no”. Learners’ satisfaction and their achievement in lesson were rated on a scale 1 (very poor) to 4 (very satisfied). For satisfaction, 65% of the learners rated a “3” for lesson’s style, 55% of the learners rated “3” for interested topics, and 50% of learners rated “4” for time of study. For their achievement in issues, 65% learners had more experience after finishing the course and rated as “4”, 50% learners rated “4” for comprehensive topics, and 55% learners rated quality of the lessons as “4”. Fifty percent learners rated “4” for the application to their career. We concluded that 80% of learners were satisfied in E-training course. Therefore, the online course for risk assessor should be further developed.

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The efficiency of nutrients from Moringa oleifera Lam to prevent the inflammation and tumorigenesis has been reported previously. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of boiled Moringa oleifera Lam. pod (bMO) on the apoptotic pathway related to colon carcinogenesis. Mice were randomly divided into five groups (8 mice/group). Four groups were induced by azoxymethane (AOM, 10 mg/kgBW i.p. at the 3^rd week) followed by dextran sodium sulphate for 7 days (DSS, 2% in drinking water at the 4^th week) and a negative group received AIN-76A basal diet without AOM/DSS induction. Positive control group received basal diet with AOM/DSS induction while the treatment groups received AIN-76A containing 1.5%, 3.0% and 6.0% of bMO at the 1^st week toward the 6^th week before AOM/DSS inductions. Mice were then sacrificed and necropsied at the end of the 20^th week. Pro-apoptosis BAX and anti-apoptosis BCL-2 proteins were investigated by immunohistochemistry. The results showed no significant difference (p<0.05) in all the treatment groups when comparing with the AOM/DSS group. All the treatment groups were not found in the ratio of BAX/BCL-2 and the nuclear staining determined the apoptotic bodies. The study did not indicated clearly the potential effect of bMO to induce apoptosis for colon cancer prevention. However, we can conclude that bMO could reduce the risk of colon cancer by other pathways, but not through the apoptosis process.

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Eryngium foetidum Linn. leaves (EF) have been traditionally used as a food and medicine in South East Asia. EF has been reported to prevent the colon carcinogenesis in mice treated with azoxymethane-dextran sulfate sodium by reducing their incidences and multiplicities. In the present study, the efficiency of EF to prevent the colorectal carcinogenesis at the translational level was investigated. Mice were divided into 6 groups, Group 1; control group, Group 2; positive control group, Group 3 and 4; were fed with 0.8% and 3.2% EF diets for 5 weeks, Group 5 and 6; were fed with 0.8% and 3.2% EF diets for 5 weeks ( 2 weeks before and 3 weeks during AOM/DSS administration). Total proteins from each colon sample were analyzed by GeLC-MS/MS. After fractionation by SDS-PAGE, the proteins bands were separated according to their molecular weight followed by tryptic digestion and nanoLC-MS analysis. Protein quantitation and identification were determined by Decyder MS Differntial Analysis and Mascot software. The results showed significantly different levels of protein expression between high (3.2%) and low (0.8%) dose in EF-treated mice having received AOM/DSS. However, the alteration of proteins involved in colorectal carcinogenesis was observed. Moreover, the protein profile of mice’s colon in AOM/DSS plus 0.8% EF did not affected the oncogene but protein level related with oncogene was increased in mice’s colon having received AOM/DSS plus 3.2% EF. It can be concluded that lower dose of EF are more potentially effective to prevent the colorectal carcinogenesis than higher dose.

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ネオニコチノイド系殺虫剤(NEO)は農林業や一般家庭で汎用されている殺虫剤であり、ヒトへの曝露状況調査が必要な物質の一つである。ヒトの尿を用いた生物学的モニタリングは、化学物質曝露評価手法の一つとして使用されてきたが、採尿が難しいオムツ着用者を対象とした調査は進んでいない。本研究では、簡便な採尿方法として使い捨て紙オムツを用いた尿中NEO濃度測定法(オムツ法)の確立を目指した。対象物質は6種のNEO (acetamiprid, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam, clothianidinおよびdinotefuran)、acetamiprid代謝物であるN-desmethylacetamipridの計7種類とした。使用済み紙オムツから尿をアセトン抽出し、多孔性珪藻土カラムおよび逆相系固相カラムにて精製した後に液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計(LC-MS/MS)で分離定量分析を行った。既知濃度尿のオムツへの添加実験によってNEOの絶対回収率は41から100%と算出された。検量線はいずれもr² = 0.988以上と良好な直線性を示した(濃度範囲1.25-20 µg/L)。日内変動および日間変動の相対標準偏差(%RSD)は、それぞれ3.3-12.7%および4.3-19.5%であった。検出下限値は0.5 (acetamiprid)、1.9 (imidacloprid)、0.9 (thiacloprid)、2.8 (thiamethoxam)、3.6 (clothianidin)、2.3 (dinotefuran)、0.4 µg/L (N-desmethylacetamiprid)と算出された。50人の3歳児から使用済み紙オムツを収集して分析した結果、検出率は74%のdinotefuranと68%のN-desmethylacetamipridで高く、その他は10% (acetamiprid), 4% (imidacloprid), 2% (thiacloprid), 12% (thiamethoxam), 28% (clothianidin)であった。オムツ法の検出下限値は、尿を直接分析する既報のそれに比べて高いが、使用済み紙オムツからNEOを検出できることが証明された。今後は本測定法を用いて、子どものNEO曝露状況の詳細な調査を進める予定である。

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今日、抗体医薬品をはじめとする様々なバイオ医薬品が数多く開発されており、世界の医薬品市場の売り上げ上位を占めている。しかし、バイオ医薬品の中にはヒトに対して免疫原性を示すものも存在し、それらを正しく評価することが重要である。特に生体試料中の抗薬物抗体（ADA: Anti-drug Antibody）の分析は重要な項目である。従来のLBA (Ligand Binding Assay)の分析方法は、ELISAや電気化学発光法が主流であったが、近年では欧米を中心に全自動LBAシステムであるGyrolabを用いた分析方法の開発も広がりを見せている。そこで、本報告では抗体医薬品に対するADAを測定対象物質として、新たな分析手法であるGyrolabによるADA分析方法の開発について報告する。

Recently, various biopharmaceuticals including antibody drugs have been increasingly developed, and account for the top sales of the world pharmaceutical market. However, since some biopharmaceuticals have immunogenicity to humans, it is important to evaluate it correctly. One of the most important issues is the analysis of anti-drug antibody (ADA) in a biological sample. In the conventional LBA (Ligand binding assay), ELISA and electrochemiluminescence methods have been considered as the mainstream, but in recent years, Gyrolab, a fully automated LBA system, has been expanding mainly in Europe and the United States. Based on this, in this study, we will report the development of the ADA analysis method by utilizing Gyrolab for ADA generated from antibody drugs.

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【目的】マイクロブラッドサンプリング（MBS）法は，ごく少量の血液から薬物濃度の測定が可能であり，これをマウス試験に適用できれば，使用動物数の削減につながり，3Rsへの貢献が期待できる．我々は今回，マウスを用いてMBS法により血中薬物濃度を測定すると共に，採血頻度が血液学的検査及び血液生化学的検査に与える影響の検討を行い，マウスからの頻回採血方法を確立した．
【方法】雄性ICRマウスを用いて，クラリスロマイシン200mg/kgを単回経口投与し，投与前及び投与後1，2，4，8，24時間の計6時点に，それぞれ頸静脈より約30µL採血した．その後，血漿中のクラリスロマイシン濃度をLC/MS/MSで測定した．群構成は，採血を実施しない群（対照群：1群，N=5），同一動物から6時点の採血を行う群（頻回採血群：2群，N=3）及び2匹1組で動物を入れ替えて，各動物3時点ずつ採血を行う群（スパース採血群：3群，N=6）を設定した．投与後24時間の採血終了後，全群で血液学的検査及び血液生化学的検査を行い，各群の結果を比較した．
【結果】血漿中薬物濃度は，2群と3群でほぼ同様の推移を示した．血液学的検査及び血液生化学的検査では， 1群と比較して，2群及び3群でRBC，Ht及びHbの低値が，2群のみにLDHの高値が認められた．3群で認められた赤血球系の低値は背景データの許容範囲であったため，スパース採血がより適切な方法と考えられた．トランスジェニックマウス等の希少動物を用いたファーマコキネティクス試験では，使用動物数を抑えるために同一動物からの頻回採血も選択肢の一つと考えられることから，採血回数の制限などを考慮する必要がある．現在，マウス4週反復投与毒性試験において初回投与時5時点，最終投与時6時点の頻回採血をスパース採血で行い，血液学的検査及び血液生化学的検査に与える影響について確認中であり，合わせて報告する．

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化学物質の安全性試験ガイドラインである発達神経毒性試験 (OECD GL 426) および拡張一世代生殖毒性試験 (OECD GL 443) では，成長期 (哺育25±2日；PND25±2) および若齢成熟期 (哺育60-70日；PND60-70) に驚愕反応装置を用いた感覚機能検査が必須の検査項目となっている。我々は，聴覚性驚愕馴化反応およびプレパルス抑制の評価に適した測定条件を得ることを目的として，胎児あるいは出生児に影響を及ぼすことが知られているフェノバルビタール (PB) を妊娠および哺育期に投与された母親の出生児を用いて，検討した。Wistar系SPFラットの雌に妊娠12日から哺育20日までPBを40および80 mg/kg/dayの用量で反復経口投与した。測定は， PND25， PND60-70の児動物に対して実施し，驚愕反応の条件は本刺激を100dB，本刺激に対するプレパルスを75dBおよび79dBとし，3つの試行を各10回ずつランダムに実施した。本刺激に対する驚愕反応値とプレパルスに対する抑制率から評価したところ，PND25では，PB投与群で対照群 (0 mg/kg/day) よりも驚愕反応値およびプレパルスに対する抑制率は減少傾向を示した。PND60-70では，PB群の驚愕反応値は増加傾向を示すが，抑制率は対照群と同等であった。当該試験で用いた測定条件は，成長期および若齢成熟期 のいずれにおいても驚愕反応を評価するのに適していると考えられると同時に，妊娠・哺育期のPB暴露が聴覚反応に影響を及ぼす可能性が考えられた。今後は，その他の運動および感覚機能検査を合わせて実施し，総合的に評価すると共に，妊娠・哺育期暴露による毒性影響が報告されている化学物質についても試験を実施し，今回の条件の有効性を確認する。

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【目的】DPRA(Direct Peptide Reactivity Assay)は、in chemico皮膚感作性試験代替法として2015年にOECD TG 442Cとして採択された。しかし、DPRAは、合成ペプチドを用いる性質上、比較的高濃度の被験物質溶液を用いるため、必要な被験物質量が多く、反応液中の被験物質の析出が頻発する、ペプチドと被験物質の共溶出が多い等の問題点がある。そこで筆者らは、ペプチドの代わりにCysとLysにナフタレン環を導入したNAC(N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-cysteine)とNAL(α-N-(2-(1-naphthyl)acetyl) -L-lysine)を用いることで、DPRAの問題点を克服したADRA(Amino acid Derivative Reactivity Assay)を開発した。現在、OECDガイドライン収載を目指し、主に施設内再現性を検証するPhaseⅠと施設間再現性を検証するPhaseⅡで構成するバリデーション計画を策定し、4施設（ライオン㈱、三井化学㈱、住友化学㈱、日産化学工業㈱）が参加するバリデーション研究を進めている。本報告では、これまでに終了したPhaseⅠの結果を報告する。
【方法】PhaseⅠでは、バリデーション実行委員会が選定した10物質を3セット独立にコード化し、参加4施設に送付した．各施設は、プロトコールに従い、溶媒検討の後、サンプルの評価を行った。設定された試験の成立条件を満たさなかった場合は再試験を実施した。試験結果は、統計解析部門により解析し、施設内再現性と皮膚感作性の予測性を評価した。
【結果と考察】PhaseⅠの結果、参加施設の施設内再現性は90～100%であり、目標値の80%を超え、ADRAが施設内再現性の高い試験法であることが示された。また、限られた物質数ではあるが、皮膚感作性については、一致率が98.3%であり、高い予測性が示唆された。今後は、PhaseⅡの結果と併せて施設間再現性や皮膚感作性の予測性について検証を行い、この結果をもとにOECDにテストガイドライン申請を行う予定である。

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　生体が化学物質に連続的に暴露されることによる全身毒性影響評価における動物実験代替法開発は、対象臓器及び毒性応答が多岐にわたることから、他の毒性に比べ遅れている。我々は、反復投与毒性試験において主要な標的臓器である肝臓に焦点を絞り、in vitro技術及び有用なin silicoシステムを用いた評価系の構築に取り組んでいる。これまでに、HepaRG細胞を用いた、細胞障害性、胆汁うっ滞、脂質代謝異常の3つの応答に基づくin vitro試験法と、in silicoシステム(HESS/MultiCase/DEREK)と組み合わせて評価することにより、感度よく肝毒性を検出し、且つそのメカニズムも把握することが出来る可能性について報告した。しかし、メカニズム理解には感度に課題が残るため、より普遍的に肝障害のメカニズムを捉えることを目的に、肝障害発生との関係性が報告されている活性酸素産生、ミトコンドリア毒性、リン脂質蓄積等のパラメーターを既存のパラメーターに加えて評価を実施した。
　医薬品、化学品、化粧品原料等の被験物質群に対し各種パラメーターを用いて解析したところ、多くの被験物質において酸化ストレスやミトコンドリア毒性が生じることが確認された。このうち、薬剤性肝障害を誘発することが知られているアミオダロンにおいては、暴露早期にROSの産生、時間経過とともにリン脂質の蓄積が認められ、最も用量感受性が高い応答はリン脂質蓄積であった。一方、肝障害の報告がない界面活性剤Sodium lauryl sulfateについては、細胞膜障害が認められる用量と近接している用量において、酸化ストレスやミトコンドリア毒性が認められた。
　以上のようにin vitro試験は、in silico試験において陽性のアラートが得られた物質のメカニズムからの考察に有用であると考えられた。

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【背景】我々はウシ摘出角膜を用いる眼刺激性試験（BCOP試験）における病理組織学的検査で角膜上皮に変化が認められない場合，あるいは扁平細胞層のみに変化がみられる場合には無刺激性として評価出来ると考えている．我々の実験では，IVIS≦6の場合には角膜上皮の扁平細胞層以外には変化はみられなかったことから，昨年の本学会においてIVIS≦6の被験物質については無刺激性物質とすることを提案した．一方，強刺激性物質に分類されたn-butanalに曝露した角膜のヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色標本にはまったく変化が認められなかったことから，Periodic acid Schiff (PAS)染色標本を作製し，変化の有無を検索した．【材料および方法】BCOP法はOECD TG437に従って実施した．角膜は食用牛の眼球から採取し，被験物質にはn-butanal，陰性対照物質には蒸留水，比較対照物質としてアルデヒド類を使用した．混濁度および透過性を測定後，in vitro 刺激性スコア(IVIS)を算出した．ウシ角膜は10%中性緩衝ホルマリン液で固定して，パラフィン包埋後，薄切し，H.E.染色およびPAS染色を実施し，鏡検した．【結果および考察】n-butanal のIVISは72.2であり，腐食性・強刺激性物質に分類されたが，H.E.染色標本では変化は見られなかった．比較対照物質のアルデヒド類に暴露した角膜のH.E.染色標本では，上皮全体の染色性低下がみられた．陰性対照の角膜では，上皮全体がPAS染色陽性であることが確認されたが，n-butanalあるいはアルデヒド類に曝露した角膜ではPAS染色陰性であった．従って，IVISと病理組織学的検査の結果が不一致で，角膜上皮の染色性低下が推測される場合にはPAS染色を実施することで，角膜上皮の変化の検出精度を上げることが出来ると考えられた．

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【目的】経済協力開発機構（OECD）の化学物質の試験に関するガイドラインTG421及びTG422の改定に伴い、甲状腺ホルモンであるチロキシン（T4）の測定が必要となるが、T4の測定は一般に血液内濃度をELISA法やRIA法を用いて行なわれている。近年、組織内の濃度を正確に定量するLC-MS/MSを用いることでより微量成分を測定することが可能となった。そこで我々は、より簡易に測定できる方法を開発すると共に背景データの獲得を目的としてT4濃度を測定した。　
【材料と方法】T4とトリヨードチロニン(T3)及びT3の構造異性体であるリバースT3(rT3)を同時に分析するLC-MS/MS（UPLC-Xevo TQ-S micro、 Waters）を用いた方法を確立し、ラット血清中T3、T4高感度分析法バリデーションを実施した。次に SD系雄ラット15-16週齢から対照群と絶食を16-19時間実施した群（各n=35）を用いて、同時間に同様の手法で採血して得られた血清を用いてLC-MS/MS分析を実施した。
【結果】LC-MS/MSによる分析条件を検討した結果、0.1%ギ酸含有アセトニトリルによるグラジエント分析によりT3とrT3を完全分離するクロマトグラムが得られた。測定時間は2.8分間であった。T4、T3及びrT3の定量下限値は0.5 ng/mLであった。検量線の直線性は得られ、日内日間再現性は評価基準（真度±15%）を満たしていた。溶液内安定性は1年間安定であり、血清中長期安定性（冷凍-80 ºC）は74日間安定であった。対照群のT4の平均値は19.46 ng/mLであり、標準偏差は2.811であった。一方、絶食群の平均値は19.00 ng/mLであり、標準偏差は3.548であった。
【考察】T4、T3の同時分析を短時間で測定することが可能となった。また、抽出も簡易で実施できることから1試料あたりの抽出から測定結果の算出まで、およそ20分であり短時間で評価できた。雄ラットにおける対照群と絶食群では有意な変化は見られなかった。今回得られた結果はOECDTG421及び422での生殖毒性評価における背景データとして有用である。

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【目的】毒性試験において、被験物質の媒体として0.5w/v%あるいは1w/v%のメチルセルロース(MC)やカルボキシメチルセルロース(CMC)はよく使用されているが、 これら単独での保存安定性の報告は少ない。そこで本検討では水溶液中でのMC及びCMCの長期冷蔵下での安定性を評価することを目的とした。
【材料と方法】MC（信越化学工業株式会社製、粘度15mPa-S）は0.5及び1%(w/v)、CMC（丸石製薬株式会社製）は0.5%(w/v)となるよう蒸留水を用いて調製（各n=3）した。測定は家庭用合成洗剤試験方法（JIS K3362^:2008）のCMC定量法を基に簡易にできる方法に変更して実施した。調製時、冷蔵保存（4 ºC）2週間及び4週間後の測定時期毎及び測定溶液毎に吸光度の平均値、標準偏差及び相対標準偏差を求め、保存後の溶液については残存率を求めた。
【結果】冷蔵保存後2週間及び4週間に、MC及びCMC水溶液を測定した結果、残存率は0.5% MC水溶液では 保存後2週間で100.1%、4週間で111.7%、1%MCでは保存後2週間で101.3%、4週間で114.9%、 0.5%CMCは保存後2週間で97.0%、4週間で99.0%であった。
【考察】0.5%CMCにおいては4週間まで安定であった。一方、0.5%MC及び1%MCは2週間まで安定が認められたが、冷蔵4週間まで保存したところ、両濃度ともに残存率に上昇傾向がみられた。MCは分子鎖の水和が温度の上昇とともに減少することや長期保存中に溶液粘度は低下する傾向があることから、冷蔵保存での安定性はCMCより短いと考えられた。そのメカニズムの詳細は不明であるが、MCは調製後少なくとも冷蔵保存下で2週間、CMCは4週間の安定性があることが確認された。

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【目的】“メタロミクス”は，ゲノミクスおよびプロテオミクスと同様に，生体の機能解明のみならず，疾病や病態の理解においても重要な科学領域であると考えられる。特に，カルシウムや鉄イオンなどの金属イオンの細胞内挙動（細胞内濃度）を正確に把握することは，金属イオンを介した生体機能制御の分子メカニズムを解明するうえで重要である。本研究では，細胞内金属イオン濃度の定量時における条件の最適化を指向し，分裂酵母細胞を用いてICP-AES(OES)による細胞内金属イオン濃度の定量に関する基礎的検討を実施した。
【方法】分裂酵母Schizosaccharomyces pombeの野生細胞を用いて，細胞溶解条件の最適化（硝酸処理，zymolyase処理，westase処理）を行った。細胞溶解は微分干渉顕微鏡により評価した。次に，ICP-AESを用いて硝酸処理した野生細胞内のカルシウムイオン濃度を定量した。また，野生細胞および鉄イオントランスポーターであることが示唆されているPcl1のノックアウト（pcl1 KO）細胞を用いて，ICP-OESにより細胞内鉄イオン濃度の定量も実施した。
【結果・考察】野生細胞を用いた細胞溶解条件の最適化の結果，60%の硝酸処理が最も適していることが明らかとなった。また，野生細胞内のカルシウムイオン濃度を定量した結果，細胞数依存的に濃度の増大が確認された。さらに，野生細胞およびpcl1 KO細胞内の鉄イオン濃度を比較した結果，pcl1 KO細胞内の鉄イオン濃度の方が低いことが示され，先行研究¹⁾と同様の結果が得られた。これらのことより，本研究で採用した細胞溶解条件は，酵母細胞内の金属イオンの定量に有効であることが示唆された。今後，各種金属イオンの同時定量法の確立や適用細胞の評価に関しても併せて検討を行う予定である。
【参考文献】
J. Biol. Chem., 287(51), 43042-43051.

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肝臓の三次元培養法は，肝細胞の長期培養やより生体に近い機能維持が可能であることから，in vitroの肝毒性評価系として有用である．すなわち，化合物曝露後の細胞の形態学的変化や細胞内の反応性をこの技術で評価することにより，ヒトでの肝毒性予測に活用できると考えられている．本研究では，これまでに行ってきたヒト初代肝細胞を用いたスフェロイド培養に新たにヒトクッパー細胞を加えたスフェロイド共培養系を作製し，化合物曝露による肝毒性を包括的に評価し，その有用性を検討した．ヒト初代肝細胞とヒトクッパー細胞を混合したスフェロイドを作製し，媒体，acetaminophen，amiodarone，rosiglitazoneなどを曝露した．経日的に細胞膜透過性，ミトコンドリア膜透過性，Lipid droplet集積，ROS産生について，各種蛍光プローブを用いて測定した．また，培養上清中のバイオマーカー（アルブミン，LDH）も併せて測定した．スフェロイドのパラフィンブロックを作製し，HE染色及び免疫染色を用いて評価した．
　各化合物を曝露したヒト初代肝細胞とヒトクッパー細胞の共培養スフェロイドは，各蛍光プローブの測定において，それぞれ用量依存的に特徴的な変化が認められた．培養上清中のアルブミン量，LDH量は化合物の曝露量ならびに曝露時間で変動した．また，HE染色及び免疫組織標本において，クッパー細胞の存在が確認され，化合物によって，肝細胞変性及び壊死像や空胞化などを認めた．以上のことから，ヒト初代肝細胞とヒトクッパー細胞のスフェロイド共培養系における形態学的評価及び細胞内の反応性の評価とバイオマーカーの変動は，肝毒性検出に有用であることが示唆された．なお，現在は，化合物と評価項目を増やして検討しており，その結果及びクッパー細胞を加えることの有用性についても併せて報告する．

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【目的】レチノイン酸の組織濃度の直接定量は、胎児の限られた組織において、数nMレベルのごく微量の測定を行う必要があり、従来のHPLCやLC/MS/MSにより定量的に分析を行うことは非常に難しい。そこで、本研究では、in vivoにおけるレチノイン酸濃度変動と催奇形性発症の関連性を明らかにする目的の一環として、レチノイン酸によって強く誘導されるレチノイン酸分解酵素、CYP26A1遺伝子を用いてレポーターアッセイ系を構築し、培養細胞系にてアゾール系化合物によるレチノイン酸の濃度変動の測定が可能であるかの検討を行った。
【実験】CYP26A1/RARE遺伝子レポーター発現アデノウイルス（Ad-CYP26A1/RARErp）を作製し、その至適条件の検討を行った。更にCYP26A1発現アデノウイルスを用いて同時発現させ、種々のアゾール系化合物を添加することにより低濃度下におけるレチノイン酸濃度変動の測定が可能か検討した。
【結果】Ad-CYP26A1/RARErpのMOI依存的なレポーター活性の上昇を確認することができ、50MOI感染細胞においてレチノイン酸濃度依存的で安定な転写活性化が認められた。また、CYP26A1を同時発現させることでMOI依存的なレポーター活性の変動を確認することに成功した。次に、CYP26A1に対して特異的阻害の報告があるtalarozoleとketoconazoleを用いて酵素活性阻害によるレポーター活性の変動を評価した。その結果、それぞれ報告されているIC₅₀値に対して対応する値を得ることができた。
【結論】本手法により十分な精度でアゾール系化合物によるレチノイン酸低濃度変動を評価できるレポーターアッセイ系を構築することに成功した。

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再生医療等製品（特に細胞加工製品）の実用化においては課題が多いが，幹細胞を利用した，特にiPS細胞加工製品の造腫瘍性が非臨床安全性試験におけるひとつの検討事項になっている（細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針）．造腫瘍性を評価する方法として，遺伝子やタンパク質の発現で未分化細胞を検出するqRT-PCRやフローサイトメトリー，足場非依存的増殖細胞（悪性形質転換細胞）を検出する軟寒天コロニー形成試験，及び直接的なin vivo特性を評価する免疫不全マウスを用いた移植モデル試験が検討されている．qRT-PCRやフローサイトメトリーは1日での評価が可能であるが，ターゲットが限定されることや検出感度が低いことが課題である．一方，軟寒天コロニー形成試験や移植モデル試験では，造腫瘍性を示すターゲットの網羅的な検出や高感度検出が可能であるが，煩雑な操作を含むことや時間を要することが課題である．
今回我々は軟寒天コロニー形成試験の課題を解決するため，軟寒天を代替する各種ポリマーを用いた培養系を検討し，培地への添加により細胞の遊走制御と均一な分散を可能とするポリマーLA717を見出した．LA717が構成する凝集構造により，LA717含有培地中では単細胞及びスフェア（コロニー）が均一に分散された状態で維持され，各種がん細胞株の細胞増殖性が向上していた．そこでLA717含有培地を用いてコロニー形成試験に与える影響を観察した．hMSC中に0.0001～0.1%の割合でHeLa細胞を混合し，LA717含有培地中で培養した結果，2週間でHeLa細胞の混合割合に準じたコロニー数が検出された（軟寒天コロニー形成試験では3-4週間）．本法は従来の軟寒天コロニー形成試験と比較すると，細胞播種時に多層状態を構築する必要がないため，簡便かつより迅速なコロニー形成試験として普及が期待される．

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MSI, known to bring molecular distribution information, allows quantification. This has been established with QWBA but it lacks the ability to differentiate between drug components&establish separate quantitative results for each target.This demonstrates our capabilities as complementary to QWBA to follow chloroquine&its metabolites at different time-points after an administration of a radiolabeled dose to rats; euthanized at 4,24,72,168&336h post-dose.Carcasses were frozen in a hexane/dry ice bath,embedded in chilled carboxymethylcellulose&frozen into blocks. QWBA images were obtained following exposure to phosphorimaging screens&scanned using a GE Typhoon scanner. QWBA images were quantified against 14Cfortified standards using MCIDTM. For QMSI, MALDI matrix spiked with labeled chloroquine-d4&its metabolite desethyl chloroquine-d4 were sprayed onto the slide. Analyses were performed by a MALDI-FTICR in the head:the eye& in the mid whole-body region. 1H-Chloroquine&1H-desethyl chloroquine were detected by MALDI-FTICR in the eye: uveal tract, vitreous humor...In the mid whole-body region, 2compounds were detected in organs from T4h sections.2compounds were co-localized into the tissue sections&distributions matched the zones obtained by QWBA.The advantage’s the ability to discriminate between parent drug 1H-choloroquine&its metabolite 1H-desethyl chloroquine so that each compound had its own distribution image&its quantification data.The used labeled forms of both compounds during the matrix deposit allowed normalizing the data for each position with the MALDI onto the section of interest&calibration range of both 1H-choloroquine&1H-desethyl chloroquine and quantifying each compound into the organs of interest with the ILC.QMSI demonstrate the disappearance of the drug &its metabolite with time to understand differential pharmacokinetic demonstrating the additional input of the technology compared to QWBA.

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【背景】薬物感受性の差異が生じる原因の一つとして遺伝子多型が知られているが，医薬品開発の毒性評価に汎用される動物種であるサルにおいて，遺伝子多型が薬物感受性に及ぼす影響については不明な点が多い。我々は，ヒトFcγR3Aの一塩基多型（SNP）によるアミノ酸置換（V158F）がリツキシマブの抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性に影響すること，さらには，ヒト抗原ペプチドトランスポーター1/2（TAP1/2）の機能が遺伝子変異によって喪失すると，NK細胞によるADCC活性の低下をもたらすことに着目し，カニクイザルのFcγR3AおよびTAP1の遺伝子多型がADCC活性に及ぼす影響について検討を行った。
【方法】ヒトにおけるFcγR3AおよびTAP1の遺伝子多型のこれまでの報告に基づき，複数のカニクイザルから採取した末梢血単核球（PBMC）のジェノタイピングを行い，遺伝子型を同定した。PBMCに発現するFcγR3AおよびTAP1のSNPがトラスツズマブのADCC活性に及ぼす影響について評価した。標的細胞にはNCI-N87細胞を用いた。
【結果・考察】FcγR3A 1134 A>C（エクソン置換：S41R），FcγR3A 5027 A>G（イントロン置換）およびTAP1 1 A>G（開始コドン消失）のSNPが同定されたPBMCにおいて，野生型に比べてADCC活性の有意な低下がみられた。また，ハプロタイプ解析の結果，FcγR3A 1134 A>C + TAP1 1 A>GおよびFcγR3A 5027 A>G + TAP1 1 A>GのSNP-SNPペアを有する場合，ADCC活性が更に低下することが明らかになった。なお，FcγR3AのSNPによるFcγR3Aの発現量およびIgG結合能の低下は認められなかった。これらの検討結果より，カニクイザルのFcγR3AおよびTAP1遺伝子多型は，ヒトでの報告と同様にADCC活性に変化をもたらすことが示唆され，抗体医薬品の薬理作用等に影響を与える可能性が考えられた。

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【背景・目的】無機ポリリン酸（polyP）は、あらゆる生物種に普遍的に存在するリン酸重合化合物であり、その分子の長さによって異なった生体作用を示すことが知られている。特に分子量の大きい長鎖分割polyP（平均リン酸重合度約150）は、iNOS発現や破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることが明らかになっており、さらなる機能の存在が示唆されている。敗血症性ショックは、エンドトキシンによって引き起こされる予後不良の病態であり、炎症性サイトカインやフリーラジカルなどの炎症性メディエーターが関与していると考えられている。そこで本研究は、リポポリサッカライド（LPS）により誘発される致死性ショックにおける長鎖分割polyPの作用に焦点をあて検討を行った。
【方法】実験動物はddY系、雄性、8週齢のマウスを用いた。LPSおよび長鎖分割polyPは、生理食塩水に溶解し尾静脈内に投与した。
【結果および考察】エンドトキシンショックによる死亡におけるLPSの用量依存性を確認するために、マウスにLPSを30, 50, 100 mg/kgの用量で投与したところ、50 mg/kg群では投与5日後までに、また100 mg/kg群では投与2日後までに全匹が死亡した。一方、30 mg/kg群では投与7日後まで75%のマウスが生存した。この結果から50 mg/kg LPSを用いて、長鎖分割polyP（0.1 mmol/kg, リン酸濃度として）のエンドトキシンショックによる生存率の改善効果について検討を行った。その結果、50 mg/kg LPS単独群では、投与7日後までの致死率が80%だったのに対して、LPS処置1時間前に長鎖分割polyPを前投与した群では、その致死率が27%に低下した。以上の結果から、長鎖分割polyPは、エンドトキシンショックによる致死率を低下させたことから、LPSによる炎症応答に対して抑制作用を示すことが示唆された。

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【背景・目的】抗体医薬の重篤な毒性の一つであるCytokine release syndrome (CRS)は、動物実験でその兆候を捉える事が難しい。ヒト細胞を用いる主に2種のin vitro試験法が提案されているが、CRSのメカニズムによって感度の高い方法が異なることが分かってきた。全血と液相抗体を使用するwhole blood cytokine assay（WBCA）は全血液成分を含むため様々なメカニズムの抗体に対して使用できると考えられるが、TGN1412に対する反応が弱い。固相化抗体を使用するPBMC法は、TGN1412に対する感度が高いが、偽陽性が出やすい。我々は、それぞれの試験系においてTGN1412がどのようにサイトカイン産生し、試験系としての反応の強弱につながるのか検討した。
【方法】3例のヒト血液サンプルを使用し、WBCA及びPBMC法を用いて、自家合成したCD28スーパーアゴニスト抗体であるTGN1412（CD28SA）を100 μg/mLまで処置した。2つの試験法において、培養液中サイトカイン濃度の測定及び細胞内サイトカイン染色によりサイトカイン産生細胞を特定した。
【結果・考察】WBCAにおいて最も高感度なマーカーであるIL-8は、単球及び顆粒球から産生されており、CD28SAのFcγRを介した反応を捉えていることが示唆された。WBCAではCD28SA処置によりT細胞で産生されるIL-2，TNF，IFN-γなどはドナーによって反応のあり/なしがあったが、PBMC法では全例のT細胞でIL-2，TNF，IFN-γの産生が認められた。これらの事から、WBCAはCD28SAのFc機能に起因するサイトカイン放出を検出し、PBMC法はCDR機能のCD28シグナリングによるT細胞からのサイトカイン放出を検出しており、2つの試験系はCD28SAの異なる生物活性を評価していることが示唆された。従って、CRSポテンシャル評価では、懸念される作用メカニズムによって適切な評価系を選択する必要がある。

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【目的】イソチアゾリノン系抗菌剤は、化粧品をはじめとして塗料、接着剤、衛生用品など様々な製品に使用されているが、近年、これら抗菌剤が直接的な作用とは別に、室内空気を介して皮膚、眼および気道への刺激を引き起こす事例が報告されている。これまでに我々は、気管支上皮細胞株をはじめとする種々ヒト由来細胞株を用いて、イソチアゾリノン系抗菌剤、2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one (OIT)の細胞毒性について比較検討をおこなってきた。本研究では、冷感効果を謳った消費者製品からも高頻度で検出されることが報告された2-methyl-4-isothiazolin-3-one (MIT)など種々のイソチアゾリノン系抗菌剤の細胞毒性について評価した。
【方法】ヒト由来培養細胞株として、気管支上皮細胞株 (BEAS-2B)、肺胞基底上皮腺癌細胞株 (A549)、急性単球性白血病由来細胞株 (THP-1)を用いた。これら細胞株を1×10⁵ cells/mlの濃度で96穴プレートに播腫し、24時間後にイソチアゾリノン系抗菌剤 (0.1～5 µM)を添加した。添加後24時間後における細胞生存率をcell counting kit 8を用いて測定した。
【結果と考察】5種類のイソチアゾリノン系抗菌剤すべてにおいて、BEAS-2Bの細胞生存率の低下が認められた。そのEC₅₀値は、OIT (0.7 µM) > 4,5-dichloro-2-octyl-4-isothiazolin-3-one (2CI-OIT) (1.5 µM) > 1,2-benzisothiazol-3-one (BIT) (1.7 µM) > 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one (Cl-MIT), MIT (> 5 µM)の順であった。また、THP-1においては、OIT、2CI-OITおよびCl-MIT処理において細胞生存率の低下が認められ、そのEC₅₀値は、OIT (0.3 µM) > 2CI-OIT (0.7 µM) > Cl-MIT (1.9 µM)の順であった。これらイソチアゾリノン系抗菌剤による細胞生存率の低下は、N-アセチルシステイン、還元型グルタチオン存在下において有意に抑制された。一方、今回検討した濃度範囲のイソチアゾリノン系抗菌剤では、A549における細胞生存率の低下は認められなかった。以上の結果より、イソチアゾリノン系抗菌剤は、細胞種間で異なる作用を及ぼすことが明らかとなった。

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【目的】室内環境化学物質による健康被害の顕在化によってシックハウス対策が講じられ10年以上が経過し、代替溶剤等による新たな室内空気汚染が懸念されていることから、現在、室内濃度指針値の見直しあるいは対象物質の追加に関する議論が進められている。本研究では第20回 シックハウス (室内空気汚染) 問題に関する検討会において室内濃度指針値策定候補物質に追加された2-Ethyl-1-hexanol、Texanol、TXIBを対象として、化学物質による気道刺激に重要な役割を果たす侵害受容体TRP (Transient Receptor Potential Channel)イオンチャネル活性化について、ヒトTRPA1および新たに樹立したマウスTRPA1安定発現細胞株を用いて検討を行った。
【方法】ヒトTRPA1およびマウスTRPA1の安定発現細胞株を用いて、細胞内カルシウム濃度の増加を指標として対象化合物のイオンチャネルの活性化能を評価した。カルシウム濃度の測定にはFLIPR Calcium 6 Assay Kitを用い、蛍光強度の時間的な変化をFlexStation 3で記録した。
【結果および考察】2-Ethyl-1-hexanolはヒトTRPA1およびマウスTRPA1のいずれに対しても濃度依存的な活性化を引き起こし、そのEC50値には顕著な差は認められなかった。一方、TexanolはヒトTRPA1については典型的なSigmoid型の濃度反応曲線を示したのに対して、マウスTRPA1については500 µMを超える濃度範囲で活性が阻害される所謂ベル型の挙動を示すことが判明した。TXIBについては、本評価条件においてはTRPA1の活性化は認められなかった。以上の結果から、2-Ethyl-1-hexanolとTexanolは、TRPA1の活性化を介して気道過敏の亢進を引き起こす可能性があること、さらに、Texanolに対する応答性にはヒトとマウスで種差があることが示唆されたことから、これら化合物に関する安全性評価を行う際には種差を十分に考慮する必要があると考えられる。

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【目的】更年期障害のホルモン補充用医薬品プレマリンは、牝馬の尿中に存在するエクイリン(Eq)などエクインエストロゲン類(EQs)を成分とする。これまでに我々は北海道の河川から複数のEQsを初めて検出し、存在実態を明らかにした。本研究では、魚類に対するEqの有害性とそのメカニズムを明らかにするため、雌雄ヒメダカ(Oryzias latipes)の繁殖及び次世代に対する影響を評価し、肝臓中の遺伝子発現解析を行った。
【方法】成熟雌雄ペア（5ペア/濃度区）を助剤対照区、Eq-10, 100及び1000 ng/Lに21日間曝露した。曝露期間中、各ペアの産卵数、受精率及び生死と産卵後のF₁胚の孵化率を算出した。曝露後は全長、体重、肝臓(HSI)及び生殖腺対指数(GSI)を算出した。遺伝子発現解析は、肝臓中vitellogenins (Vtg1, 2)、choriogenins (ChgL, H)、estrogen receptors (ERα, β1, β2)、pregnane X receptor (PXR)、cytochrome P4501A及び3A (CYP1A, 3A)と内部標準遺伝子をリアルタイムPCRで相対定量した。
【結果及び考察】繁殖試験の結果、雌雄の全長、体重、HSI及びGSIに変化はみられなかったが、1000 ng/L区における21日間の平均産卵数は有意に減少した。また、F₁胚の孵化率は100及び1000 ng/L区で有意に減少し、1000 ng/L区の孵化仔魚では背骨の湾曲など奇形が観察された。遺伝子発現解析の結果、雄ではVtgs、Chgs、ERα/β1及びPXR遺伝子の濃度依存的な発現誘導がみられたが、雌では測定対象とした遺伝子の発現に変化はなかった。これらのことから、Eqはヒメダカの繁殖及び次世代に影響し（最小作用濃度100 ng/L）、肝臓中の遺伝子発現応答の性差が示唆された。
【謝辞】本研究は、環境省「EXTEND2010基盤的研究」の助成を受けて実施した。

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【目的】医薬品類は農薬などと異なり環境動態や生態系への毒性が考慮されていなかったが、下水や河川などの水環境中から多種類の医薬品が検出されるようになり、その影響が問題となっている。医薬品や生活関連化学物質 (PPCPs : pharmaceuticals and personal care products)を高濃度で含有する生活排水の多くは下水に排出され、公共の下水処理場で浄水された後、河川や海域に放出されている。下水処理により除去され切れずに環境中に流出するPPCPsも多いことより、特に水環境中での生態毒性などが懸念される。公共下水処理場では、活性汚泥など微生物を用いた浄化法を行うところが多く、浄化処理の最終段階で消毒のため塩素の注入が行われていることより、下水処理で除去し切れなかったPPCPsが塩素消毒処理により構造変換を受ける可能性がある。構造変換により薬理作用は消失するが、新たな毒性を発現することが考えられる。本研究では、PPCPsの塩素消毒処理による構造変化と変異原性活性などの毒性変動に関して、水環境中から検出が報告されているPPCPsに関して検討を行った。
【実験方法】下水処理場で行われている塩素消毒のモデル反応として、PPCPsに次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え0.5～24時間室温で撹拌反応させた後、固相抽出し試料とした。経時的な分解率及び分解物の生成をHPLCで検出し、変異原性をAmes試験で調べた。
【結果および考察】PPCPsとして今回chlorpromazineおよび食用色素erythrosine(R3)を用いた。両者とも0.016～0.16 g/lの有効塩素濃度で濃度依存的な未変化体の減少といくつかの分解物と思われるピークが認められた。塩素処理抽出物を用い、Ames試験を行ったところ、chlorpromazine 自身では菌に対する毒性がみられたが、塩素処理後の試料ではTA98, TA100株ともに有意な変異原性の発現が濃度依存的にみられた。本活性はS9 mix処理を行うことで低下が観察され、代謝により変異原性の減弱が起きることが示唆された。

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　有機スズ化合物であるトリブチルスズ（TBT）はもともと漁業用防汚剤として使用されていたが、現在では環境汚染物質として有害性が指摘され、特定化学物質に指定されている。TBTはnMオーダーの低濃度で中枢神経毒性を引き起こすことが報告されているが、ヒト発達期における毒性メカニズムは不明な点が多い。我々は、これまでにヒトiPS細胞におけるTBTの毒性を検討した結果、nMオーダーのTBT曝露により、ミトコンドリア融合因子Mfn1が分解されて分裂形態のミトコンドリアが増加し、ATP産生低下を伴うミトコンドリア機能障害を引き起こすことを明らかにしてきた。
　本研究では、低濃度TBTがヒトiPS細胞の神経分化に与える影響について詳細に解析を行った。神経分化誘導にはTGFβ及びBMPシグナル阻害剤によるDual SMAD阻害法を用いた。まずTBT曝露（50 nM、24時間）後のiPS細胞を用いて神経分化誘導を行った結果、神経誘導2日目までに外胚葉マーカーOTX2の発現が低下することを見出した。さらにTBT曝露により、神経誘導4、8日目までにそれぞれ神経外胚葉マーカーPAX6、神経前駆マーカーNestinの発現が低下することも見出した。次にTBTのミトコンドリア毒性と神経分化阻害との関連を明らかにするために、Mfn1ノックダウンしたiPS細胞を用いて神経分化誘導を行った結果、TBT曝露と同様に、神経誘導に伴うOTX2、PAX6、Nestinの発現低下が認められた。
　以上の結果から、ヒトiPS細胞において、nMオーダーのTBT曝露によりMfn1が分解され、ミトコンドリア機能が低下し、神経分化誘導が阻害される可能性が示唆された。

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【背景・目的】有害物質の影響を受けやすいと考えられる妊娠期や乳幼児期における環境化学物質曝露は、様々な後発的影響を誘導することが懸念されている。近年、疫学研究においても、C3Hマウスを用いた動物実験においても、妊娠期にヒ素曝露を受けると生まれたF1世代で肝腫瘍発症率が増加することが報告された。我々の研究で、C3HマウスのF2世代においてもヒ素曝露群で肝腫瘍発症率が増加し、妊娠期ヒ素曝露の影響はF1及びF2世代でも現れることが明らかになった。本研究では、これらの現象の解明に向けて、F1及びF2世代の肝臓に着目し、肝臓から単離した肝細胞でフェノタイプ及びメカニズムを検討した。
【実験】C3HマウスF0の妊娠8～10日に85 ppmの亜ヒ酸ナトリウムを飲水投与し、産まれたF1及びF2世代74週齢の雄の肝臓からコラゲナーゼ灌流により肝細胞を単離した。得られた肝細胞をコラーゲンコートdishに播種し、37℃で培養した。4時間後にdish内からランダムに10箇所選び、dishに接着している細胞数を測定した。また、播種前のF1及びF2世代の肝細胞からタンパク質を調製し、リン酸化状態を網羅的に解析した。
【結果・考察】F1世代のヒ素曝露群では、コラーゲンコートdishに接着する肝細胞数が対照群と比較して有意に減少した。また、F2世代においても接着細胞数の有意な減少が観測された。したがって、妊娠期ヒ素曝露の影響はF1及びF2世代に現れていることが明らかになった。F1及びF2世代の肝細胞から調製したタンパク質のリン酸化状態を網羅的に解析した結果、炎症に伴う上皮細胞の間葉細胞系への変換にかかわるタンパク質のリン酸化がヒ素曝露群で亢進していることがわかった。今後、肝細胞でみられた影響が肝腫瘍発症率の増加に関与するかどうか検討する。

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【目的】我々はこれまでにバナジウムの生体影響に関してマウスを用いて検討を行ってきた。その結果、バナジウムを長期間摂取することにより中性脂肪の増加が抑制されることを見出した。一方、バナジウムの毒性が食事中のカロリー量の違いにより異なることが報告されている。そこで、エサ中のカロリー量を変化させた場合のバナジウムの示す中性脂肪増加抑制効果について検討を行った。
【方法】DBA/2マウス（オス，5週齢）を精製飼料（P-Diet，345.1 kcal/100g）群と高カロリー飼料（H-Diet，507.6 kcal/100g）群に分け、両群の動物にメタバナジン酸アンモニウムで調製したバナジウム水溶液（0，0.1，1，10 mg/L）を飲料水としてそれぞれ与えて5ヶ月間飼育した。実験終了後に動物を解剖して血液および各種臓器を採取した。血漿を用いて中性脂肪、総コレステロールを測定した。さらにバナジウム経口投与による毒性指標である小腸の過酸化脂質の測定を行った。
【結果】P-Dietを与え飼育した場合に比べ、H-Dietを与えた動物の体重は有意に上昇した。しかし、両群共にそれぞれの対照群（0 mg/L）と各種バナジウム濃度の水溶液を与えた群で体重に有意な差は認められなかった。総コレステロール値を測定したが、これらも体重の場合と同様にそれぞれの対照群と比べ、バナジウム投与群で有意な差は認められなかった。中性脂肪はP-Dietで飼育した動物において、バナジウムの投与により対照群に比べ有意に減少することが認められた。しかし、H-Dietで飼育した動物では中性脂肪の抑制作用は認められなかった。小腸の過酸化脂質を測定した結果、P-Dietを与えた動物では10 mg/Lのバナジウム投与により上昇したが、H-Dietで飼育した動物では1ならびに10 mg/Lのバナジウム投与で上昇した。これらの結果から、バナジウムの長期投与によって示された中性脂肪の増加抑制作用は、H-Dietで飼育した動物では認められなく、バナジウムによる毒性も低濃度によって起こることが示された。

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【目的】フタル酸エステルは、可塑剤としてプラスチックなどに含まれるエステルであり、発がん性や生殖毒性などが指摘されている。妊娠マウスにフタル酸エステルを投与すると、胎児の脳発生に障害が引き起こされ、成長してからの行動や記憶に異常が現れることが知られている。一方、母体に対してのフタル酸エステルの作用は今のところほとんどわかっていない。そこで我々は、フタル酸エステルが母体にどのような影響を及ぼすかを検討した。
【方法】妊娠雌マウスにフタル酸ビス（２－エチルヘキシル）（DEHP），またはビスフェノールA（BPA）を７日間経口投与し、妊娠7日目もしくは10日目に各臓器を採取した。それぞれの臓器からRNAを抽出し、骨形成因子（BMP）ファミリーのサイトカインの発現をreal time RT-PCRで検討した。
【結果・考察】DEHPの投与は、卵巣及び膣におけるBMP4の発現量を増加させた。一方、BMP15の発現は、DEHP投与により抑制された。BPA投与群では、BMP15の発現量低下は観察されたものの、BMP4の発現上昇は見られなかった。これらのことから、DEHPはBMP4, BMP15の発現を制御するが、そのシグナルはエストロゲン受容体を介するものと介さないものの両者がある可能性が示唆された。

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　ビスフェノールA （BPA）や代替ビスフェノール類（BPs）は、ポリカーボネート製プラスチックの製造やエポキシ樹脂の原料として様々な用途で利用されてきた。しかしながら、BPsはエストロゲン受容体を介して内分泌攪乱作用を引き起こすことが明らかにされた。さらに、低濃度のBPAが中枢神経系に対する毒性を引き起こすことが明らかにされ、国内外でBPAによるリスクの再評価や規制が実施されてきた。近年の再評価の結果、BPAのヒトに対するリスクは低いと結論されたものの、環境生物に対するリスクについては不明な点が多い。そこで本研究では、ゼブラフィッシュを用いて多様なBPsのエストロゲン様作用を評価した。ゼブラフィッシュ胚にBPsを水性曝露し、全胚におけるシトクロムP450 19A1b (CYP19A1b) mRNA発現量を測定した。また、分子シミュレーションソフトを用いてゼブラフィッシュエストロゲン受容体 (ERs) の3Dホモロジーモデルを構築し、BPsとERsの結合状態をin silicoでシミュレーションした。曝露実験の結果、評価したほぼすべてのBPsが濃度依存的にCYP19A1b mRNA発現を誘導した。BPs誘導性のCYP19A1b発現は、ER拮抗薬との共処置で有意に抑制された。各BPsについて、in silicoシミュレーションにより算出したERαとの相互作用エネルギーは、in vivoにおけるCYP19A1b誘導能（EC₅₀）と有意な正の相関関係を示し、エネルギー値が低い物質ほどEC₅₀も低い値となる傾向が認められた。一方、ERβ1およびERβ2とBPsの相互作用エネルギーとEC₅₀との間には有意な相関関係は認められなかった。本研究の結果は、多様なBPsがin vivoでゼブラフィッシュERを介してCYP19A1bを発現誘導すること、ならびにBPAと同等もしくはBPAよりも高いエストロゲン活性を有する代替BPsが存在することを示している。さらに、in silico シミュレーションによって未試験の化学物質のエストロゲン活性を評価できる可能性が示唆された。

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有機リン系難燃剤 (OPFRs) は、臭素系難燃剤の代替物として世界中で使用が増加している。OPFRsは揮発性が高く室内空気汚染物質として問題視され、化学物質過敏症との関連性も疑われている。OPFRsは一般に環境残留性および哺乳類に対する毒性は低いことが古くから知られていたが、最近の研究では魚類や鳥類などの野生生物からOPFRsを検出した報告例や、魚類胚に対する毒性を明らかにした報告例も散見される。さらに、in vitroレポーターアッセイ系において、一部のOPFRsは親化合物よりも代謝産物でエストロゲン活性が高いことも報告されている。そこで本研究では、ゼブラフィッシュ胚を用いて、多様なOPFRsおよびその代謝物の毒性影響を評価することを試みた。受精後72時間のゼブラフィッシュ胚にtriphenyl phosphate (TPhP)、tricresyl phosphate (TCP)、tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP)、tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) をそれぞれ水性曝露し、受精後96時間における発生毒性を評価した。さらに、TPhPの主要代謝物である4-hydroxylphenyl diphenyl phosphate (HO-p-TPHP)、diphenyl phosphate (DPHP)、4-hydroxylphenyl phenyl phosphate (HO-DPHP) を同様に水性曝露し、発生毒性を評価した。OPFRsの親化合物を用いた曝露試験の結果、TPhP、TCP、TDCPPは10 µMで全身血流の低下や心臓周囲浮腫を誘発した。これに対し、TCEPでは30 µMにおいても毒性は認められなかった。さらに、TPhPのみ体躯の矮小が認められた。TPhPの主要代謝物を用いた曝露試験では、HO-p-TPHPのみ10 µMで心血管毒性を示した。興味深いことに、TPhPでみられた体躯の矮小は、HO-p-TPHPでは認められなかった。以上の結果より、多様なOPFRsがゼブラフィッシュ胚に対して心血管毒性を引き起こすことや、OPFRsの代謝物にも同様の発生毒性を引き起こす物質が存在することが示唆された。

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【目的】精子形成におけるカドミウムの毒性や亜鉛機能の分子基盤はほとんど明らかになっていない。本研究は、亜鉛応答性転写因子MTF-1が精巣においては精母細胞に選択的に発現していることに着目し、MTF-1により包括制御される遺伝子群を精母細胞において明らかにすることによって、精子形成における重金属作用の分子基盤の一端を体系的に解明することを目的とした。
【方法】亜鉛またはカドミウム存在下または非存在下で培養した精巣由来である4種類の樹立細胞株（GC-1(spg)、GC-2(spd)、TM3、TM4）から得たtotal RNAについてDNAマイクロアレイ解析を行い、重金属依存的に発現変動する遺伝子を調べた。さらに精巣由来の上記細胞株の中でMTF-1が高発現しているGC-2(spd)細胞を用いてMTF-1をノックダウンし、同様のマイクロアレイ解析を行った。
【結果・考察】マイクロアレイ解析の結果、精母細胞由来GC-2(spd)細胞において亜鉛依存的に高度に発現促進あるいは抑制される遺伝子群が存在した。GC-2(spd)細胞におけるこれら遺伝子の発現パターンは、他の3種の精巣細胞におけるものとは大きく異なっており、GC-2(spd)細胞に特徴的に見られるものであった。発現促進される遺伝子の中には、MTF-1の制御下にあることが確立されているMT遺伝子などが含まれており、qPCRでも亜鉛依存的な遺伝子発現の変化を確認することができた。さらにGC-2(spd)細胞株において、亜鉛添加条件でMTF-1のノックアウトに伴って有意に発現変動する遺伝子を解析し、MTF-1による発現促進のみならず発現抑制と関連がある遺伝子の存在を確認した。本研究ではこれらの中から重金属とMTF-1の両方が発現抑制に関与することが示唆された遺伝子についてクローズアップし、解析した結果を報告する。

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　In 2014, the International Agency for Research on Cancer sounded an international alarm concerning the risk of 1,2-dichloropropane (1,2-DCP) as a carcinogenic industrial product due to the development of occupational cholangiocarcinoma. Although the biological basis for 1,2-DCP-related cholangiocarcinoma remains unclear, by using 1,2-DCP-administered animal models, we have previously found biliary excretion of potentially oncogenic metabolites consisting of glutathione (GSH)-conjugated forms of 1,2-DCP (GS-DCPs) (1); however, the GS-DCP-production pathway remains to be elucidated.
　In the present study, we examined the in vitro reactivity of GSH with 1,2-DCP under physiological pH conditions by untargeted metabolomics approach, and compared it to reactions with dichloromethane (DCM), the other putative substance responsible for occupational cholangiocarcinoma. Our results revealed that 1,2-DCP was spontaneously conjugated with GSH, whereas the similar conjugation was hardly detected between DCM and GSH. In addition, glutathione S-transferase theta 1 (GSTT1) exhibited less effect on the 1,2-DCP reaction as compared with that observed for DCM. Although GSTT1-mediated bioactivation of dihaloalkanes could be a plausible explanation for the production of reactive metabolites related to carcinogenesis based on previous studies, this catalytic pathway might not mainly contribute to 1,2-DCP-related occupational cholangiocarcinoma. Our findings would enhance the understanding of 1,2-DCP-related human health risk and dihaloalkane metabolism.
(1) Toyoda et al., Sci Rep. 6:24586, 2016.

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【目的】メチル水銀は水俣病の原因物質であり，知覚障害や運動失調，感覚神経障害など様々な神経障害を引き起こすことが知られている。メチル水銀による神経障害発現機構に関する研究は主に中枢神経でなされているが，末梢神経障害の発現機構はほとんど研究されていない。本研究では，メチル水銀投与により作製した水俣病モデルラットから末梢神経である後根神経節（DRG），感覚神経線維及び運動神経線維を摘出し，各神経組織の形態観察並びにメチル水銀によって変動する遺伝子群について検討した。
【方法】9週齢のWistar Rat(♂)を用いて，2 mg/mlに調製した塩化メチル水銀水溶液を胃ゾンデで6.7 mg/kg/dayとなるように経胃投与した。5日間投与2日間未投与のサイクルで1週間及び2週間投与し，水俣病モデルラットを作製した。未投与群は自由飲水とした。投与開始1週間後及び2週間後に潅流固定し，脊髄腰部L1-L5のDRG，感覚神経線維及び運動神経線維を摘出し凍結標本を作成した後，種々抗体により免疫染色を行った。遺伝子発現解析は投与開始1週間及び2週間後のDRGよりtotal RNAを抽出した後，DNAマイクロアレイおよびReal-Time PCR法により行った。
【結果・考察】メチル水銀投与2週間後のラットは，歩行失調，後肢交差及び体重減少が認められた。投与開始2週間後の感覚神経線維の軸索は，未投与群に比べ損傷が多く見られたが，運動神経線維の軸索は影響を受けなかった。また2週間後のDRGでは大型の神経細胞が選択的に脱落することが観察された。DNAマイクロアレイにより統計学的に有意な遺伝子変動を調べたところ，投与開始1週間後は約1400個，2週間後は約14000個の遺伝子が変動することが示された。今後変動している遺伝子群について詳細なクラスター解析を行い，メチル水銀による感覚神経障害メカニズムに迫る。

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【目的】カドミウムによる血管内皮細胞傷害は，動脈硬化症などの血管病変の発症や進展に関わるとされているが，カドミウムによる血管内皮細胞の細胞死誘導機構は完全には解明されていない。本研究では，ヒト大動脈由来血管内皮細胞（human aortic endothelial cells：HAEC）を用い，カドミウムにより誘発される細胞死様式について検討を行った。
【方法】HAECをカドミウムを含むHuMedia EG2培地（2％牛胎仔血清含有）で24時間培養した後，Cell counting kit-8 assayによって細胞生存率を測定した。また，カドミウム処理したHAECをAnnexin-V-FITCおよびPropidium Iodideで二重染色し，フローサイトメトリー解析を行い，アポトーシス細胞およびネクローシス細胞を検出した。
【結果・考察】HAECをカドミウム（50および100 µM）で処理したところ，おもにアポトーシス様細胞が認められた。さらに高濃度のカドミウム処理では，おもにネクローシス様細胞が多く検出された。また，カドミウム処理による細胞生存率の低下は，アポトーシス誘導に関わるカスパーゼの阻害剤であるzVAD-FMKによって有意に回復した。次に，プログラム化されたネクローシス（ネクロプトーシス）の関与を検討したところ，カドミウム処理によってネクロプトーシスの指標の一つであるMLKLのリン酸化の促進が認められた。また，ネクロプトーシス阻害剤であるNecrostatin-1処理またはネクロプトーシス関連因子（RIP1およびRIP3）のノックダウンによってカドミウムによる細胞生存率の低下が部分的ではあるが軽減された。以上の結果から，カドミウムによって誘導されるHAECの細胞死には，アポトーシスおよびネクローシスが関与することが示されると共に，ネクローシスによるHAECの細胞死の一部に，ネクロプトーシスが関与することが示唆された。

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【目的】環境中に幅広く存在する重金属のカドミウムは，血管内皮細胞の傷害や機能障害を通じて動脈硬化症などの血管病変の発症に関与するとされているが，カドミウムによる血管内皮細胞傷害メカニズムは完全には解明されていない。一方，核や細胞表面に存在する多機能性タンパク質であるヌクレオリンが，増殖シグナル経路の調節を介して血管内皮細胞層の恒常性維持に関わることが示唆されている。本研究では，カドミウムの血管内皮細胞毒性発現にヌクレオリンが関与する可能性を考え，血管内皮細胞のヌクレオリン発現におけるカドミウムの影響並びにカドミウム毒性におけるヌクレオリンの関与について検討した。
【方法】コンフルエントまで培養したウシ大動脈由来血管内皮細胞を無血清培地中でカドミウム処理した後，形態学的観察及び乳酸脱水素酵素（LDH）活性測定によって細胞毒性を評価した。ヌクレオリンのmRNAレベルはreal-time PCR法，タンパク質レベルはWestern blot法によって測定した。
【結果および考察】血管内皮細胞をカドミウム（1, 2, 5 及び10 µM）存在下で48時間培養したところ，カドミウム濃度依存的に細胞間の空隙が増大し，また，細胞層から培地中に逸脱したLDHの活性を有意に上昇することが確認された。次に，カドミウムで3～24時間処理した血管内皮細胞におけるヌクレオリンの発現レベルを調べたところ，いずれの処理濃度，処理時間においてもヌクレオリンのmRNA及びタンパク質の発現レベルの有意な変化は認められなかった。一方，RNA干渉法を用いて血管内皮細胞のヌクレオリンをノックダウンしたところ，カドミウムの細胞毒性が増強することが明らかになった。以上のことより，カドミウムは血管内皮細胞のヌクレオリン発現レベルには影響を与えないが，ヌクレオリンはカドミウムの細胞毒性に対して防御的な作用を有している可能性が考えられる。

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【目的】我々は，真核生物モデルとして有用な出芽酵母を用いて，ヒ素化合物の１つである亜ヒ酸の毒性発現機構の解明に取り組んでいる。これまでの検討により，欠損によって酵母の亜ヒ酸感受性を亢進させる細胞内因子として，糖代謝に関わる転写因子Mig1を同定している。ヒトにおいてはMig1と相同性が高い転写因子としてWilms tumor gene（WT1）が知られているが，亜ヒ酸毒性との関係性については検討されていない。本研究では，酵母及びヒト子宮頸癌由来HeLa細胞を用いて，亜ヒ酸毒性発現機構における転写因子Mig1/WT1の役割について検討した。
【方法】酵母及びヒト子宮頸癌由来HeLa細胞における各遺伝子の発現レベルは，real-time PCR法によって測定した。
【結果および考察】我々は，亜ヒ酸が酵母のペントースリン酸経路関連因子の発現を抑制することによって核酸合成を低下させ，その結果として細胞毒性を発現することも明らかにしている。そこで，Mig1とペントースリン酸経路との関係性を調べたところ，Mig1の欠損がペントースリン酸経路関連遺伝子の発現レベルを有意に低下させることが明らかとなった。亜ヒ酸がMig1を不活性化することも確認していることから，亜ヒ酸はMig1依存的な転写機構を抑制することによって，ペントースリン酸経路を抑制して，細胞毒性を発現している可能性が考えられる。次に，ヒト子宮頸癌由来HeLa細胞を亜ヒ酸で処理したところ，亜ヒ酸の処理濃度依存的にWT1の標的遺伝子（GAS1，QPRT）の発現レベルが低下することが判明した。また，亜ヒ酸処理によってペントースリン酸経路関連因子（RPIA，TKT）の発現レベルも低下することが確認された。したがって，ヒト細胞においても亜ヒ酸が転写因子WT1の活性低下及びペントースリン酸経路の抑制を引き起こすと考えられる。現在，ヒト細胞におけるWT1とペントースリン酸経路との関係性について検討中である。

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【目的】プロテオグリカンはコアタンパク質にグリコサミノグリカン糖鎖が結合した複合糖質であり，血管内腔において抗血栓特性に寄与するほか，動脈硬化などの心血管疾患の進展・防御に深く関わる因子として知られる。血管内腔を単層で覆う内皮細胞が産生するプロテオグリカン分子種は内皮細胞機能を調節するので，それら分子種の発現調節機構を解析するツールの創出は重要である。当研究室では，Nrf2を活性化し（Fujie T et al., Int J Mol Sci., 17, E1381, 2016），メタロチオネインを誘導する（Fujie et al., J. Toxicol. Sci., 41, 217-224, 2016）銅錯体copper diethyldithiocarbamate（Cu10）を見出している。本研究の目的は，内皮細胞のプロテオグリカン分子種の発現調節をCu10を用いて解析することである。【方法】ウシ大動脈内皮細胞にCu10を処理し，遺伝子発現は定量的RT-PCR，タンパク質発現はwestern blot法により評価した。【結果および考察】Cu10の処理濃度および時間依存的なシンデカン-4の転写誘導が認められた。Cu10を構成する銅および配位子は単独ではこのような作用を示さなかった。Cu10の中心金属または配位子の置換体を用いた解析から，シンデカン-4の転写誘導はCu10分子に特異的な作用であることが示唆された。一方，内皮細胞においてCu10は時間依存的なp38 MAPKのリン酸化を亢進させた。Cu10によるシンデカン-4の転写誘導はp38 MAPK阻害剤によって有意に減弱した。Cu10はNrf2を活性化するが，Nrf2を発現抑制してもCu10によるシンデカン-1の転写抑制に影響を及ぼさなかった。以上より，銅錯体Cu10が内皮細胞において，p38 MAPKの活性化を介してシンデカン-4の転写を誘導することが明らかになった。

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【目的】血管の内腔を覆う内皮細胞の傷害は，心血管疾患の誘発因子となるため，傷害を受けた内皮細胞は速やかに修復されることが望ましい。プロテオグリカンは，コアタンパク質に高度に硫酸化された糖鎖が結合した構造をもち，中でも細胞膜貫通型のシンデカン-4（SDC4）は，内皮細胞の防御応答に寄与する。亜鉛は傷害内皮細胞層の修復を促す金属元素であるが，近年，有機金属化合物がその多様な反応性より新たな生体機能解析ツールとして利用される機運が高まっている。そこで本研究では，内皮細胞のSDC4を発現調節する亜鉛錯体の探索し，その調節機構の解明を試みた。【方法】ウシ大動脈内皮細胞を用い，mRNA発現は定量的RT-PCR，タンパク質発現はwestern blot法により検討した。遺伝子導入はリポフェクション法で行い，蛍光基質発現法にて酵素活性を測定した。【結果・考察】1,10-phenanthroline（o-Phen）骨格をもつ亜鉛錯体（Zn-Phen）がSDC4の発現を強く誘導した。無機亜鉛による発現誘導は認められなかったが，o-Phenは濃度・時間依存的にSDC4の発現を誘導し，その強さはo-Phen>Zn-Phenであった。また，o-PhenとZn-Phenは低酸素誘導因子-1α（HIF-1α）の発現を増強させた。HIF-1αまたは，その補因子HIF-1βの発現抑制下では，o-PhenとZn-PhenによるSDC4の発現誘導が抑制されたが，HIF-1αのアイソフォームであるHIF-2αの発現抑制下では同様の傾向は認められなかった。加えて，o-PhenおよびZn-Phenの処理下ではHIF-αの分解に寄与するPHD2活性の減弱が認められ，本機構を介したHIF-1α/β経路特異的なSDC4の発現誘導が明らかとなった。本研究は，有機金属化合物を用いて内皮細胞SDC4の新しい発現調節機構を見出すと同時に，配位子への金属の導入により生物活性を調節できることを示した例である。

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【背景・目的】血管内皮細胞は血管の内腔を単層で覆う細胞種である。我々はこれまでに，細胞密度が低い血管内皮細胞において，鉛がヘパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種パールカンの発現抑制を通じて増殖を抑制することを報告している（Toxicology, 133, 147-157, 1999; Toxicology, 133, 159-169, 1999）。しかしながら，鉛によるパールカン発現抑制機構は不明である。本研究の目的は，鉛によるパールカン発現抑制の分子機構を解明することである。【方法】ウシ大動脈内皮細胞を10,000 cells/cm²に播種し，24時間後に硝酸鉛を曝露した。遺伝子発現は定量的 RT-PCR法，タンパク質発現はwestern blot法を用いた。prostaglandin I₂（PGI₂）はELISA法によって測定した。【結果・考察】鉛の曝露濃度および時間依存的なパールカンの発現抑制を確認した。当研究室はcyclic AMP（cAMP）が血管内皮細胞のパールカン発現を抑制することを見出している。そこで細胞内cAMPを増加させるadenylyl cyclaseおよびcyclooxygenase-2の阻害剤（SQ22536およびNS398）ならびにcAMPにより活性化されるprotein kinase Aの阻害剤（H89）を前処理したところ，いずれの阻害剤も処理濃度依存的に鉛によるパールカンの発現抑制を回復させた。また，鉛はadenylyl cyclaseを活性化するPGI₂の培地への放出量を増加させた。さらに，鉛によりPGI₂産生酵素COX-2の発現上昇も認められた。以上の結果は，鉛による血管内皮細胞のパールカン発現抑制機構に，COX-2/cAMP/PKA経路が介在することを示している。

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【目的】カドミウムは米などの食品中に含まれる環境汚染物質であり，様々な器官に対して毒性を発揮するが，その器官毒性は特に血管内皮細胞毒性に修飾されると考えられる。我々は，細胞膜に局在する金属輸送体ZIP8が内皮細胞へのカドミウム輸送に関与することを見出している。そのためZIP8の発現に対するカドミウムの作用とそのメカニズムを明らかにすることは，カドミウムの血管内皮細胞毒性の理解に重要である。本研究の目的は，カドミウムによる血管内皮細胞のZIP8の発現誘導およびそのメカニズムを明らかにすることである。【方法】ウシ大動脈内皮細胞に塩化カドミウムを処理し，遺伝子発現は定量的RT-PCR法で，タンパク質発現はウエスタンブロット法を用いた。siRNAの導入はリポフェクション法を用いた。カドミウムの細胞内蓄積量はICP-MSにより測定した。【結果および考察】血管内皮細胞にカドミウムを曝露すると，ZIP8タンパク質の発現上昇が認められた。また，ZIP8 mRNAもカドミウムにより発現上昇した。内皮細胞におけるカドミウムによるその他のZIPファミリーの発現への作用を検討したところ，ZIP8 mRNAの発現が特に顕著に発現上昇したことから，血管内皮細胞においてZIP8はカドミウムの細胞内輸送に関わる重要な因子であることが分かった。次にZIP8転写開始点の上流にNF-κB結合配列が存在するため，カドミウムによるZIP8の発現誘導に対する関与を検討した。内皮細胞において，カドミウムは処理濃度依存的にIκBのリン酸化を増強させた。またNF-κB発現抑制細胞では，カドミウムによるZIP8の誘導が消失した。以上の結果から，内皮細胞においてカドミウムによりZIP8の発現が特異的に上昇すること，またその上昇には転写因子NF-κBが関与することが示された。

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【目的】血管内皮細胞は，血管のトーヌスや血液凝固線溶系を調節するだけでなく，血液と血管内皮下組織を隔てる障壁としても機能している。内皮細胞の増殖を促進する細胞増殖因子はいくつか知られているが，同様の活性を有する低分子量化合物は知られていない。我々は，無機亜鉛が内皮細胞の増殖活性を上昇させることを見出しているが，無機亜鉛の非特異的作用のため解析が難しくそのメカニズムの解明に至っていない。有機-無機ハイブリッド分子は有機化合物と無機化合物の特性を併せ持ち，特異な生物活性をもたらすことが可能である。本研究の目的は，構築した亜鉛金属錯体ライブラリーの中から内皮細胞の増殖を制御する化合物を探索することである。
【方法】32種の亜鉛錯体から成る亜鉛錯体ライブラリーを構築した。ウシ大動脈血管内皮細胞の増殖促進活性は酸不溶性画分への[³H]Thymidineの取り込みにより評価した。細胞傷害性は形態学的観察およびLDH逸脱量により評価し，細胞内金属蓄積量にはICP-MSを用いた。
【結果および考察】ライブラリーより細胞傷害性がなく強力な増殖促進作用を持つ亜鉛錯体としてZn-12[Zn(2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline)Cl2]を見出した。内皮細胞増殖促進活性は無機亜鉛よりも顕著に強く，配位子では認められなかった。Zn-12および無機亜鉛の間に，亜鉛の細胞内蓄積量の有意な差は認められなかった。Zn-12の増殖促進活性はFGF-2およびVEGFよりも強く，一部は内因性FGF-2の活性に依存していることが示唆された。強力な内皮細胞増殖促進活性を有する低分子量化合物はこれまでになく，本研究は有機-無機ハイブリッド分子の新たな可能性を示すものである。

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【目的】血管平滑筋細胞は，血管の中膜を構成するcell typeである。血管平滑筋細胞の機能障害は，様々な血管病変の基礎疾患として知られる動脈硬化病変の進展過程に深く関わっているので，血管平滑筋細胞の防御機構に関する理解は重要である。メタロチオネイン（MT）は，多様な機能を有する生体防御タンパク質である。MTの誘導機構は転写因子MTF-1の活性化が不可欠であること以外の詳細は不明である。これまでに我々は，銅錯体Cu(edtc)₂（Cu10）を活用し，内皮細胞のMT誘導機構を明らかにしてきている。本研究では，Cu10による血管平滑筋細胞のMT誘導機構を解析した。【方法】培養ウシ大動脈平滑筋細胞をCu10で処理し，MT-1/2タンパク質の発現はWestern blot法により評価した。MT-1A，MT-1E，MT-2A mRNA発現はreal-time RT-PCR法により解析した。siRNAはリポフェクション法により導入した。【結果・考察】血管平滑筋細胞においてもCu10の処理濃度および時間に依存してMT-1/2タンパク質発現の上昇が認められた。このとき，Cu10により全てのMTアイソフォーム mRNA発現が上昇していた。MTF-1をノックダウンした平滑筋細胞をCu10で処理したとき，Cu10によるMT誘導は抑制された。しかしながら，Nrf2をノックダウンしたとき，Cu10による血管平滑筋細胞のMTは抑制されなかった。以上の結果より，Cu10は内皮細胞だけでなく血管平滑筋細胞のMTも誘導すること，さらにその誘導はMTF-1-MRE経路を介在するが，Nrf2-ARE経路を介在しないことが示唆された。我々はこれまでに，内皮細胞のMT-1誘導はNrf2-ARE経路によって制御されることを明らかにしており，この結果は血管平滑筋細胞が内皮細胞と異なるMT誘導機構を備えている可能性を示している。

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【目的】メタロチオネイン（MT）は，システインリッチな低分子量タンパク質である。MTは重金属の捕捉や活性酸素種の消去など多様な機能を有するが，その誘導機構には不明な点が多く残されている。これまでに我々は，ジチオカルバメート銅錯体Cu(edtc)₂を活用し内皮細胞のMT誘導機構を明らかにしてきている。しかしながら，Cu(edtc)₂の内皮細胞以外のcell typeにおけるMT誘導は解析されていない。本研究では，edtc錯体による内皮および血管平滑筋細胞のMT誘導を比較した。【方法】コンフルエントまで培養したウシ大動脈内皮および平滑筋細胞をCu(edtc)₂，Zn(edtc)₂，およびNi(edtc)₂で処理し，MT-1/2タンパク質の発現は，Western blot法により評価した。MT-1A，MT-1E，およびMT-2A mRNA発現はreal-time RT-PCR法によりそれぞれ解析した。【結果・考察】内皮および血管平滑筋細胞では，Cu(edtc)₂の処理濃度および時間に依存してMT-1/2タンパク質発現の上昇が認められた。このとき，MT-1A，MT-1EおよびMT-2A mRNA発現も上昇していた。同様の実験をZn(edtc)₂およびNi(edtc)₂についても解析したところ，Zn(edtc)₂の処理により内皮細胞のMTは誘導されたが，血管平滑筋細胞のMTは誘導されなかった。一方，Ni(edtc)₂で処理したとき，内皮および血管平滑筋細胞のMTの誘導は認められなかった。以上より，Cu(edtc)₂は内皮細胞だけでなく血管平滑筋細胞のMTも誘導するのに対し，Zn(edtc)₂は内皮細胞選択的にMTを誘導することが明らかになった。このことは，導入する金属によってedtc錯体によるMT誘導のcell type特異性を制御できることを示している。Zn(edtc)₂は内皮細胞特異的なMT誘導を解析するツールとして有用かもしれない。

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【目的】我々は、炎症性サイトカインTNF-α (tumor necrosis factor-α) の発現がメチル水銀を投与したマウス脳内において特異的に誘導されることを見出した。そこで本研究では、メチル水銀によるTNF-α発現誘導に関与する分子機構について検討した。
【結果・考察】これまでに我々は、メチル水銀を投与したマウスの脳の、ミクログリア細胞中でTNF-αが発現誘導されることを見出している。そこで、マウス由来ミクログリア細胞株であるBV2細胞を用いて、メチル水銀がTNF-αmRNAレベルに与える影響を検討したところ、マウスの脳内と同様にメチル水銀によるTNF-αの発現誘導が認められた。この発現誘導は、転写阻害剤であるアクチノマイシンDで前処理したところ、ほとんど認められなくなったことから、何らかの転写因子の活性化が関与していると考えられる。TNF-αの発現誘導にはJNK、ERKおよびp38といったMAPキナーゼが関与することが知られている。これらの経路はメチル水銀処理によっていずれも活性化されたが、各阻害剤で前処理したところ、p38阻害剤のみがメチル水銀によるTNF-αの発現誘導を抑制した。TNF-αの発現誘導に関与する主な転写因子としてNF-ｋBおよび AP-1が知られており、両転写因子はメチル水銀処理によって活性化されたが、NF-ｋB阻害剤で細胞を前処理してもメチル水銀によるTNF-αの発現誘導は依然と認められた。一方、AP-1阻害剤で前処理した際には、メチル水銀によるTNF-αの発現誘導の抑制が認められた。p38阻害剤の前処理によりメチル水銀によるAP-1の活性化が抑制されたことから、メチル水銀はp38のリン酸化を介してAP-1を活性化させることによってTNF-αを発現誘導していると考えられる。

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【背景・目的】我々は、マウス脳内および様々な培養細胞においてメチル水銀がTNF-αの発現を誘導し、この発現誘導にTNF-αの転写促進が主に関与していることを見出している。しかし、メチル水銀によるTNF-αの発現誘導に関わる詳細な分子機構はほとんど解明されていない。そこで本研究では、メチル水銀によるTNF-αの転写促進に関わるTNF-α遺伝子プロモーター領域の解析を行った。
【結果・考察】　TNF-α遺伝子転写開始点から上流-1173 bps～下流+130 bpsまでをプロモーター領域とし、この領域を段階的に欠損させた5種類のTNF-α遺伝子プロモータールシフェラーゼの変異体を作製した。なお、メチル水銀がルシフェラーゼ活性を直接阻害することが判明したため、本検討ではルシフェラーゼのmRNAレベルを転写活性化の指標とした。TNF-α遺伝子プロモータールシフェラーゼの変異体プラスミドを導入したHEK293細胞をメチル水銀で処理したところ、full lengthで認められたメチル水銀によるルシフェラーゼ mRNAレベルの増加が-1173～-900 bpsを欠損させることによって一部低下し、また、-70～-35 bpsを欠損させることによってさらに低下した。これら2つの領域に共通して結合する可能性のある転写因子をデータベースを用いて検索した結果、AP-1、Sp-1およびMZF1がそれに該当した。そこで、AP-1阻害剤 (T5224) がメチル水銀によるTNF-α遺伝子の転写促進に与える影響について検討したところ、メチル水銀によるluciferase mRNAレベルの増加が一部抑制された。このことから、メチル水銀によるTNF-α遺伝子の転写促進に転写因子としてAP-1が一部関与していると考えられる。

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【目的】 我々は、メチル水銀毒性の増強に関与する転写因子としてtmRT1を同定した。また、メチル水銀がTNFαの発現を誘導することも見出し、この誘導にtmRT1の活性化が重要な役割を果たしていることも明らかにしている。一方、転写因子の活性制御に他の蛋白質との複合体の形成が深く関与していることが知られている。本研究では、tmRT1と結合する蛋白質を検索し、その蛋白質がtmRT1の活性に与える影響について検討した。
【結果・考察】 HEK293細胞の核抽出物とリコンビナントGST-tmRT1を混合しGSHビーズを用いてプルダウンアッセイを行ったところ、複数の蛋白質がGST-tmRT1と結合していることが確認された。これらの蛋白質を質量分析法により解析したところ、その中にX-ray repair cross-complementing factor 6 (XRCC6) が含まれていた。XRCC6はXRCC5とヘテロ二量体を形成してDNA二本鎖切断の修復に関与することが知られている。そこで、tmRT1のN末端にMycタグを融合したMyc-tmRT1およびXRCC6のN末端にDDKタグを融合したXRCC6-DDKを発現するプラスミドを共に導入したHEK293細胞から得られた抽出物をDDK抗体を用いて免疫沈降したところ、両蛋白質間の結合が確認された。また、メチル水銀によるTNF-αの発現誘導の程度がXRCC6の発現を抑制させることによってさらに増加した。このことから、XRCC6はtmRT1と結合することによってメチル水銀によるTNF-αの発現誘導を抑制している可能性が考えられる。現在、メチル水銀によるTNF-αの発現誘導作用における両蛋白質の関わりについて検討中である。

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【目的】バングラデシュなどの東アジア諸地域では無機ヒ素を含む地下水の飲水による慢性ヒ素中毒が発生しており、本中毒により多臓器にがんが発生する。しかしながらヒ素化合物によるがんの発生機序に関してはよくわかっていない。一方、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰な活性化は細胞のがん化を誘発することが知られており、EGFRの活性化抑制因子としてユビキチンリガーゼのc-Cblが知られている。そこで本研究では、ヒ素化合物による発がん機序を明らかにすることを目的として、亜ヒ酸がc-Cblのユビキチンリガーゼ活性を阻害することで、EGFRの分解が抑制されるのではないかと仮説を立て研究を行った。
【方法】細胞：COS-7細胞、HEK293細胞、A549細胞を使用した。タンパク質発現：western blot法で検討した。遺伝子導入：polyfectを用いたlipofection法で導入した。
【結果】COS-7細胞にEGFR遺伝子とc-Cbl遺伝子を導入し、24時間後にEGFを添加（15、30、60分）した。その結果、c-Cblを導入していないCOS-7細胞ではEGF添加後のEGFR量に変化は無かったが、c-Cblを導入したCOS-7細胞ではEGFの添加によりEGFRのタンパク質量は顕著に減少した。この結果から、EGF依存的なEGFRの分解にc-Cblが関与していることがわかった。本システムに対し、亜ヒ酸の影響を検討した。EGFRとc-Cblの遺伝子を導入した12時間に、亜ヒ酸を添加し12時間さらに培養した。その後EGFを30分間添加した細胞を使用してEGF量を測定したところ、EGFによるEGFRの分解作用が亜ヒ酸により阻害された。現在、内在性のEGFR量が少ないHEK293細胞、c-Cbl量が少ないA549細胞に、c-CblおよびEGFRの安定的高発現細胞を樹立し、これらの細胞においてもEGF依存的なEGFRの分解を亜ヒ酸が抑制するかについて検討を進めている。

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【緒言】ヒト医薬品環境影響評価 (ERA)の最近の動向としては、厚労省ERAガイダンス発出、ICCM4で環境残留性医薬品の新規政策課題化、欧州製薬業界3団体のEco-Pharmaco-Stewardship (EPS)発表、EMAのERAガイドライン見直し、AMED研究班発足等が挙げられる。これらを踏まえ、製薬協会員各社の現状認識と将来像を問うアンケートを2016年12月に実施した。
【結果】回答39社 (内資29、外資10、回収率64%)のうち、自社単独欧米申請経験有は19社 (内資9、外資10)、ERA自社実施あるいは自社または開発パートナーによる委託の経験有は16社 (内資9、外資7、うち自社実施は外資3社のみ)であった。ERA専業担当者/部署有は7社 (全て外資)、ERA主管担当者/部署の最多は、内資は非臨床安全性担当部門、外資は環境安全衛生(EHS)担当部門だった。
国内ガイダンス発行意義は、欧米申請経験有の74%、経験無の95%が「一定の意義あり」または「非常に意義あり」と回答し、コンセプトペーパーとの位置付けは「適切である」が最も多かった。別途国内ガイダンスQ&Aの必要性は、欧米申請経験有の48%、経験無の95%が必要と答えた。日本ローカル開発品のERAは「今まで何もしていない」及び「今後はまだ決めていない」が最多だった。いずれかの時期にERAの業界自主行動基準が必要と考える企業が72%である一方、当局規制が必要と考える企業も67%あり、業界と当局の協働を望む声が多かった。ICHガイダンス必要時期は欧米申請経験有で「5～10年後」、経験無で「10年以上先」が最も多く、いずれかの時期にICH国際標準化が必要と考えた企業は79%にも及んだ。ICCMのSAICM 2020年目標や欧州EPSの認知度は各々18%及び36%といずれも低かった。ERAの経験に応じて担当部署の設置、理解度、求める情報、将来像等が異なる反面、経験に関係無く、大多数の方向性が一致する回答もあった。発表ではより詳細なデータや業界意見を紹介する。

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