Pharmaceutical R&D has played an extremely important role in improving human health, eradicating diseases, and in prolonging people’s lives. Discovering new medicines requires extensive collaborations among subject matter experts from various disciplines to advance molecules through the many stages of R&D assuring that the right targets and molecules are selected, and clinical development occurs in the appropriate patient population. Typically, it requires approximately 10 years to bring a molecule from benchtop to patients. However, special circumstances such as the emergence of SARS-CoV-2 at the end of 2019 (COVID-19) required the swift development of vaccines and drugs to address the pandemic in a timely manner. This success showcases the capability of modern molecular technologies and close collaborations among pharmaceutical industry, Regulators, Investigators, and patients to meet this challenge with the utmost speed and focus. The deep and diverse expertise from preclinical R&D disciplines were key in achieving these goals.

睡眠覚醒は中枢神経系を持つ動物種に普遍的な現象であるが、その機能と制御メカニズムは、いまだ謎に包まれている。覚醒系を司る神経ペプチド「オレキシン」の発見をひとつの契機として新しい睡眠学が展開され、近年では睡眠覚醒のスイッチングを実行する神経回路や伝達物質が解明されつつある。2014年には、内因性覚醒系を特異的に抑える新しいタイプの不眠症治療薬として、オレキシン受容体拮抗薬が上市された。また、覚醒障害ナルコレプシーの根本病因がオレキシンの欠乏であることが判明しており、オレキシン受容体作動薬はナルコレプシーの病因治療薬、さらには種々の原因による過剰な眠気を抑制する医薬となることが期待されている。 　

一方、睡眠覚醒調節の根本的な原理、つまり「眠気」（睡眠圧）の脳内での実体とはいったい何なのか、またそもそもなぜ睡眠が必要なのか等、睡眠学の基本課題は全く明らかになっていない。私たちはこのブラックボックスの本質に迫るべく、ランダムな突然変異を誘発したマウスを8,000匹以上作成し、脳波測定により睡眠覚醒異常を示す少数のマウスを選別して原因遺伝子変異を同定するという探索的な研究を行なってきた。このフォワード・ジェネティクス研究の進展により、睡眠覚醒制御メカニズムの中核を担うと考えられる複数の遺伝子の同定に成功し、現在その機能解析を進めている。フォワード・ジェネティクスによって同定されたSleepy変異マウスと断眠マウスの解析から、シナプス蛋白質の累積的リン酸化状態が睡眠圧の本態の一部である可能性が提示され、LKB1-SIK3-HDAC4/5が、睡眠圧を表現する分子パスウェイの一部であることが示された。本講演では、筑波大学WPI-IIISの私どもの研究室における睡眠覚醒の謎への探索的アプローチを紹介する。

私は2018年よりERATO池谷脳AI融合プロジェクトの代表を務め、脳研究に機械学習を導入した研究を展開しています。このプロジェクトでは「脳にAIを埋め込んだら何ができる、AIに脳を埋め込んだら何がおこる、脳をネット接続したら世界はどう見える、たくさんの脳を繋げたら心はどう変わる」といった、一見幼稚な疑問に、大真面目に取り組んでいます。たとえば、脳に情報センサー内蔵チップを移植することで、地磁気や血圧の変化などの本来感知できない環境や身体の情報を脳にフィードバックし、新たな知覚を得ることで脳の能力や行動パターンがどのように変化するかを調べています。また、脳が実際に感じているにもかかわらず、個体としては活用できていない脳内情報を、ＡＩで分析し、脳の機能を拡張しようと試みています。「脳は本当に最適化されているのだろうか」「まだ進化の余地はないだろうか」。いまだ謎にいどむ中途ですが、特別講演では、その時点での最先端の進捗をお話ししたいと思います。

誰もがより長く元気に活躍できる健康長寿社会を実現するためには、がんなどの重大疾病の克服や老化の抑制は重要な課題である。これらの課題に取り組むためには、がんの発生や老化の起点となる基本原理を明らかにし、そこに介入してこれらを予防するアプローチ、すなわち「先制医療」が有効と考えられる。我々の研究室では、がん・老化の未知の原理に迫るために、特徴的なモデル生物と最先端の解析技術を駆使した研究を進めている。最近では、小型魚類ゼブラフィッシュをモデルとしたイメージング解析により、動物組織が免疫細胞を介さずに前がん細胞を感知して排除する「新たながん抑制メカニズム」を発見し、さらに、このメカニズムの破綻によって初期腫瘍が生じる機序も見出した。また一方で、ヒト老化機構の理解を加速するために、脊椎動物の中で最短の寿命を持つターコイズキリフィッシュ（略称キリフィッシュ）を利用した老化機構高速解析系を独自に構築し、これを駆使して新たな“抗老化物質”の候補を見出しつつある。また、本セミナーでは、これら最新の成果とともに、ヒト先制医療への発展を視野に入れた我々の試みもご紹介したい。

哺乳類細胞や動物に外来遺伝子を発現させるためのベクターの開発は遺伝子機能を解析するためのツールであるばかりでなく、産業や医療への応用面でも重要な役割を果たしてきた。従来のトランスジェニック技術では、導入可能なDNAは通常数百kbが限界であり、1Mbを超える大きさを持つ遺伝子や遺伝子クラスターの導入は不可能であった。これらの問題を解決するために、巨大なヒト遺伝子、複数のヒト遺伝子を比較的安定な形で導入可能であるヒト人工染色体（HAC）およびマウス人工染色体(MAC)の開発を染色体工学技術を用いて行ってきた。これまでにヒトジストロフィン遺伝子(2.5Mb)、ヒト薬物代謝酵素遺伝子クラスター(1.5Mb) 、ヒト抗体遺伝子群（3.5Mb）等を上記HAC/MACベクターに搭載することに成功している。さらに、HAC/MACへ巨大遺伝子を搭載した、いわば「Designed Chromosome」をマウスやラットに導入することで「Designed Animal」を作製してきた。それらの動物を活用し、薬物動態研究、毒性研究、抗体医薬品シーズの作製等、に取り組んできた。さらに、「Designed Chromosome」を用いた「Designed Cell」による基礎研究から応用研究にも取り組んでいる。本発表では、これまで開発してきたHAC/MAC技術による創薬支援ツール（ヒト抗体遺伝子を保持する完全ヒト抗体産生動物、ヒト薬物代謝酵素を発現するモデルマウス・ラットや細胞など）と、ゲノム合成および人工染色体の融合技術について、生物・医学研究への活用も交えながら紹介する。

我が国でもアカデミア創薬への期待は高まっているが、大手製薬企業などが行っているのと同様の手法で化合物スクリーニングを行っても、研究チームの規模が小さく開発資金に乏しいアカデミアが、画期的新薬を見つけ開発することは困難である。それゆえ我々は、異常RNAスプライシングなど、標的とする疾患の病態を反映する細胞評価系を独自に構築し、従来より遥かに効率良く有望な化合物を見出してきた。また探索途上で見つかった興味深い表現型を示す化合物を手掛かりとして、これまで未知であった疾患の病態や分子機構を解明する新しい研究手法も確立した。RNAバイオロジーとケミカルバイオロジーの解析手法を駆使して、表現型アッセイで見出されたヒット化合物の分子標的を特定し、遺伝病、ウイルス感染症、悪性腫瘍、疼痛など幅広い領域において、画期的な”魔法の弾丸”なり得る化合物を見出している。さらに我々はAIを駆使して全ゲノム配列情報を解析し、従来の薬剤では治療が困難であった疾患に対する治療薬候補物質を続々と見出している。特に我々の低分子化合物は、深部イントロン変異に起因する偽エクソン型スプライシング異常を抑制する活性があることを、NEMO異常症、嚢胞性線維症、心ファブリ病等の偽エクソン変異モデルの解析から見出した。我々の開発してきたスプライシング制御化合物とAIによる治療対象患者抽出戦略とを組み合わせることで、遺伝病の精密先制医療への道を拓く可能性があるのみならず、スプライシング制御化合物をCOVID-19の重症化を防ぐ自然免疫賦活化剤や、がん免疫チェックポイント療法増強剤として応用可能であることが判明している。また上記の研究途上に、種々のウイルスRNA合成を特異的に阻害する画期的な抗ウイルス薬FIT-039を見出し、疣贅や子宮頸癌に対する医師主導第1/2相臨床試験が進行中で、新型コロナウイルスへの効果も検討されている。

　生命科学で汎用されているC57BL/6などの近交系マウス系統のゲノムは、異なる亜種由来のゲノム配列から構成されるモザイク構造を持つ。そのゲノムの大部分は、西ヨーロッパ産亜種Musculus musculus domesticusに由来し、残りの配列（全ゲノムの6〜7％）は主に日本産亜種M. m. molossinusに由来する。詳細な比較ゲノム解析により、現存する日本産愛玩用マウス由来のJF1/Ms系統の祖先が近交系マウスにおけるM. m. molossinusゲノムの起源となっていることがわかっている。古い文献の調査により、江戸時代末期に日本で愛玩されていたJF1/Ms系統の祖先が欧州にわたり、そこで西ヨーロッパ産亜種由来のマウスと交配して得られた繁殖コロニーから樹立されたのが現在の近交系マウスであると考えられる。異なった亜種由来のマウスが混じることによって、さまざまな分野で利用されている近交系マウス間のゲノムや表現型の多様性が生み出されており、マウスを研究材料とする場合には、その点に留意した研究計画を立てる必要がある。　

　同様のゲノムのモザイク構造は、現代人のゲノムにも見られ、ネアンデルタール人やデニソワ人のゲノムのごく一部がホモ・サピエンスのゲノムの中に散在していることが分かっている。興味深いことに、ヒトでもマウスでも、モザイク状のゲノム構造はランダムに形成されたものではなく、何らかの遺伝的制約の下で構築された可能性が考えられる。実験用マウスの近交系統やJF1/Ms系統は、哺乳類のモザイクゲノムの形成に寄与した遺伝的制約を明らかにするユニークな研究材料となるかもしれない。

ペルフロロ有機フッ素化合（Perfluoroalkyl substances PFAS）は、分子内に過フッ素化メチル（CF3-）あるいは過フッ素化メチレン(-CF2-)を1つでも含む化合物であり約5000種類ほどが知られている。PFASは化学的に極めて安定であり、テフロン加工の溶媒、泡消火剤や界面活性剤、パーソナルケア商品の基剤などとして多様な用途で使用されてきた。環境中で難分解性のため、代表的PFASであるPFOS, PFOA, PFHxSはPOPｓとしてStockholm 条約に登録されている。これら3種のPFASは、ヒトにおいて生物学的半減期は2－6年と極めて長く、生体内での代謝は受けない。また脂質代謝異常、低出生体重児、ワクチン接種効果の減弱、腎細胞がんなど多岐にわたる健康影響のエビデンスがあるとされる。本特別特別講演では、近年明らかになってきた全国のPFASの環境汚染の実態を紹介し、比較的毒性情報が多い代表的PFASであるPFOSとPFOAを、我々の毒性研究を中心に取り上げる。①生物学的半減が長い理由が注目されてきたがそのメカニズムとして腸肝循環によること、②α型ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPARα：peroxisome proliferator activated receptor alpha）による肝毒性の修飾、③トランスポータの候補分子、④NaおよびCaチャンネルへの影響などを、基本的毒性情報として紹介する。最後に、疫学研究を補うトランスポータの特定や免疫毒性のメカニズムの解明、発がん性のメカニズムの精緻化など、今後必要となる毒性学的研究について述べたい。

細胞外小胞 (EV) は、再生療法や免疫制御療法、薬物送達システム (DDS) などの治療法のツールとして開発されています。特に、いくつかの幹細胞の中でも、間葉系幹細胞由来の EV (MSC-EV) は、肝線維症、肺感染症、腎障害など、さまざまなヒト疾患の治療薬として注目されています。このような幹細胞由来 EV の治療薬の開発では、EV 治療薬の安全性を確保するための非臨床段階での毒性評価が重要な最初のステップとなります。 ただし、MSC-EV の医療価値は、さまざまな実験動物モデルで検証されていますが、毒性評価は十分に行われていません。本講演では、レギュラトリーサイエンスの観点から、MSC-EV およびその他の幹細胞由来 EV の毒性学的プロファイルの現状と未来像を考察することです。

　近年の細胞遺伝学的解析技術の進歩に伴い、従来法では検出できなかった染色体の変化が捉えられるようになった。とくに性染色体にはしばしば数的変化や構造変化が観察される。例えば、Y染色体長腕には「AZF領域」と呼ばれる繰り返し配列が集積した領域がある。このAZF領域は微細欠失や重複のホットスポットであり、日本人の30％以上はこの領域に微細欠失を有している。なお、この領域の構造変化は無精子症のリスク因子として知られているが、日本人特異的微細欠失は精子形成を障害しないと考えられる。

　最近の特記すべき知見として、一般の高齢男性の体細胞におけるY染色体喪失の発見が挙げられる。このような男性では、Y染色体を失った45,X細胞が徐々に体内に集積する。70歳の男性の40％程度にY染色体喪失細胞が観察されるとの報告がある。加齢性Y染色体喪失は、早期死亡、ガン、アルツハイマー病などのリスクとなる。さらにわれわれは、体細胞のY染色体喪失が必ずしも高齢男性に限局した現象ではなく、胎児期や小児期を含むあらゆる時期に生じうることを報告した。小児や若年男性における体細胞モザイクY染色体喪失は、性分化疾患、成長障害、不妊症のリスクとなる。したがって、男性は生涯にわたりY染色体を喪失するリスクを有していると考えられる。なお、喫煙者で明らかに加齢性Y染色体喪失の頻度が高いことから、この現象には何らかの環境因子が作用することが示唆される。一方われわれは、上記の日本人特異的AZF欠失がY染色体喪失のリスクとならないことを見出している。

　本講演では、ヒトの性染色体に関する新たな知見を紹介する。さらに、染色体変化に影響する環境因子についても議論したい。

がんの形成には“最適な母地”となる細胞環境が必要であると考えられてきた。最近では、変異細胞が出現しても周囲の正常細胞によって消失してしまい、発がんには至らない、“細胞競合”メカニズムも着目されている。1970年代にカナダ トロント大学のEmmanuel Farber教授らは、発がん物質がDNA付加体を形成して変異を誘発することで腫瘍を生じることを実証した。Solt-Farberモデルと言われるResistant Hepatocyteラットである。これは、ジエチルニトロサミン（DEN）による発がんイニシエーションの後、増殖抑制剤AAFの後に70%部分肝切除によって増殖を促進して肝臓がんを誘発する“化学発がん”モデルである。このような過酷な環境で出現する前がん病変は、グルタチオンS-転移酵素P（GSTP）陽性の肝細胞であった。当時Farberラボの研究員だったイタリア カリアリ大学のAmedeo Columbano教授は、2010年代にGSTP陽性の前がん病変にはNRF2体細胞変異が集積していることを見出した。GSTPは転写因子であるNRF2の標的遺伝子のひとつであり、gain-of-functionとなるNRF2変異はがん細胞が恒常的なNRF2活性化を獲得する原因となる。ヒトがん細胞の解析でも、NRF2や、NRF2活性を制御するKEAP1に多くの体細胞変異が存在することが2006年以降に次々と発表された。また、遺伝子変異以外にもNRF2を活性化する分子機構がある。このような”NRF2活性化がん”はある種のがんでは約30%を占めるため、NRF2活性化がんを選択的に抽出する診断方法や、NRF2活性化がんに特異的な化学療法を確立することができれば、Nrf2活性化がんを標的とした薬剤を臨床現場に還元できると期待される。

依存性物質は多種多様であり、程度の差はあるが神経毒性を有する。世界的には、オピオイドの乱用が深刻であり、米国だけでも年間７万人ほどがオピオイドの過量服薬で死亡している。日本では、覚醒剤に分類されるメタンフェタミンの乱用が大きな問題であるが、最近、大麻および処方薬の乱用が拡大しており、特に中高生を含む若年者での乱用が急増している。また、エナジードリンクなどカフェインを多量摂取する問題が若年者を中心に深刻化している。一方、依存性物質の多くには、ストレス解消効果、鎮痛効果、入眠効果、抗うつ効果など、有用性を有する物質も多いので、毒性と有用性のメカニズムを明らかにし、適正に使用および規制することが求められている。本教育講演では、第一に多種多様な依存性物質を、標的分子や精神神経作用、法規制などで分類し、全体像を紹介する。第二に、アルコールとメタンフェタミンなど個別の依存性物質の毒性と有用性及びそのメカニズムについて具体的に説明する。最後に、物質依存だけでなく行動嗜癖も含めたアディクションに関する最新の研究動向を紹介する。

　パラダイムシフトとは、パラダイム、すなわち、その時代や分野において、当然のことと考えられていた認識や思想、社会の価値観などが、革命的にもしくは劇的に変化することをいう。パラダイムとは、もともとは、科学哲学者のトーマス・サミュエル・クーンにより、主著『科学革命の構造』において提唱された概念であるが(1962年)、原義から拡大解釈されて一般化されて用いられている。旧パラダイムでは説明できない例外的な問題が徐々に蓄積し、その結果、パラダイムは危機に陥るが、やがて、異端とされる考え方の中から問題解決のために有効なものが現れ、全く新しいパラダイムが登場する。こうして科学は進歩してきたのではないだろうか。 　

　毒性学は、生命科学のパラダイムシフトともいえる進展を貪欲に吸収することにより進歩してきたというのが私の実感である。このパラダイムシフトの例として具体的には「定性→定量」（無毒性量やリスク評価等）、「相関関係→因果関係」（遺伝子改変動物の利用、トキシコゲノミクスやシステム毒性学等）あるいは「一般則を帰納的に推論→ゲノムを基にシステム全体を演繹的に推論（エピジェネティクス等）」を挙げることができる。ヒトと社会に役立つように、もっとも望ましい姿に調整する「レギュラトリーサイエンス」も挙げることができる。人工知能技術導入にも積極的で、ナノマテリアルなど新素材に係る毒性評価にもすばやく取り組み、分子生物学の導入による「機能学と形態学との垣根越え」もいち早く経験したようにおもえる。こんなに先進的で興味深い学問を、私は他に知らない。 　

　毒性学が、新しいパラダイムの登場を畏れず、むしろ歓迎する学問であり続けることを願ってやまない。

In the course of drug development, it’s important to find an effective dose in a defined group of patients with the fewest side effects. In recent years, it has become difficult to proceed with drug development without exploring the relationship between biomarkers representing genetic characteristics, environmental factors and detailed characteristics of diseases, and efficacy and safety. Utilization of biomarkers lead the shift change from a “one-drug-fits-all” to a “personalized approach”, placing the drug development industry in a highly dynamic landscape, having to navigate such disruptive trends. In response to this, innovative clinical trial designs have been key in realizing biomarker-driven drug development. Regulatory approvals of cancer genome sequencing panels and associated targeted therapies have brought personalized medicines to the clinic. Large-scale genome analysis technology and information processing technology are rapidly progressing in the medical field, which leads a global-wide transformation of the entire medical care. The advancement of technologies also promotes utilization of clinical biomarkers, and clinical biomarker-based medical innovation is currently taking place in various fields in drug development. The presentation will include an overview of biomarker-driven drug development and summarizes the current state of biomarker utilization in drug development. I will also touch on the development phases of clinical biomarkers divided into Discovery, Translational and Qualification.

安全性バイオマーカーは、非臨床及び臨床研究において新薬候補化合物の安全性をモニタリング及び予測するための重要な医薬品開発ツールである。 古典的な腎障害バイオマーカーである血清クレアチニンやBUNは、非臨床試験において主要な腎バイオマーカーとして使用されているが、低感度であることから早期腎障害の指標としては不十分であると考えられていた。これに対して、近年 FDAのBiomarker Qualification Programは、第I相臨床試験において薬剤誘発性腎尿細管毒性を検出するための6つの尿中バイオマーカー（KIM-1、クラスタリン、シスタチンC、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ（NAG）、好中球ゼラチナーゼ結合リポカリン（NGAL）、オステオポンチン）についての適格性を示した。このように、安全性バイオマーカーは、薬剤開発の推進・改善への寄与が見込まれる。 非臨床試験の病理組織学的検査で見られた腎障害は、6つの尿中バイオマーカーのいずれかの上昇に関連する可逆的な尿細管の組織学的損傷が示された場合、臨床試験における安全性モニタリングに尿中バイオマーカーを使用することができる可能性を示唆する。しかしながら、尿中バイオマーカーは時に予期しない変動を示すことで判断を複雑化させるケースがある。 本演題では，当社の非臨床試験において薬剤誘発性腎毒性が出現した際の腎バイオマーカー解析事例について紹介したい。

厚生労働省では、予測・予防型の医薬品安全対策を進めている。薬剤性間質性肺炎（DILD）は日本人で発症報告数が多い重篤副作用である。DILDには様々な病型が存在するが、びまん性肺胞傷害（DAD）型は特に死亡や後遺症につながることから、DADを早期に判別し適切な治療を開始することが重要である。我々は、国内の4大学病院等と共同で患者試料等の研究を行い、DILDのバイオマーカー探索を行った。

その結果、DAD発症時に高値となって回復時には低下し、また他のDAD以外のDILD病型（器質化肺炎や非特異性間質性肺炎等）との判別に有用な血清マーカーとして、ストラテフィンを見出した（Arakawa N. et al., Nat Commun. 2022;13:5854）。本変動は別群のコホートでも検証でき、さらにDAD型のDILDと他の関連疾患（細菌性肺炎、肺がん、COPD等）との判別にも有用であった。なお、当該バイオマーカーの血清中濃度分析法としては、独自のELISA系を構築し、必要な項目についてバリデーションを行ったものを用いた。さらに、剖検試料を用いた免疫染色の結果、DAD症例の細気管支上皮等にストラテフィンが認められ、また培養細胞を用いた解析からp53及びアポトーシス依存的な細胞外へのストラテフィン放出が示唆された。以上より、DAD型のDILDマーカーとして、ストラテフィンが有用であることが強く示唆された。また別途、薬剤性と特発性のILDを判別しうるバイオマーカーとして、リゾホスファチジルコリンも併せて見いだした（Saito K. et al., Sci Rep. 2022 ;12:19819）。これらの結果を基に、PMDAのファーマコゲノミクス・バイオマーカー相談を受けた。

講演では、上記例を紹介後、最後にこれら経験を通じた、安全性バイオマーカーの確立方法について提案したい。

医薬品開発におけるバイオマーカー（BM）の活用は、治療効果が高く副作用の少ない医薬品の実現に繋がる一方、十分な検討が行われることなくこれらが利用されることは誤った判断を招くおそれがある。そのため、医薬品開発に広く利用される前段階においてBMの適格性を確認することは重要である。Qualification（適格性確認）とは、提案されたBMのcontext of use（用法）の範囲内において、当該BMが生物学的過程、反応または事象を適切に反映し得ると判断され、探索期から承認後にわたる医薬品開発におけるその使用が支持されるというBMに関する評価結果を踏まえた結論である（ICH E16）。

独立行政法人 医薬品医療機器総合機構（PMDA）では、2009年、BMに関する考え方をPMDA内で統一するためにオミックスプロジェクトチームを発足した。その活動として、厚生労働省と協力してファーマコゲノミクス（PGx）に関連する行政通知の作成に関わると共に、PGx・BM相談において、個別品目の評価とは関係しないデータの評価及び解釈を行ってきた。BMの用法を適切に設定し適宜改定していくことは、適切な利用さらには適格性の拡大に繋がり、このような継続的かつ段階的な取り組みが、真に臨床的に意味のあるBMに基づいた治療効果が高く副作用の少ない医薬品の実現に繋がると思われる。

本発表では、非臨床研究で見出された安全性BM候補を医薬品開発に活用する上で考慮すべき点について紹介したい。

事前には予期しえない偶然（contingency）による事態は、事業展開の上からは、避けるべきものとされているが、創薬研究の上では、画期的な新薬を見出せれるチャンスでもある。実際、我々はcontingencyから、NSAIDsや合成オピオイドとは全く異なる作用機序で働く画期的な疼痛抑制薬ADRIANAを見出した。ADRIANAは、アドレナリン受容体α2B拮抗薬であり、交感神経シナプス前膜のα2Bを介してネガティブフィードバックによるノルアドレナリン放出を誘発し、それがα2Aを刺激して脊髄後角の侵害受容ニューロンを抑制して鎮痛作用を示す。ADRIANAは齧歯類のみならず霊長類でも、炎症性疼痛やがん性疼痛等の強い痛みに対し、モルヒネに匹敵する鎮痛作用を有する一方、合成オピオイドに類する副作用はみられないため、米国で深刻化しているオピオイド危機を救う革新的な薬剤となりうる。ADRIANAは経口吸収も良好でGLPレベルでの非臨床試験でも特に問題が無かったため、ADRIANAの経口錠剤に関して、京都大学医学部附属病院で医師主導第1/2相臨床試験(jRCT2051220144)が実施されており、その成果が期待される。

骨軟部肉腫は稀な悪性腫瘍である一方、多くのサブタイプに分かれていて、生物学的、遺伝学的、形態学的の面において多様性に富んでいる。肉腫に特徴的なゲノム変異として、融合遺伝子、転写制御システムに関わる遺伝子やヒストン遺伝子、DNAメチル化酵素といった分子の異常が重要である。これらの変異は、それぞれ特有のエピゲノム異常を誘引し、肉腫の増殖と維持に関わっている。これらの異常を解析し、肉腫の発生過程や腫瘍微小環境を理解するツールとしてマウスモデルの存在は重要である。本シンポジウムでは、我々が開発した融合遺伝子関連肉腫のマウスモデルとその利点を紹介する。一方、最近のエピゲノム編集技術の進歩はマウスモデルの解析に有用であるだけではなく、治療法の開発にも道を開いている。CRISPR/dCas9をベースとしたエピゲノム編集の肉腫研究への応用についても提示したい。

網羅的な解析に依拠した毒性予測と評価の迅速化、高精度化を目的とするPercellome Projectにおいて、遺伝子KOマウスの検討から派生した新型反復曝露実験は、全動物に同量の検体を反復投与し、翌日に用量を振って最終投与を行い、その２、４、８、及び24時間後の遺伝子発現測定を行うプロトコールを採用した。これまでに、曝露の都度に24時間以内に変化する「過渡反応」と、曝露を反復することで増減する｢基線反応｣に分解できる事を見出した。そして、代表的な検体について、DNAのメチル化の状態とヒストン修飾の変動を、WGBS及びChIP-seq（活性化の指標であるH3K4me3、H3K27Ac、及び、抑制の指標であるのH3K27me3、H3K9me3）を用いて網羅的に測定した。PPARaのリガンドでもあるクロフィブレート（CFB）を例に取ると、14日間の反復曝露により15日目の過渡反応がpdk4、cyp4a14で低下していた。エンハンサ・プロモータ領域の配列を調べると、PPARa等が上流にあり、それらの発現が反復曝露により低下していたことから、過渡反応の低下は上流の抑制で説明がついた。

今回、PPARaの活性化を誘導するとされるペルフルオロオクタン酸（PFOA）の4日間の新型反復曝露実験を実施した。先ず、単回曝露時の24時間最大無変化量は10㎎/kgであったのに対し、4日間反復曝露のそれは0.1㎎/㎏であった。これはCFBの単回100mg/kg、反復70mg/kgと大きく異なっていた。また、PPARa直下とされるpdk4は発現が遅く24時間目に向かって増加、cyp4a14は、基線反応、過渡反応ともに上昇し、CFBとは異なっていた。ネットワーク描出を基軸とした両者の差異の解析を示すと共に、CFB等のエピジェネティクス情報を参照しての機序解析を試みる（厚生労働行政推進調査事業による）。

毒性を呈する化学物質が惹起する遺伝子発現プロファイル（マイクロアレイデータ）に対して、細胞一個あたりのmRNAコピー数を推定するプロセスを加えることにより定量的な比較を実現可能としたPercellomeデータベース[1]は、化学物質の暴露によって引き起こされる毒性の分子メカニズムを推論する上で有用なリソースである。本データベースには、マウスへの曝露用量、曝露時間ごとに遺伝子発現量（上記プロセスにより推定される細胞一個あたりのmRNAコピー数）が格納されており、遺伝子発現量の動的変化を定量的に捉えることにより「どのような分子ネットワークの変動が化学物質曝露による毒性発現と紐付けられるか」を抽出することができる。本データベースを用いて、既知のPPAR alpha(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Alpha)リガンドおよびこれまでの研究成果からPPAR alphaリガンドであることが示唆されている化学物質３種（クロフィブラート、バルプロ酸、エストラゴール）にDEHP（フタル酸ジ（２―エチルヘキシル））及びPB（フェノバルビタール）を加えて遺伝子発現量の動的変動パターンを比較し、これら５種に共通するパターンや固有に認められるパターンを検出した。本講演では、化学物質曝露が引き起こす多種多様な生体反応について報告するほか、有用な解析ツールを紹介する。

[1] Kanno J. et al., J. Toxicol. Sci. 2013;38(4): 643-654

The science of toxicology forms the cornerstone of modern medicine and healthcare. In toxicology, computational methods from omics-level data analysis to multi-level (cell, tissue, organ, and whole body) modeling and simulation techniques have been increasingly applied. New approaches in Analytical AI based on deep neural networks and representation learning hold further promise to enhance the field, providing the ability to query multiple modalities of data (quantitative, imaging, text processing) and higher predictive quality of results.

However, gaps exist in the adoption of such cutting-edge methods in modern machine learning by practicing toxicologists, where descriptor-based quantitative structure–activity relationship (QSAR) methods are still widely used in this field. With the exponential progress witnessed in the field of AI, and more recently the rise of Generative AI and large language models (LLMs), it is critical to Review, Re-assess, and Re-imagine the role of AI in toxicology.

In this talk, we highlight, through different case studies, the various applications of traditional and modern machine learning techniques in toxicology - ranging from large-scale risk assessment of specific compounds to the prediction of the impact of combination trial ingredients in cosmetology. Modern methods are typically data-hungry and require training on many examples. We also explore how emerging methods in generative AI can be developed to fine-tune existing large, pre-trained models on a large corpus of multi-modal data and applied to focused problems in toxicology.

Novel modeling architectures which leverage existing computational methods, together with modern neural networks, representational learning methods, and large language models hold significant promise to re-imagine the science of toxicology - from specific drug ADMEtox properties to whole body risk assessment for human health and ecotoxicity.

「推理する毒性学」とは，研究対象の化学物質の毒性に関する再現性のある科学的知見を収集し，それらを関連づけることによってその化学物質の人に対する毒性を説明する演繹法的思考方法による毒性学をいう。事故性・事件性のある中毒事例では，曝露条件の再現が不可能あるいはきわめて困難であり，そのような場合は「推理する毒性学」は有効である。この思考方法をもとに，カドミウム，鉛およびメチル水銀の環境毒性学に取り組んだ。その際，環境汚染物質の毒性発現の場は標的となる器官の実質細胞であると考えるという常識にとらわれずに「血管の毒性学」を開拓した。その結果，カドミウム，鉛およびメチル水銀による血管病変の理解だけでなく，例えばメチル水銀の神経毒性に血管毒性が関与し得るという新知見を得ることができた。一方，毒性学は“現実の科学”である。研究対象となる化学物質は人への曝露が確認されているものあるいは人が曝露する可能性のあるものに限られ，その実験的曝露濃度および曝露時間は現実的に起こり得る範囲に限られ，毒性の指標は現実に観察されたものが中心となる。その壁を越え，金属が持つ強い生物活性を活かした新しい分子プローブによって生体機能解析研究に発展させることを着想した。すなわち，有機-無機ハイブリッド分子を活用する新しい研究戦略バイオオルガノメタリクスである。有機-無機ハイブリッド分子の細胞毒性を調べ，その特性とメカニズムを明らかにする研究から開始した。次いで，有機-無機ハイブリッド分子を分子プローブとして，血管内皮細胞のメタロチオネイン誘導機構，内皮細胞のプロテオグリカン合成調節機構および内皮細胞における超硫黄分子合成機構の解析を行った。以上の研究の展開，得られた新知見，さらには毒性学研究を自由に発展させることの重要性について確認し，それによって毒性学の未来に少しでも貢献したいと考えている。

水俣病が公式に確認されたのは1956年である。しかし「水俣周辺で何かが起こっている」という兆候はそれよりもかなり以前からあった。1940年頃には湾内の海草が白色化して海面に浮き、係留中の船の底に牡蛎が付着しないことが観察されていた。その後も、1950年頃にかけて、湾内で魚類が浮上したり、カラスの群れが海中に突入するという現象などが認められていた。また、1954年8月には「猫てんかんで全滅---水俣市茂道部落ねずみの激増に悲鳴」という記事が熊本日日新聞に掲載されている。これらの事実が地域住民に不安を与えたことは間違いない。熊本大学医学部による詳細な調査の結果、水俣病の最も早期の発症は1941年の1名であり、それ以降も1954年にかけて毎年のように1〜4名の発症者がいたことが分かった。また、発症者数は1955年には21名、1956年には39名と、この時期から急激に増加していた（その理由については本講演にて考察する）。水俣病の原因が究明されるまでにはかなりの時間がかかった。1957年に熊本大学が原因は水俣湾でとれた魚介類の摂取であると発表し、同年にチッソ工場の排水中に含まれる何らかの物質が原因であるとの報告がされた。チッソ工場はアセトアルデヒドなどを生産しており、廃液を海に流していた。2年後の1959年7月に熊本大学研究班が原因は有機水銀との説を発表した。しかし、反論も多く、最終的に当時の厚生省が「原因はチッソ工場から排出されたメチル水銀」との公式見解を発表したのはそれから9年経った1968年であった。メチル水銀は魚介類中に比較的蓄積しやすく、魚介類を介してヒトの体内に入ったメチル水銀は血液脳関門を通過して脳に蓄積して、脳細胞に対して選択的に障害を与える。しかし、その機構は水俣病の公式確認から67年が経過した現在も未だ不明である。

多くの元素は過剰摂取すれば毒性を示し、欠乏すれば不足症状を示す。しかし、セレン（Se）には、毒性、必須性に加えて薬理作用があり、しかもそれぞれの用量－反応関係が接近しており、国際間・地域間での摂取量が大きく違うという特徴がある。ヒトが摂取するSeレベルは、土壌中Se濃度、そこに栽培される植物中Se濃度に大きく影響を受ける。米国サウスダコタ州では土壌中Seが牧草に蓄積して家畜のSe中毒症が発生したが、米国の小麦・トウモロコシ耕作地帯は全般的に土壌中Se濃度が高く、これが米国民だけでなく、米国の小麦・トウモロコシ（家畜飼料）輸入に依存する日本人のSe摂取レベルに影響を及ぼしている。一方、中国の土壌中Se濃度の顕著に低い地域でSe欠乏による心筋症が発生したが、北欧も土壌中Se濃度が低い地域であり、北欧から報告されるSeに関する疫学調査の結果は、Se摂取レベルの異なる他の国では再現されないことが多い。主に北欧からの疫学報告により、Seの抗がん作用に注目が集まった。しかし、Se摂取レベルの高い米国で行われたSeによるがん化学予防のトライアルは完全な失敗に終わり、逆にSe過剰摂取による糖尿病発症率の上昇という新たな課題を提示した。Seによる抗がん作用は、Seの抗酸化作用では説明がつかないことが多く、むしろ薬理作用としての細胞増殖抑制作用と考えた方が理解しやすい。薬理作用と副作用が起こる濃度が近い薬は悪い薬であり、薬としてのSeは悪い薬である。実際、中国でのSe中毒症の症状は抗がん剤の副作用と多くの類似点がある。Se摂取レベルが低レベルから通常レベルに変化するときには抗酸化作用も上昇するが、必要量以上にSeを摂取しても抗酸化作用は頭打ちになりそれ以上上昇しない。これらの点を誤解すると、不必要で、場合によっては有害なSe補給を行う原因となりうる。

有害金属であるカドミウム（Cd）の健康影響については、精錬工場や電池工場などの職場でのCd曝露、および一般環境汚染による飲食物を介したCdの過剰摂取によって腎臓、肝臓、骨、呼吸器並びに循環器などに障害が認められている。特に、慢性腎毒性は尿細管機能障害を主症状とし、Cdの安全性評価の対象となっている。わが国では、職業曝露によるCd中毒のみならず、多くのCd汚染地域で慢性腎毒性が発生した。特に、富山県神通川流域で、Cdの環境汚染により長期間Cdを経口摂取した結果、高齢経産婦に腎毒性と骨軟化症を主症状とするイタイイタイ病が発生している（1968年公式発表）。このイタイイタイ病の発生を機にCdの健康リスク評価が研究され、さらにはCdの毒性発現機構の解明などの研究も進められてきた。また、今日、わが国において、産業職場や環境汚染によるCd中毒はほとんど認められていない。しかしながら、Cdは微量ながらコメなどの食品を介して生涯にたって身体に取り込まれ、しかも体内残留性が非常に高い（ヒトでの生物学的半減期:15〜30年）ため、最近ではCdの微量長期曝露による高齢者の健康影響が問題となっている。一方、メタロチオネイン（MT）は、1957年にウマの腎皮質からCd結合タンパク質として単離された。MTは、構成アミノ酸の約1/3（20個）をシステインが占めていることから、金属に対する親和性が高く、フリーラジカル消去作用を有する。これまでの研究で、MTは、銅や亜鉛などの必須金属の恒常性の維持に関与するとともに、Cdをはじめとする様々な有害因子の毒性や種々の疾病に対して防御的役割を果たしていることが明らかにされている。本シンポジウムではCdの毒性とMTの生体防御に関するこれまでの知見を紹介するとともに、今後の課題についても言及する。

① タンパク質レベルの話；50年近く前、鉛貧血をテーマとし、酵素学的解析を主とする研究を始めた。試験管内での鉛による酵素活性阻害機構、鉛阻害からの活性賦活化機構が明らかとなり、ほぼ同じメカニズムで生体内の酵素活性が決定されることが示された。更に、鉛特異的と考えられていた酵素阻害が、生体内でエポキシドを形成する薬物の曝露によっても引き起こされることが判明した。

② 代謝系レベルの話；酵素阻害による終末代謝産物の減少で、律速酵素の負のフィードバック制御が肝臓では解除されることが判った。一方、造血系の律速酵素は終末代謝産物により正に制御された。これらの調節に関わると考えられる、終末代謝産物が制御する転写因子が発見され、環境ストレス応答および細胞分化に関与することが明らかにされている。このような国内外の研究成果に基づき、終末代謝産物を利用した遺伝疾患の発症予防が2011年国内でも認可された。

③ 細胞レベルの話；前世紀末から、既に暴露は終わり、長期の潜伏の後、悪性腫瘍発症を待つばかりの職業病が問題となっている。マウスのNKT細胞研究から、ヒトの細胞レベルでの対応が可能ではないか、と考えた。ネックとなったのはマウスとヒトで細胞数が極端に異なることであった。ヒトに多く分布し性質の類似するMAIT細胞を用いた研究をスタートした。７年後、多剤耐性抗酸菌感染症に対応できることが判った。が、マウスでの分布が希少なため、動物実験での抗腫瘍効果の検出に困難があった。更に10年が過ぎ、マウスの実験系の樹立によって、見通し可能となった。

④ 余話として；40年ほど前から、鉛中毒で未解明であった神経症状のメカニズムが明らかとなり始めた。残念ながら、神経系の解析能力がなく、参画できなかった。更に、二価金属としての複製ミスによる突然変異の誘発、鉛を含むRNA酵素の存在など、進化の方向付けへの寄与も想定できる。

メチル水銀は脳神経障害を引き起こす代表的な環境汚染物質の一種である。近年、妊婦の魚食を介したメチル水銀曝露による胎児の健康被害は世界的に懸念されている。しかし、メチル水銀による脳神経障害に関わる分子機構に不明な点が多く残されている。我々はこれまでに、メチル水銀がオンコスタチンM（OSM）やTNF-α、IL-1β、CCL2などの炎症性サイトカイン類の発現誘導を介して細胞死を誘導することを、マウス神経幹細胞株を用いた検討により明らかにしてきた。また、上記の炎症性サイトカイン類はメチル水銀を投与したマウスの脳中ミクログリアにおいて発現誘導されることも見出した。特にミクログリアから放出されたOSMは、神経細胞膜上に存在するTNFR3の細胞外ドメインに結合することで細胞死を誘導することや、この一連のプロセスがOSM中の105番目のシステイン残基にメチル水銀が直接結合することによって促進されることも明らかにしている。最近我々は、マウス脳スライスをメチル水銀で処理すると神経細胞死が誘導されるが、本細胞死はミクログリアを選択的に死滅させるクロドロン酸内包リポソームの処理によって抑制されることを見出した。また、メチル水銀に曝露したマウスでは記憶機能の低下が認められるが、この障害もミクログリア阻害剤であるPLX3397の同時投与によって抑制された。以上のように、メチル水銀はミクログリアを活性化させることで炎症性サイトカイン類の発現誘導および産生を介して周辺の神経細胞にダメージを与えることが示唆されている。本講演では、メチル水銀による脳神経障害におけるミクログリアの役割について紹介する。

パーキンソン病(PD)は，黒質線条体路のドパミン神経の変性脱落により，無動・寡動，静止時振戦，筋強剛，姿勢保持障害などの運動症状を発現する進行性で原因不明の神経変性疾患である．孤発性PDの病態形成には酸化ストレス，炎症，ミトコンドリア機能障害，α-synuclein凝集体による神経毒性など様々な要因が考えられているが，特定の神経系が障害されるメカニズムは未だ明らかとなっていない．神経外環境であるグリア細胞は栄養供給や免疫作用により神経環境の維持に重要な役割を果たす一方，神経病態においては炎症反応を惹起し，神経障害に関与する．近年，活性化ミクログリアが細胞傷害性A1アストロサイトを誘導し，神経細胞死をもたらすことが報告され，神経変性疾患の病態形成におけるアストロサイト−ミクログリア連関が注目されつつある．さらに，グリア細胞は形態のみならず機能的にも一様ではなく，脳部位により多様性を示す．我々はこれまでに，グリア細胞の部位特異性がドパミン神経細胞に及ぼす影響について検討し，PD発症リクスを高める環境要因の一つである農薬ロテノン曝露は部位特異的なアストロサイト−ミクログリア相互作用を介してグリアの神経保護機構の破綻および炎症性サイトカイン産生を誘導し，非細胞自律性のドパミン神経障害を惹起することを見出した．さらに，ロテノンがアストロサイトを介してミクログリアに作用し，神経障害をもたらす知見を得た．本シンポジウムでは，アストロサイト−ミクログリア連関に関する最近の知見を紹介するとともに，グリア細胞の部位特異性に着目したパーキンソン病の病態形成メカニズムの解明について議論したい．

現在、10万種類にもおよぶ化学物質が工業的に生産され、医療や産業、さらには日々の生活にと幅広く利用されている。しかし、これら化学物質の中には、胎児期から乳幼児期に至る発達期の曝露により、成長後の行動異常を引き起こすものが少なからず存在する。てんかん治療薬であるバルプロ酸（VPA）を妊娠期に服用すると、児の知能指数が低下し、自閉症リスクが上昇する。胎児期にポリ塩化ビフェニル（PCBs）に曝露すると、成長後の記憶・学習障害や社会行動の異常が生じる。重金属や農薬にも同様の作用が認められているものがある。このような神経影響は発達神経毒性と称され、曝露（胎児期）から作用（成長後）まで時間を要することが特徴である。脳内の免疫担当細胞であるミクログリアは、発達期に不要なシナプスを貪食除去し、神経回路網の成熟に役割を果たしている。一方、ミクログリアの過剰な活性化は神経炎症を生じ、神経系に対して障害的に働くと考えられている。現在、ミクログリア活性の異常と神経疾患、精神疾患との関連も盛んに議論されており、また、重金属類や多環芳香族炭化水素など、様々な化学物質がミクログリアを活性化することが報告されている。私たちは、医薬品や環境化学物質のミクログリアに対する影響を調べ、また、異常に活性化したミクログリアを抑制する化学物質の網羅的な探索を行ってきた。本講演では、胎児期のバルプロ酸曝露により生じる神経系の障害について、ミクログリアと神経回路網に着目した成果を報告する。農薬であるネオニコチノイドや大気汚染物質PM2.5の神経影響についても、ミクログリアや神経炎症を中心に紹介したい。

Microglia are brain-resident macrophages that prune synapses through "find me" and "eat me" signals, which are fundamental to neural circuit reorganization. While Complement C1q has been identified as a "find me" and "eat me" signal for microglia, it can be randomly distributed in the brain parenchyma under certain circumstances, such as neonatal seizures. To investigate the mechanisms by which microglia determine which synapses to phagocytose after neonatal seizures, a live imaging system for microglia-synapse interactions was established in vitro. We found that microglia contacted and engulfed more active synapses when the neurons were activated. In a mouse model of neonatal febrile seizures, inhibitory, but not excitatory, synapses were pruned by microglia, resulting in hyperactivity of dentate neuronal circuits. We also discovered that the increased activity of dentate inhibitory neurons during hyperthermia-induced seizures resulted in preferential interactions between microglia and inhibitory synapses. These findings suggest that C1q may serve as an "eat-me" and increased neuronal activity as a "find-me" signal in the process of synaptic pruning by microglia, which may underlie the development of epilepsy following neonatal seizures.

次世代リスク評価（NGRA）は、種々のin vitroおよびin silico手法からなるNew Approach Methodology (NAM)により支えられ、それらを統合して利用することにより、結果として化学物質のヒト安全性評価の信頼性が向上することが期待される。近年、NGRAの概念実証のためのケーススタディの開発が行われている。ケーススタディは、様々な意思決定におけるNAMの長所と限界を理解するために有用である。リードアクロス（RAx）は、評価対象物質のデータギャップを類似の化学物質の既存のデータを用いて補完する方法であり、工業化学物質に対するスクリーニングレベルでの有害性評価において長く用いられてきた。NAMを用いてRAxの科学的信頼性を構築することにより、RAxはNGRAの基盤のひとつになりうる。 本発表では、NGRAのうち、特にRAxの信頼性向上へ向けた課題とNAMの利活用拡大へ向けた動向についてまとめる。その予測結果の行政的受入のためには、類似性の仮説を科学的に正当化し、その裏付けとなる情報を提供する必要がある。エンドポイントに関連したin vitro NAMが、いかに類似物質選択の信頼性を向上させることができるかを検証していくことが求められる。ケーススタディにおいて確認されたこれらの重要性について紹介する。また、OECDで開発中の(Q)SAR Assessment Frameworkガイダンスは、(Q)SARモデルおよびその予測結果を規制当局が評価するための体系的で調和のとれた枠組みである。本ガイダンスに記載された原則に沿って、モデルおよびその予測結果の評価のためのチェックリストが作成されている。NGRAにin silico NAMを適用する際には、その信頼性強化の観点から有用と考えられる。規制安全性評価の文脈から、本ガイダンスの概要についても紹介する。

２０２０年までに化学物質が健康や環境への影響を最小とする方法で生産・使用されるようにすることを目標とした、SAICM（国際的な化学物質管理のための戦略的アプローチ）が２００６年に国連環境計画（UNEP）に承認されて以降、国際的に化学物質を効率的に評価する手法の開発が進められた。化学物質評価の質と効率の向上をもたらす可能性がある技術として、NAMs（New Approach Methodologies）が取り上げられている一方、NAMsを実際の法規制への活用については、課題も残されている。 本講演では、今回、日本の化学物質管理法令の１つである化審法の制度の概要について説明し、化審法における新規化学物質の上市前の性状審査と既存化学物質のリスク評価におけるQSARやリードアクロスといったNAMs導入例を紹介する。 また、化審法においてウェイトオブエビデンスの導入に向けた検討状況を紹介するとともに、国際的な議論の中心の場となっているOECDでのNAMsの検討状況や我が国の貢献についても共有する。 最後に、化審法におけるNAMsの規制への適用を目指し、信頼性の向上、事例の蓄積やガイドラインの作成といった課題や今後の対応の方向性について述べる。

化学物質の安全性評価において、皮膚感作リスクは重要な評価項目である。皮膚感作性のハザードを特定するための従来の動物を用いた試験法に代わり、現在では、New Approach Methodologies（NAMs）と呼ばれる動物を用いない手法が開発され、それらを用いたNext Generation Risk Assessment（NGRA）の開発が活発に進められている。

皮膚感作性のNAMsとしては、感作成立における初期のキーイベントに着目したin chemicoおよびin vitro試験法が複数開発されOECDのテストガイドラインとして採択され、いくつかのin silicoツールも開発されてきた。さらに近年、これら動物を用いない評価法を組み合わせることで、複雑な感作のメカニズムをカバーしつつ高い予測性を備えた評価手法として、皮膚感作性評価における確定方式（Defined Approaches for Skin Sensitization; DASS）が提案されてきた。そして2021年には、2 out of 3 Defined ApproachおよびIntegrated Testing Strategy v1/v2 Defined ApproachesがOECDのガイドラインに収載された。一方で、皮膚感作性のNGRAの一部としてNAMsを用いるにあたっては、各NAMsの適用限界など、考慮するべき点や注意点も存在する。

本発表では、最近新たにOECDのガイドラインに収載されたものや更新されたものを中心に、皮膚感作性のNAMsを紹介するとともに、化学品や香粧品原料などの皮膚感作性評価における活用状況について述べる。さらに、今後のNGRA開発に向けたNAMsの課題、そしてそれらを解決するために現在活発に検討が進められている最新の研究事例を紹介する。

化学物質の安全性評価において、動物実験代替法の開発が強く求められているが、毒性の多様性や発現機序の複雑さ等の問題から、反復投与毒性試験や発がん性試験の代替法の開発はほとんど進んでいない。そのような中、既存の毒性情報を利用するリードアクロスと呼ばれる手法に期待が寄せられており、多くのケーススタディが報告されている。リードアクロス手法では、評価対象物質（ターゲット物質）の毒性を、化学構造や生物学的特性が類似した物質（ソース物質）の毒性情報から類推する。したがって、ソース物質の選択が非常に重要であるが、類似性は人が判断するために主観的になりやすく、再現性の問題も指摘されている。そこで私達は、ラット反復投与毒性やラット発がん性試験を代替するための客観的なリードアクロス手法の開発を目指して研究を行っている。本研究では、リードアクロスのステップを、①インビボ毒性試験情報を有する数百物質のデータセットの定義、②精度評価用の被験物質の設定、③化学構造情報（分子記述子）に基づく物質間距離の計算、④物質間距離に基づく類似物質（ソース物質）の選択、⑤インビトロ試験結果に基づくソース物質のさらなる選別、⑥リードアクロスによる毒性評価とその精度検証、などの過程に分け、それぞれの過程における条件検討を積み重ねている。これまでに、標的とする毒性エンドポイントの種類により、最適なソース物質の選択を可能とする分子記述子の種類は異なること、最適なリードアクロスにはソース物質の数と類似性の程度の両者が重要であること、いくつかの毒性エンドポイントではインビトロ試験結果を利用したソース物質の選択が有用であること、などを示している。本シンポジウムでは、私達の研究方針と最近の成果を具体的に紹介し、化学物質の安全性評価におけるリードアクロスについて、その（規制）科学的観点から議論したい。

特定非営利活動法人 国際生命科学研究機構（International Life Sciences Institute Japan; ILSI Japan) は、2018 年に「食品領域の動物実験代替推進プロジェクト（AAT プロジェクト）」を立ち上げ、動物に依存しない、ヒトへの予測性のより高い評価アプローチを確立し、食品の安全性及び機能性評価の精緻化・効率化を進展させることを目的とし活動している。 本プロジェクトでは、食品関連企業が参画してアカデミアと連携しながら、「代替加速のための研究推進」、「最新技術の情報収集」および「コンセンサス形成のための情報発信」を柱としてそれぞれ取り組みを進めている。研究テーマとして、既存の毒性試験情報を有効に活用した毒性予測のための食品成分毒性データベースの構築、食品の体内曝露予測技術の構築に取り組むとともに、動物に依存しない安全性評価戦略の策定とケースレポート作成を並行して進めている。本発表では、食品分野における NAMs を用いた評価戦略に関する ILSI Japan AAT プロジェクトの取り組みについて、現状と課題を紹介する。

2020年施行の食品衛生法改正では、食品容器具及び包装容器について安全性を評価した物質のみを使用可能とする、ポジティブリスト制度が導入された。現在、医薬品に関して同様のリストは無い。医薬品の場合は、製剤の用法用量に適する多様な包装容器が必要となり、一律の規制が難しい。たいていの医薬品では食品と比較して包装容器との接触面積がかなり小さいので、包装容器から製品に移行する化学物質の量は食品よりも少ないと考えられるものの、製造に用いる器具や包装容器から意図せず化学物質が溶出して医薬品に混入し、人体に曝露していることは明らかである。特に問題になるのは、微量で毒性を発現する物質が容器施栓系に使われる場合である。注射剤バイアルに使われるゴム製品の中には重合促進剤としてニトロソアミンを添加するものもあるし、ニトロセルロースを含有するブリスター包装が印刷インクに含まれるアミンと反応してニトロソアミンを生成し製品を汚染したと考えられる事例もあるなど、ありふれた製品に問題が潜んでいる。ゴム製品やプラスチック製品には可塑性や耐久性を高める様々な添加剤が使用されているが、詳細はユーザーに公開されない。我々は、管理された抽出条件下で対象となる素材から溶出したextractablesの情報を参考に、実際に製品に混入するleachablesのアセスメントをするしかない。しかしながら、検出された物質について毒性試験が実施されていないなど、問題も多い。ここでは、ExtractablesとLeachablesの安全性評価が必要な背景と、トキシコロジストがそこで生じている問題にどう取り組んでいけばよいのかを議論する

　医薬品製剤中の不純物リスク管理においては、各々の不純物を同定・定量した上で不純物質毎に毒性評価を行い、その毒性情報に基づいて設定したPDEなどの許容摂取量に基づき、品質上の基準値等を設定して管理することが基本的な手法である。しかし、不純物の発生起源は多種多様であり、医薬品の製造過程における副反応物や分解物、原料や添加剤等に含まれる不純物に加えて、容器施栓系や医薬品製造に用いる機材からの溶出物等も不純物として最終製品に含まれる可能性がある。特に、容器施栓系や機材からの溶出物は、それらの材質に含まれる化学物質の毒性情報がほとんど得られていない工業用化学物質が多く、個々の物質の評価は困難である。そこで、微量曝露による化学物質のリスク管理を包括的に行うことができるTTC（Threshold of Toxicological Concern）アプローチに基づき、管理閾値等を設定したリスク管理が適用されている。このTTCアプローチはICHM7ガイドラインにも採用された遺伝毒性発がん性物質に対する閾値設定だけでなく、非遺伝毒性に対する閾値設定にも拡張され、食用香料や食品用途の器具容器からの溶出物の評価においても採用されている。しかし、これらの非遺伝毒性影響のための閾値設定に利用された毒性情報はほとんどが経口曝露による毒性試験結果に基づいている。そのため設定される閾値は基本的に経口投与製剤にしか適用できない。一方、容器施栓系や製造に用いる機材からの溶出物の曝露リスクは、経口剤以外の製剤でより高いと考えられる。ここでは、経口曝露実験で得られた毒性データを、静注や吸入、点眼･点鼻剤におけるExtractablesとLeachablesの評価にどのように適用すべきかについての議論を行う。

ICH Q3Eガイドラインは，医薬品のE&Lの安全性評価と管理について，欧米の官民を中心に示されてきたいくつかの指針を踏まえつつ，国際調和を推進するために作成が行われている．

協議のためのStep 2bドラフトガイドラインは2023年11月に示される見込みである．

従来国内における関連の指針は限られていたため，この先国内企業においても準備を始めておくべきである．

現在のE&Lの評価と管理のプロセスは，一般に　1) Material (素材) とComponent (資材) の選択のための情報収集，2) Extractables試験で見られる物質の構造及び安全性補完情報収集，3) 製剤のleachables試験及び関連する管理となっていると考えられる．

これに対し，品質管理関連での考慮事項・調和が期待される事項は，ICH Q3EガイドラインのConcept Paperに記載があるように，それぞれ1) MaterialとComponentの選択と特性評価に取り組む方法，2) E(&L)試験実施の方法，3) サイエンスベース・リスクベースの管理戦略構築法などである．

本発表では，このような点につき当該ガイドラインの検討状況として紹介可能な範囲で取り挙げる．

医療機器分野では、ISO等の国際標準が各国の医療機器規制に積極的に取り入れられている。身体と接触する医療機器においては、ISO 10993シリーズに準拠した生物学的安全性評価の実施が求められている。ISO 10993-1「医療機器の生物学的安全性評価の基本的考え方」では、医用材料の化学的特性に関する情報収集を要求している。ISO 10993-1、10993-17（曝露量評価）、10993-18（化学的特性評価）及びISO 21726（毒性学的懸念の閾値：TTC）の改訂動向を見る限り、動物福祉や開発コスト削減の観点も踏まえて、化学分析を併用した安全性評価手法は、ますます利用されると考えられる。U.S. Food and Drug Administrationは化学分析の導入を積極的に推進していると共に、国内においても化学分析の導入を試みている医療機器メーカ及び受託試験研究機関が存在する。 化学分析は分析対象が決まっている場合、医療機器からの溶出量及びヒトへのばく露量評価に非常に有用である。一方で、医用材料メーカは不純物を含めた全組成を開示しないため、化学分析に利用できる情報は限定される。それゆえ、TTCアプローチは、医療機器の包括的な評価に利用可能である。しかし、同アプローチに利用される現行のE&L分析は、いずれも解決すべき課題が山積している。本発表では、遺伝毒性及び感作性試験の代替となるTTC及び皮膚感作性の閾値（DST）の概念を利用した戦略的分析パッケージを紹介する。

動物実験廃止の国際的な潮流やFDA近代化法2.0の制定により、in vitro試験法への期待が寄せられる。In vitro神経活動を非侵襲に計測できる微小電極アレイ（MEA）計測法は、化合物の毒性評価法の一つであり、OECDにおいて、評価法ガイダンスが作成された。本講演では、中枢神経および末梢神経におけるMEAを用いた化合物の毒性評価および作用機序予測の現状を紹介する。具体的には、ヒトiPS細胞由来中枢神経、感覚ニューロン、脳オルガノイドから得られる波形データからvivoへの外挿性を有する毒性評価法、およびDeep learningを用いた作用機序予測法を紹介する。また、最先端の24万電極CMOS-MEAを用いた”フィールドポテンシャルイメージング“により得られるビックデータの１細胞レベルの詳細な解析による作用機序予測法の取り組みについて紹介する。

In recent years, innovative technologies beyond the conventional have begun to be developed and applied to drug discovery research. With innovations in iPS cell technology, gene editing and Omics-related technologies, the granularity of data has become finer than before, and it was realized that a huge amount of data can be handled in the safety evaluation process with multiple readouts. For example, according to a survey by a pharmaceutical company in the EU, high content analysis technology that can analyze the health status of cells from multiple angles is understanded as a game changer in several companies in 2015. It has been used as a practical tool by almost companies in 2020. On the other hand, retrospective analysis using biobanks not only contributes to the elucidation of disease mechanisms in human but is beginning to be applied to drug safety research. Using knowledge management databases integrating the results from complex searches with automated processing will help to handle the big data volumes. Thus, by leveraging knowledge management to accumulates various in vitro data and in vivo data and integrates clinical information, we may be able to predict drug safety more accurately in pre-clinical stage. Finally, machine learning and AI with the database could help to develop hypotheses of the toxicological mechanism for early candidates. In this presentation, I try to introduce examples of various in vitro data accumulation in our company and discuss the future potential and challenges for using AI in investigative toxicology.

人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、あらゆる細胞種に分化できるため、細胞治療への応用や、医薬品候補の安全性や毒性予測も含めたin vitro薬理評価システムとしての細胞ベースのアッセイとして有望です。しかし、iPS細胞の培養を維持・分化させるプロセスには、研究者の高い技術力が必要です。さらに、細胞ベースのアッセイには、長期培養、生細胞のリアルタイムおよび連続的な観察、多くの細胞事象の検出などの複雑なプロセスが含まれます。そこでアステラス製薬は、ロボティックオートメーションやAI画像解析技術を駆使し、iPS細胞を中心とした細胞や遺伝子などの新しいモダリティの創薬自動化プラットフォーム「Mahol-A-Ba」を開発しました。これは、iPS細胞培養に特化した双腕ロボット「Maholo」と、画像解析を中心とした自動細胞実験システム「スクリーニングステーション」で構成されています。Mahol-A-Baは、iPS細胞実験に必要な高度な実験技術を数値化してロボットの動作に反映させ、複数のプロセスのマルチサンプル処理を自動化し、人為的ミスを低減することで再現性を向上させ、研究者が実験に費やす貴重な時間を短縮します。また、AI細胞画像解析技術を取り入れることで、従来定性的なスコアでしか評価できなかった微細な変化を追跡し、定量化を可能にすることで高質な薬理評価を実現しました。さらには、Mahol-A-Baは遠隔地からリモートで実験や解析を行うことができるため、在宅や共同研究先からも研究を進めることが可能です。今後はこのプラットフォームを活用して、研究者とロボットとAIがオーケストラのように調和し、グローバルな研究協力が推進され、新薬候補の発見が加速することが期待されます。

Our single-cell transcriptome technology was ranked as No.1 on both accuracy scores and overall scores in an international benchmarking of the Human Cell Atlas project, where 25 research teams participated from 7 countries and the results were published in the Nature Biotechnology (Mereu et al. 2020). We also developed high-throughput bulk transcriptome technology which can analyze a large variety of bulk samples simultaneously at less than a tenth the cost of existing technology such as microarray or RNA sequencing. Whole transcriptome based phenotypic drug discovery become more important to analyze drug efficacy to cells on genome-wide basis recently. As it can detect influences of drugs on pathways in cells comprehensively, we can select compounds with novel mechanism while evaluating drug efficacy and toxicity, as well as extrapolating drug target pathways and mechanisms. In 2018, previous study reported whole transcriptome-based drug screening technology, “DRUG-seq” in the Nature Communications (Ye et al. 2018). As a demonstration, we compared gene detection capability of our bulk transcriptome technology with that of “DRUG-seq”, by conducting comparable experiments under the same conditions. While the DRUG-seq detected 10,000 genes by sequencing of 2.17 million reads, our technology detected almost the same number of genes by sequencing only 0.23 million reads. It showed our bulk technology can analyze 10 times more compounds in 1 run of the next generation sequencer.

がん免疫療法は、がん治療において急速に発展している分野であり、大きな期待が寄せられている。T cell engager はがん免疫療法の一種で、がん抗原に応答してT細胞を誘導し細胞傷害を引き起こす。しかしながら、標的抗原ががんだけでなく正常組織にも発現することにより、免疫系が正常組織へ作用し引き起こされる組織傷害やサイトカイン放出症候群などの重篤な毒性（on-target/off-tumor毒性）のリスクが開発上の課題として挙げられる。

本研究では、カニクイザル及びヒト由来のオルガノイドを用いてT cell engager によるon-target/off-tumor毒性にカニクイザルからヒトへの外挿性を評価することを目指した。in vitroの評価では、正常組織の構造や標的発現を模倣するためにオルガノイドを用い、末梢血単核細胞（PBMC）との共培養系を構築した。その結果、カニクイザル毒性試験でみられた腸管毒性をin vitroで反映することができた。さらに、カニクイザル及びヒト由来のオルガノイドを用いたin vitroの実験結果を比較することで、カニクイザルの前臨床試験データからヒトへの外挿性について検討した。

この評価系は、on-target/off-tumor毒性のメカニズムのより深い理解や動物実験結果のヒト外挿性の考察につながり、T cell engagerの安全性評価のために有用なアプローチと考えられた。

エピゲノムの機能不全は，様々な疾患を誘発することが指摘されている．しかしながら，このエピゲノム調節がどのようなメカニズムで起こるのかは不明である．私たちはシトシンのメチル化を触媒するDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）に着目した．まず初めに，DNMTに対する一酸化窒素の影響を検討した．NOは様々なタンパク質システイン残基チオール部を酸化修飾（S-ニトロシル化）し，酵素活性を調節することが知られている．そこで，NOによってDNMTがS-ニトロシル化されるか否か検討したところ，NOの濃度，時間依存的な修飾が観察された．その結果，酵素活性が抑制されることでゲノムDNA脱メチル化が起こり，様々な遺伝子が誘導されることを発見した．この現象がNO介在性の病態発症に関わっている可能性が示唆された．次に，NOと同様の効果を有する環境性化学物質が存在するかどうかスクリーニングした．興味深いことに，いくつかの環境性親電子物質が共有結合を介してDNMT活性を抑制することがわかった．これらの化合物の特性ならびに機能について，最近の知見を紹介する．

エピジェネティックな遺伝子発現制御は、細胞の運命を決定し、様々な生命現象に関与する。一方、このエピジェネティックな遺伝情報は環境変化等により比較的容易に変化し、その異常はがんなどの疾患の原因になる。ヒストンのリジン残基上で起こるアシル化修飾は、エピジェネティック制御の分子基盤の一つである。これらのリジンアシル化の少なくとも一部は、脂肪酸などの生体内のカルボン酸がアシルCoAを介してリジン残基のεアミノ基に付加されることによって引き起こる。我々は、食事等により様々な化合物を日々に摂取しており、その中にはカルボン酸も含まれる。これら非意図的に摂取している生活環境由来のカルボン酸も、内在性の脂肪酸などと同様にヒストンに修飾し、遺伝子発現変化を誘導する可能性がある。実際、我々は複数の生活環境由来のカルボン酸がヒストンのリジン残基に修飾し、少なくともその一部は遺伝子発現変動を惹起することを見出した。本発表では、食品添加物であるソルビン酸由来ヒストン修飾による遺伝子発現調節を中心に、環境化学物質の隠された機能について紹介したい。

エキスポソームとはヒトが生涯曝露する環境因子の総体であり、このような環境因子がヒトに与える影響は大きく、がんなどの疾病に対して遺伝因子より寄与率が高いとされている。エキスポソームを正確に理解する方法は現在知られていないが、我々は環境物質が生体反応を引き起こすには、タンパク質と環境物質との相互作用が必須と考え、タンパク質の環境物質による修飾を調べるアダクトエキスポソームを提唱している。タンパク質の修飾を網羅的に調べるプロテオミクスとして、現在はDDA（データ依存測定、ショットガン分析とも呼ばれる）が主流であり、これを用いたラベルフリー定量をもとにアダクトエキスポソームの解明に挑んでいる。 我々は、細胞に種々の化合物を添加し、細胞のプロテオミクス解析する手法を開発した。東京薬科大学の伊藤教授らと共同で、食品添加物を細胞に添加し、細胞中のヒストン修飾を探索した。有機酸系の化合物の多くは、ヒストンへの共有結合が見られ、これがエピジェネティクスに遺伝子発現を調整する可能性を見出した。これからも種々の化合物とタンパク質の修飾を調べていき、化合物暴露と老化・中毒・疾病といった生命反応との関連の研究を進めていきたい。

膨大な化学物質が環境中には含まれ、体内で生体分子と相互作用することで様々な疾患の原因となることが推定されている。我々はその中で、蛋白質と共有結合を形成できるアダクト形成化学物質が特に重要であると考え、その解析技術の開発を進めている。 我々は低分子化合物にアルキン（炭素－炭素三重結合）をタグとして導入し、ラマンイメージングによりその細胞内局在を明らかにするAlkyne-tag Raman Imaging（ATRI）法を開発してきた。アルキンはコンパクトで元の化合物の活性に影響を及ぼしにくい一方で、ラマン分光法で生体分子がシグナルを持たないサイレント領域に強いシグナルを示す。さらに我々は、金属ナノ粒子上で起きる表面増強ラマン（Surface Enhanced Raman Scattering: SERS）を利用することでアルキンの検出感度を向上させ、アダクト検出や化合物の細胞内取り込みの可視化にも成功した。また最近では、アルキンよりもさらにコンパクトな重水素を用いた検出も展開している。本発表では、アルキンタグを中心にラマン分光法を用いたアダクト形成化合物の検出に関して報告する。

タンパク質構造は極めて多様性があり、何らかの活性種により翻訳後修飾を受けた場合、周辺環境に応じて構造・機能を変化させるとともに、その変化を生物応答などの機能発現につなげる場合がある。このような事例は、解毒や自然免疫などの生体防御反応において見受けられる。従って、タンパク質化学修飾は、タンパク質構造を変化させるだけでなく、付加体特異的にタンパク質に新たな機能性を賦与し、それらをシグナルとして活用する場合のあることを意味する。一方、最近の研究により、脂肪酸や糖質に起因する内因性の短寿命活性種だけでなく、植物性食品成分など、日常的にありふれた化合物でもタンパク質に作用し、その修飾構造が免疫以外の細胞やタンパク質とも相互作用することが明らかになってきた。こうした背景をもとに、タンパク質や脂質などの生体成分に関し、化学修飾の特徴的なパターン（“修飾シグネチャー”）を包括的に解析し、さらにそれらに対する生物応答の仕組みを理解することは、これまで単なる“傷害”と捉えられてきたこれまでの化学修飾の生物学に新たな変革や転換をもたらものと考える。本シンポジウムでは、酸化に起因する修飾構造の生成がもたらす生物応答の仕組みについて、最近になって分かってきたことについて紹介したい。