シトルリン化蛋白に対する自己抗体は、関節リウマチに高頻度かつ特異的に検出される新たな血清マーカーとして注目されている。現在までのところ、関節炎モデルマウスにおいて、シトルリン化蛋白に対する抗体の産生は報告されていない。本研究で、われわれは、T 細胞刺激伝達系の主要分子であるZAP70の変異により、ヒトの関節リウマチに酷似した慢性自己免疫性関節炎を自然発症するSKGマウスにおいて、抗シトルリン化蛋白抗体の産生がみられるかどうかを検討した。通常の飼育環境下で、約9ヶ月齢において、SKGマウスの一部（約30%）に抗CCP（環状シトルリン化ペプチド）抗体が見いだされた。また、そのうちの少なくとも一部は、シトルリン化フィラグリンに反応するがシトルリン化されていないフィラグリンには反応しないため、シトルリン化蛋白を特異的に認識していると考えられた。また、IL-6をノックアウトしたSKGマウスは、関節炎を全く発症しないが、抗CCP抗体の産生が認められた。したがって、SKGマウスにおける抗シトルリン蛋白抗体は、関節炎発症の原因ではなく、また関節炎の結果として産生されるものではないと考えられる。

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  内在性CD25+CD4+ 制御性T細胞は，胸腺で産生され，試験管内での抗原刺激に対して，自らは低反応であり，他のT細胞の増殖を抑制する．この細胞集団を生体より除去すると，各種の臓器特異的な自己免疫疾患が自然発症する．その際，制御性T細胞を移入すれば，自己免疫病の発症が阻止される．すなわち，制御性T細胞は，末梢での免疫自己寛容の維持に重要な働きをしている．CD25+CD4+ 制御性T細胞の発生及び機能発現のマスター制御分子は，転写因子FoxP3であり，FoxP3の異常は，ヒトの自己免疫病の原因となる．また，自己免疫マウスモデルや自己免疫疾患患者において，制御性T細胞に量的もしくは機能的異常を認める．自己免疫マウスモデルを用いた実験では，制御性T細胞の移入により，発症後の自己免疫疾患を治療することが可能である．制御性T細胞をヒトの自己免疫疾患の治療に応用するには，制御性T細胞と活性化CD25+ T細胞を区別できる細胞表面マーカーの検索，抗原特異的な制御性T細胞の増殖法の開発などが重要課題である．

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正常個体中に存在する制御性T細胞は、免疫自己寛容の維持、免疫応答の抑制的制御に枢要である。内在性制御性T細胞は、CD２５分子を構成的に発現する。正常動物末梢CD４＋T細胞の約５-１０％を占めるCD2５＋T細胞を除去すると、甲状腺炎、糖尿病など様々な自己免疫病が自然発症してくる。このようなCD2５＋CD４＋制御性T細胞の少なくとも一部は、正常胸腺で機能的に成熟した状態で産生される。Foxp3は、制御性T細胞の発生、機能発現を制御するマスター制御遺伝子である。Foxp3は、胸腺、末梢のCD2５＋CD４＋T細胞に特異的に発現しており、正常T細胞にFoxp3を発現させると、機能、表現型の点で内在性制御性T細胞と同等の制御性T細胞に転換できる。Foxp3＋CD２５＋CD４＋制御性T細胞の量的・質的異常は、様々な自己免疫疾患／炎症性疾患の直接的原因となる。さらに、内在性制御性T細胞のみならず、Foxp3遺伝子の導入により作製した制御性T細胞を用いて、様々な免疫疾患の予防・治療が可能である。一方、内在性制御性T細胞の除去あるいは機能操作は、自家腫瘍に対して有効な免疫応答を惹起できる。逆に、制御性T細胞の制御能を強化すれば、移植臓器に対する拒絶反応を抑制し、長期の移植免疫寛容を誘導できる。即ち、制御性T細胞は免疫自己寛容のみならず、自己／非自己に対する免疫応答の抑制的制御に重要である

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正常個体中に存在する制御性T細胞は、免疫自己寛容の維持、免疫応答の抑制的制御に枢要である。内在性制御性T細胞は、CD25分子を構成的に発現する。正常動物末梢CD４^＋T細胞の約５-１０％を占めるCD25^＋T細胞を除去すると、甲状腺炎、糖尿病など様々な自己免疫病が自然発症してくる。このようなCD25^＋CD4^＋制御性T細胞の少なくとも一部は、正常胸腺で機能的に成熟した状態で産生される。制御性T細胞の末梢での維持にはIL-2が必須であり、CD25分子は単なる制御性T細胞のマーカーではなく、IL-2レセプターの構成分子として制御性T細胞機能に必須の分子である。一方、Foxp3は、制御性T細胞の発生、機能発現を制御するマスター制御遺伝子である。Foxp3は、胸腺、末梢のCD25^＋CD４^＋T細胞に特異的に発現しており、正常T細胞にFoxp3を発現させると、機能、表現型の点で内在性制御性T細胞と同等の制御性T細胞に転換できる。Foxp3^＋CD25^＋CD4^＋制御性T細胞の量的・質的異常は、様々な自己免疫疾患／炎症性疾患の直接的原因となる。例えば、小児の免疫不全疾患であるIPEX(Immune　dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked)症候群では、高頻度にＩ型糖尿病、甲状腺炎、炎症性腸疾患のみならず、重篤なアレルギー（皮膚炎、食物アレルギー）を発症する。また、内在性制御性T細胞のみならず、Foxp3遺伝子の導入により作製した制御性T細胞を用いて、自己免疫病、アレルギーなど様々な免疫疾患の予防・治療が可能である。一方、内在性制御性T細胞の除去あるいは機能操作は、自家腫瘍に対して有効な免疫応答を惹起できる。逆に、制御性T細胞の制御能を強化すれば、移植臓器に対する拒絶反応を抑制し、長期の移植免疫寛容を誘導できる。即ち、制御性T細胞は免疫自己寛容のみならず、自己／非自己に対する免疫応答の抑制的制御に重要である。本講演では、病的、生理的免疫応答制御における制御性T細胞の役割について、Foxp3の遺伝子制御に関する最近の知見を交えて議論する。また、制御性T細胞を用いた免疫疾患の治療、予防の可能性について論じる。

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京都大学で生体肝移植を受けた小児患者の生存症例の15%が免疫寛容となった。しかし、免疫寛容成立のメカニズムは明らかではない。本学の坂口がマウスでその存在を同定した制御性T細胞は自己免疫疾患のみならず、移植後の免疫寛容にも重要な働きをしているとの知見が、動物実験のレベルでは集積されつつある。われわれは、生体肝移植後に免疫寛容となった患者の末梢血中のリンパ球におけるCD4⁺CD25^high+細胞の割合が、免疫抑制剤を使用中の患者や、健常人に比べて増加していることを見出した。また、機能的評価により、免疫寛容の患者で、同細胞がドナー抗原特異的にエフェクター細胞を制御している場合があることを示した。更に、プロトコル生検により得られた移植肝のなかのFOXP3蛋白⁺細胞は免疫寛容の患者では、免疫抑制剤使用中の患者の移植肝、慢性拒絶の患者の移植肝に比べて、増加しており、FOXP3蛋白⁺細胞の大部分はCD4⁺であった。以上より、CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺制御性T細胞は、末梢血、グラフトの両方に存在し、移植肝を拒絶から守っている可能性が示唆された。従って、患者の末梢血から制御性T細胞を分離して、いったん試験管のなかでドナー抗原と培養して、ドナー抗原特異的な制御能を獲得させた制御性T細胞を再度体内に戻す、細胞養子免疫が免疫寛容の誘導に有用かもしれない。演者らは、固形臓器移植のなかで最も予後の悪い肺移植で細胞養子免疫を行うため、ミニブタ(ジャパンファーム；クラウンミニブタ)で同治療法の安全性と有効性を確認している。同実験に先立って試験管内でのミニブタ制御性T細胞のドナー抗原との培養法を確立した。
(文献)
Li, Y. et al. Analysis of peripheral blood mononuclear cells in operational torelance after living donor liver transplantation. Am.J.Transplant, 2004, 4: 2118-25
Yoshizawa A. et al. The roles of CD25+CD4+ regulatory T cells in operational tolerance after living donor liver transplantation.Transplant Proc, 2005, 37: 37-9.
Koshiba T. et al.Clinical, immunological, and pathological aspects of operational tolerance after pediatric living-donor liver transplantation.Transpl Immunol, 2007,17(2):94-7.
Li, Y. et al.The presence of FOXP3 expressing T cells within the grafts of tolerant human liver transplant recipients. Transplantation,2008 (in press)
Satoda, N. et al.Value of FOXP3 expression in peripheral blood as rejection marker after miniature swine lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 2008 (in press)

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【目的】SKGマウスは、ヒト関節リウマチに酷似した自己免疫性関節炎を自然発症する。その原因はT細胞シグナル伝達分子であるZAP-70遺伝子の点突然変異であり、その発症機構として、胸腺Ｔ細胞選択の異常による免疫自己寛容の破綻が考えられる。今回、Tet-onシステムにより、T細胞に正常ヒトZAP‐70をドキシサイクリン（Doxy）依存性に発現誘導が可能なマウス、TetOn-SKG を確立した。SKG背景のTetOn-SKGマウスは、通常では内在性のSKG型ZAP-70が作用するが、Doxyを与えると、正常ヒトZAP-70とGFPを発現し、TCRシグナル伝達強度を補正する。この系を使用して、SKGマウスのZAP-70発現異常と胸腺選択異常、および自己免疫性関節炎の関係について検討した。
【方法 結果】TetOn-SKGマウスにDoxy入りの餌を3週間与え、GFP^high　およびGFP^－ CD4SP胸腺細胞 ( 3×10⁵個)をそれぞれRAG2欠損マウスに養子移入した。4ヶ月間のレシピエントの観察でGFP^high移入群において、関節炎の発症率、重症度は著明に減少した。同様の実験をCD4SPCD25^－胸腺細胞で行っても、同様であった。次にDO11.10^＋TetOn-SKG マウスを作成し、そのCD4SP 胸腺細胞におけるTCRを、DO11.10 TCR特異的抗体(KJ1.26)を用いてレパトアを比較した。その結果、GFP^－ではKJ1.26陽性率33％に対し、GFP^highでは90％陽性であり、産生されるT細胞レパトアの変化が確認された。
【結論】以上の結果から、胸腺選択異常によるT細胞レパトアの変化が、SKGマウスにおける関節炎発症に重要と考えられた。

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  日本人の4人に1人は心臓病や脳血管疾患などの動脈硬化性疾患で死亡しており，その発症機序を解明し，有効な治療法や予防法を開発することが切に望まれている．動脈硬化性疾患は慢性炎症性疾患であると考えられているが，炎症を負に制御するような制御性T細胞（Treg）と炎症を引き起こすようなエフェクターT細胞のバランスを，薬剤投与によりTreg側に傾けることにより，マウスにおいて動脈硬化形成を抑制することが示されている．しかし，抗体薬などの生物学的製剤の全身投与は，安全性およびコストの問題により臨床応用は困難である．動脈硬化モデルであるアポリポ蛋白E遺伝子欠損マウスの皮膚に紫外線（UVB）照射を行うことにより，Foxp3陽性Tregの誘導，エフェクターT細胞の免疫応答の抑制とともに有意な動脈硬化形成の抑制を認めた．薬剤投与によりFoxp3陽性Tregを特異的に減少させることができる易動脈硬化マウスにおいて，UVB照射による動脈硬化抑制効果は消失した．さらに，ランゲルハンス細胞を特異的に除去した易動脈硬化マウスにおいて，UVB照射によるTregの増加および動脈硬化抑制効果は消失した．以上より，UVB照射はランゲルハンス細胞の何らかの機能修飾を介してTregを誘導し，抗動脈硬化的に作用することが示された．皮膚からの動脈硬化予防という新規の予防・治療法の可能性を示すことができ，臨床応用が期待される．

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  【目的】全身性エリテマトーデス（SLE）は，過去にT cell receptor（TCR）signalの異常が報告されているが，どのように病態に関わっているかは明らかではない．TCR signalの低下をおこすskg遺伝子は，Balb/cバックグラウンド（SKG/b）でリウマチモデルとなる関節炎をおこし，バックグラウンドをかえると疾患の表現型が変わる．我々はC57BL/6にskg mutationをいれ（B6SKG），主に環境因子としてPoly（I;C）を持続投与し，B6SKGマウスでループスがおきるか実験した．【方法】ループスは，抗dsDNA抗体IgGのELISA，腎臓の免疫染色（IgG, C3）で評価した．Flow cytometryで，脾臓中の濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh）をCD4+CXCR5+Bcl-6+PD-1highで，胚中心B細胞（GC B cells）をB220+AA4.1−FAS+GL-7+で測定した．脾臓の免疫染色で，胚中心をPNA+GL-7+CD38−で確認した．mRNAの発現は，Taqman real-time PCRで調べた．【結果】Poly（I;C）を持続投与でB6SKGは，Balb/c，SKG/b，C57BL/6と比べ，血清中の抗dsDNA抗体IgGの抗体価が上昇し，腎臓の糸球体にIgG，C3の沈着を認め，ループス様の腎炎を発症した．Tfhの割合が他のマウスより高く（4-6％），Poly（I;C）刺激後に増加した（7-10％）．CD4 T cellsのmRNAでは，IL-21とBcl-6が高発現していた．【結論】skgによるTCR signalの異常は，SLEの危険因子になりうる．B6SKGはTfh分化を特徴とし，T細胞がどのようにループスに関わっているかを検証する良いモデルマウスである．

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  FOXP3+CD4+制御性T細胞（Treg）は抗腫瘍免疫を抑制する．ヒトではFOXP3はT細胞活性化に伴い発現誘導され，FOXP3とCD45RAにより3つの亜分画に分類され，FOXP3loCD45RA- T細胞は抑制機能を持たないnon-Tregである．大腸直腸癌より抽出した腫瘍浸潤リンパ球を評価すると，約半数の腫瘍においてFOXP3loCD45RA- T細胞が多数浸潤していた．これらのFOXP3loCD45RA- non-Tregの浸潤程度で大腸直腸癌は2つのタイプに分類できた．FOXP3lo T細胞が多く浸潤するタイプの腫瘍では，IL12A，TGFB1 mRNAの発現が有意に高値で，腫瘍内炎症が亢進していた．大腸癌に付着する腸内細菌叢を，FFPE組織を用いたFISH法と，切除新鮮標本の腫瘍表面より抽出した16S bacterial DNAを用いた16S sequencing法で評価した．腫瘍内炎症のある腫瘍（FOXP3loCD45RA- non-Tregが高頻度）では，腸内細菌，とりわけFusobacterium nucleatumが多く腫瘍内に浸潤していた．さらに，腫瘍内炎症のある腫瘍では無い腫瘍に比し予後良好であった．腸内細菌浸潤が腫瘍内炎症を介してFOXP3lo T細胞誘導に働き，抗腫瘍免疫応答を亢進する可能性があることが示され，大腸癌治療への応用が期待された．

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Organ transplantation remains the only fundamental treatment for end-stage organ failure. Immunosuppression therapy is the key to successful post-transplantation outcomes. Although the survival after organ transplantation has improved with the development of immunosuppressant, chronic rejection and side effects of long-term exposure to immunosuppression remain ongoing concerns. Immune tolerance is important for normal physiology, and occurs in two forms: central and peripheral. The regulatory T cell is the essential constituent in peripheral tolerance. Regulatory T cells specialize in suppressing immune responses, including autoimmune disease, allergy or alloreaction. Regulatory T-cell therapy in transplantation may be emerging as an alternative therapeutic choice.

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Regulatory T (Treg) cells, which specifically express the transcription factor Foxp3, are actively engaged in the maintenance of immunological self-tolerance and homeostasis, for example, preventing autoimmune disease and allergy. They can also be exploited to induce transplantation tolerance by expanding them in an antigen-specific fashion or to evoke effective tumor immunity by reducing them or attenuating their suppressive activity. Treg cells can therefore be a key target for clinical immune suppression or enhancement.

The majority of Foxp3+ Treg cells develop in the thymus as a functionally distinct and mature T-cell subpopulation, while some conventional T cells in the periphery can differentiate into Foxp3+ Treg cells under certain conditions, for example, by in vitro antigenic stimulation in the presence of TGF-beta. Ectopic expression of Foxp3 is also able to confer suppressive activity on conventional T cells. We have recently made attempts to pharmacologically control Treg-specific transcriptional and epigenetic changes and thereby control Treg cell development and function. We found that certain tyrosine kinase inhibitors that blocked T-cell receptor-proximal signaling in T cells were able to specifically deplete mature Treg cells, thereby enhancing tumor immunity in humans. On the other hand, inhibitors of a serine threonine kinase involved in a T-cell signaling pathway evoked Foxp3 expression in conventional T cells and converted them to functionally competent Treg-like cells, which effectively suppressed autoimmune disease and allergy in animal models.

This lecture discusses how the development and function of Treg cells can be controlled by transcriptional and epigenetic interventions and how Treg cells be pharmacologically targeted to control a variety of physiological and pathological immune responses.

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細胞分離は，生命科学研究や医療における強力なツールとなっている．これまでさまざまな細胞分離方法が開発され，細胞分離技術の進歩に伴い幅広い分野での利用性が高まり，各分野での合目的な細胞分離法が提案されている．本報では，各細胞分離法に加え，筆者らが開発を進めている解離性分子を介した抗体固定化表面を用いた標的細胞の選択的な捕獲・回収について概説する．ポリアクリル酸グラフトにより細胞非接着性に表面改質し，抗体を固定化することで標的細胞を選択的に捕獲可能であった．抗体固定化の際にdesthiobiotinおよびDNAを解離性分子として用い，それぞれ，biotin修飾水溶性高分子の添加による交換反応，DNaseの添加による分解反応にて高効率な細胞回収が可能であった．免疫学的アフィニティーを応用した新たな細胞分離法としての可能性が示された．

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正常個体中に存在する制御性T細胞 (Regulatory T cells, Treg)は、免疫自己寛容の維持、様々な免疫応答の抑制的制御に枢要である。内在性Tregの大部分は胸腺で、機能的に成熟した形で産生される。転写因子Foxp3は、Tregに特異的に発現し、Tregの発生、機能発現を制御するマスター制御遺伝子である。Foxp3+Tregの量的・質的異常は、様々な自己免疫／炎症性疾患の直接的原因となる。逆に、正常T細胞にFoxp3を発現させると、機能、表現型の点で内在性Tregと同等のTreg様T細胞に転換できる。一方、抗体、小分子を用いてTregの量的減少、抑制活性の減弱を図れば、がん免疫、微生物免疫を亢進できる。本講演では、Tregによる免疫抑制の分子機構、およびその機能、細胞系譜の維持機構について述べる。さらに、如何にTregを増やし、あるいは通常T細胞をTregに転換できるか、またTregを用いた細胞療法による自己免疫病、炎症性腸炎などの予防・治療が可能か、について議論する。

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