米・辛口味噌 (麹歩合6.0と8.2のもの2種) を仕込み, 20°から40°の範囲で品温経過の異なる試験区を設け, それらの醸酵熟成過程の遊離酸, 酸の消長を検討し, 次のような結果を得た。
1) 経過温度の低い区分は遊離酸の遊離速度が遅く, 酸の生成速度も遅かった。
これに対して経過温度が高くなるにしたがい遊離酸の生成速度が速くなった。また経過温度の高い区分では遊離酸の遊離速度が速いが, 熟成後半は遊離酸の量が減少の傾向を示した。
2) FNに対する遊離酸 (窒素比) の量はすべての温度区で仕込初期には低いが, 時間の経過とともに増大しそれ以降熟成の全期間を通じてほぼ一定の傾向を示した。
3) 熟成に伴う (m mole)/FN比とピロ酸 (m mole)/FN比の間には高度に有意な負の相関が認められた。
4) log {(pyro/FN)/(Gln/FN)} の値は仕込当初は大きな負の値を示すが, 醸酵熟成が進み味噌らしい香り, 味, 色等が付き始めたときその値が-0.2～0を示し, ゼロを越えた正の領域で熟成が完了するものと考えられる。更にこの時のpH, 遊離酸FNの値からも同様のことが推察される。

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(1) 市販醤油並びに純醸造醤油について各種型態の酸を分析し,これら相互間の関係を明かにした.
(2) 醤油中に存在する全酸の中,遊離態とピロ酸態とは併せて90%以上に達し,ペプチド態として存在する量は僅か数%に過ぎない.
(3) 仕込醪の醗酵初期においてはが多量に生成され,その量は遊離酸の量と大差がない.
(4) 醤油中のピロより非酵素的作用によつて生成されるが,又一部は酸より同様の作用によつても生成される.
(5) 醤油中の酸への変化を続け,次第に減少する.
(6) 酸に関する限り,醤油醸造中における変化は次の如く考えられる.
蛋白質→ペプチド→L-酸
L-→L-ピロ酸
(7) 醤油中には遊離のアスパラギン酸の外にアスパラギンも存在する.

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(1) Pseudomonas cruciviae var. ovalisの生産するL-酸デヒドラーゼによるL-酸のL-ピロ酸への酵素的脱水反応を利用して,ラセミ酸の分割を試み結果は良好であった.
(2) レ酸デヒドラーゼの酵素特異性は全くL-酸に限られ,非常に安定な酵素であり, 50～100mg/mlのラセミ酸溶液をpH8.0, 50°にて1mg/mlの凍結乾燥菌体にて4時間処理することによりL-酸は完全にL-ピロ酸となり, D-異性体には変化は起らない.
(3) この反応液よりのL-ピロ酸とD-酸の分離は強酸性イオン交換樹脂にpH2.0で通過せしめることで行える.この流出液よりL-ピロ酸, 2Nアンモニア水溶液溶離液よりD-酸が得られる. L-酸は流出液を濃縮し,加水分解して, D-酸は溶離液を濃縮することにより結晶として単離出来る.
(4) 以上の方法でラセミ酸よりL-及びD-酸をそれぞれ結晶として分離し得た.この分割法は既知の酵素的なアミノ酸の光学的分割法に比べて操作も簡単で収率も良く,優れた方法であることを認めた.尚この反応とラセミ化反応を組合せてラセミ酸よりL-酸への完全な変換については現在検討中である.

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L-酸デヒドラーゼによるL-酸の脱水反応と,酸ラセマーゼによるラセミ化反応を組合せ同時に反応せしめることによって,ラセミ酸をL-ピロ酸を経てL-酸に変換せしめる方法について検討した.
L-酸デヒドラーゼとしてはPseudomonus cruciviaeの,また酸ラセマーゼとしては, Lactobacillus fermentiの凍結乾燥菌体を使用して実験を行い,以下のような結果が得られた.
この反応の最適pHは7.5,最適温度は37°で,酵素および基質濃度はl0mg/mlのP. cruciviaeの菌体と60mg/mlのL. fermentiの菌体を使用した場合, 15μM/mlのラセミ酸で約3～4時間で反応が終了する.酵素の濃度比は乾燥菌体としてP. cruciviae 1:L. fermenti 6が最適であった.
この反応によればラセミ酸を3～4時間の反応によって,その90～95%をL-ピロ酸を経て, L-酸にかえることができる.この場合の光学活性化率はほぼ100%であるが粗酵素資料中の他の酵素によると思われる全酸の減少が10～5%認められた.
以上酸ラセマーゼとL-酸の光学活性化は非常に良好な方法であることを確認した.

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(1) Pseudomonas cruciviae var. ovalisの生産するL-酸デヒドラーゼによるL-酸の酵素的脱水反応と, p-ニトロサルチルアルデヒドとCu++イオンを触媒とする酸に起さしめて, L-ピロ酸を光学的に活性化する事を試みた.
(2) Cu⁺⁺イオンとp-ニトロサルチルアルデヒドによる酸の非酵素的ラセミ化は非常に速く,その最適pH, 100°での反応で2時間にして完全にラセミ化される.その最適pHは10以上であり, pH3.0にやや反応率の高いpHがあるが,これはアミノ基の解離に原因するラセミ化と考えられる.この非酵素的ラセミ化では酸の一部が脱アミノ化されるようでその率は15%程度である.反応最小モル比は酸, p-ニトロサルチルアルデヒド, Cu⁺⁺イオンが1:0.1:0.1である.又反応速度は10°の温度の上昇で約2倍となる.ピロ酸に関してはどのような条件でもこの非酵素的ラセミ化反応は起らず,これはピロ酸がアミノ基を有さず,アルデヒド及びCu⁺⁺イオンと錯化合物の形成をせぬ事によると思われる.
(3) L-酸デヒドラーゼはかニトロサルチルアルデヒド及びCu⁺⁺イオンの存在下でもL-酸の脱水を行いL-ピロ酸を与える.併しこの場合酸, p-ニトロサルチルアルデヒド, Cu⁺⁺イオンのモル比は1:0.2:0.1が最適でこれ以外では活性が低下する.
(4) 上記両反応の組合せによるラセミ酸の光学活性化により,ラセミ酸はL-ピロ酸を経てL-酸に変換される.この活性化反応の最適pHは7.5,最適温度は60～70°,基質濃度は10mg/mlのP. cruciviaeの凍結乾燥菌体を使用した場合20OmMのラセミ酸濃度が最も良好であった.この活性化反応での酸, p-ニトロサルチルアルデヒド, Cu⁺⁺イオンの最適モル比は1:0.1:0.05であった.このモル比はL-酸デヒドラーゼの反応機構と関係があると考えられる.
(5) ラセミ酸の80%程度をL-ピロ酸を経て,これを加水分解してL-酸を得るが,この反応液中の酸は完全にL-異性体で活性化率は100%であるので,この収率80%は酸の非酵素的脱アミノ反応によると考えられる.それ故本方法による収率は80%程度が限度と思われるので,酵素物な特異的ラセミ化による方法を検討中である.

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(1) Bacillus属菌株79株についてD-酸のみを窒素源とする培地で検索を行った結果, B. subtilis 6株をはじめ28菌株がこの培地に生育した.
(2) この生育菌株の一部のアセトン乾燥菌体を使用してD-酸よりL-酸の生成を試験した所,二三菌株でその能力を認めたが,その内B. licheniformisの一菌株が他に比して強かったので,この酵素反応をアセトン乾燥菌体,超音波抽出液について検討した.
(3) この粗酵素試料によるD-酸よりL-酸への転換はピルビン酸の存在により増加しその傾向は透析酵素試料において甚しい.
α-ケトグルタール酸とD, LいずれのアラニンよりもD-酸のみを生成し, L-酸は殆んど生じないし,又L-酸よりD-酸の生成も殆んど起らない.ピルビン酸と酸とのアミノ基転移に関する実験からはL-酸を基質とする場合のアラニン生成量の約5～6倍のアラニンがD-酸を基質として使用する時生成する.
これ等の事実より本菌は強いアラニンラセマーゼを有しD-酸よりL-酸の生成はB. subtilisやB. anthracisにおいて報告されていると同様,アラニンラセマーゼとD-及びL-アミノ酸トランスアミナーゼの共同作用によって起るものと考えられる.尚この菌では,特にL-トランスアミナーゼに比べてD-トランスアミナーゼ活性がアラニンラセマーゼと共に強いため, α-ケトグルタール酸とアラニンよりD-酸のみを生成し,又L-酸よりはD-酸の生成が起り難いと考えられる.
このB. licheniformis以外のBacillus属菌株においても,同様な反応でD-酸よりL-酸の生成が行なわれるものと考えられ, Bacillus属菌株にはアラニンラセマーゼは存在するが,酸ラセマーゼは存在しないと思われる.

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