【目的】多くの哺乳動物において黄体は妊娠の成立・維持に必須の progesterone (P4) を分泌する。妊娠が不成立の場合，次の発情を回帰するため黄体は退行する。黄体の退行は機能的および構造的退行からなる。構造的退行は黄体細胞のアポトーシスによるものと知られているが，機能的退行機構には不明な点が多く残されている。げっ歯類の不完全性周期において，黄体細胞に P4 を生物活性のない 20α-dihydroprogesterone (20α-OHP) に代謝する酵素である 20α-hydroxysteroid dehydrogenase (20α-HSD) が発現するため，黄体は P4 分泌能を持たないとされている。ウマにおいては，aldo-keto reductase (AKR) superfamily の一つである AKR1C23 が 20α-HSD 活性を有すること，また黄体組織での 20α-OHP の存在が示されている。本研究はウマ黄体の機能的退行機構研究の一環として，黄体組織における AKR1C23 発現を検討した。【材料および方法】ウマの繁殖期である 4-7 月に熊本県の食肉センターより黄体を採取し，肉眼的所見により黄体初期，黄体中期，黄体後期および黄体退行期の 4 ステージに分類し、組織を解析に用いた。実験 1: 黄体周期を通じた組織中 P4 および 20α-OHP 濃度を EIA により測定した。実験 2: 黄体周期を通じた AKR1C23 mRNA 発現を定量的 RT-PCR 法により調べた。【結果】実験 1: 組織中 P4 濃度は黄体中期において最も高く，黄体後期および黄体退行期にかけて有意に減少した。一方，組織中 20α-OHP 濃度は黄体後期において他の周期に比べ有意に高かった。実験 2: AKR1C23 mRNA 発現量は黄体後期において黄体初期に比べ有意に高く，また黄体退行期において黄体初期および黄体中期に比べ有意に高かった。【考察】本研究において，黄体後期に組織中 P4 濃度の減少および 20α-OHP 濃度の増加，ならびに AKR1C23 mRNA 発現の増加が見られたことから，ウマ黄体の機能的退行には AKR1C23 による P4 の 20α-OHP への代謝が関与していると示唆された。

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【目的】黄体は妊娠の成立と維持に必須なプロゲステロンを産生するが，妊娠が成立しない場合，黄体は速やかに退行する。ウシやマウスでは，子宮より産生されるプロスタグランジンF（PGF）が黄体の退行開始に重要な役割を果たすが，子宮からのPGFはヒト黄体の退行に関与しない。ヒト黄体では，黄体細胞自身が産生する因子（TGFßスーパーファミリー蛋白）が黄体退行作用をもつが，黄体内におけるプロスタグランジンの作用は不明である。本研究では，ヒト黄体で産生されるプロスタグランジンの働きを検討した。【方法】英国エジンバラ大学にて患者の同意のもと採取した黄体周期を通じたヒト黄体組織および体外受精治療のためにエジンバラ大学もしくは北海道大学病院に来院した患者より提供された卵胞液を実験に用いた。黄体組織および分離培養した黄体化顆粒層細胞（LGCs）を用いて，リアルタイムPCR法と免疫組織化学により，遺伝子および蛋白質の発現を解析した。【結果】プロスタグランジンE（PGE）産生酵素（PTGES）は中期黄体で強く発現するが，PGF産生酵素（AKR1B1，AKR1C1−3）は後期および退行期黄体で発現が増強した。PGEは，ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）と同様に，黄体細胞におけるステロイドおよびPGE産生を刺激し，黄体退行因子の発現を抑制した。一方，PGFは顕著な作用を示さなかった。PTGESは顆粒層黄体細胞の細胞質に発現し，黄体組織におけるPTGESの発現はプロゲステロン合成酵素（HSD3B1）の発現と正の相関関係にあった。一方，PGF産生酵素であるAKR1C3は，PTGESおよびHSD3B1の発現と負の相関関係にあった。LGCsにおけるPTGESの発現は培養日数とともに減少するが，AKR1C3の発現は増加した。【考察】ヒトでは，黄体の退行に伴いPGE/PGF産生のバランスが変化することが明らかとなった。ヒト黄体の退行には，PGFの作用よりもPGE産生の低下がより重要であると考えられる。

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【目的】哺乳類において排卵後に形成される黄体は，妊娠が成立しなかった際に機能と構造を急速に失う (黄体退行)。Matrix metalloproteinases (MMPs) の主な作用は細胞外基質 (ECM) の分解であり退行期に黄体組織中の MMPs 発現が増加することが知られているが，MMPs の産生源，発現調節機構，さらに MMPs の生理的役割は不明である。我々は黄体退行時に黄体細胞がリンパ管を介して卵巣外へ流出することで黄体が急速に消失することを報告したが (PLoS One, 2014)，その機構は明らかでない。黄体細胞がリンパ管へ流出するためには黄体細胞が黄体組織から分離される必要があることから，本研究では黄体細胞が MMPs を産生分泌し，ECM を分解することでリンパ管へ流出するという仮説を立て，黄体細胞における MMPs 発現ならびに黄体退行因子の及ぼす MMPs mRNA 発現への影響を検討した。【方法】黄体退行因子として prostaglandin F2α (PGF)， 腫瘍壊死因子 (TNF) および interferon-γ (IFNG) に着目した。中期黄体より酵素的に単離した黄体細胞 (2.0×10⁵ cell/ml) に PGF (0.01, 0.1, 1 μM)，TNF (0.05, 0.5, 5 nM) および IFNG (0.05, 0.5, 5 nM) を添加し，24 時間後の MMP-1，MMP-2，MMP-9 および MMP-14 mRNA 発現を real-time RT-PCR 法を用いて調べた。【結果】黄体細胞における MMP-1 mRNA 発現は PGF ならびに IFNG によって有意に刺激された。MMP-9 mRNA 発現は PGF (0.01 μM) 添加区において濃度依存的に有意な上昇がみられた。PGF，TNF ならびに IFNG はMMP-2 および MMP-14 mRNA 発現に影響しなかった。本研究により黄体細胞に MMPs mRNA 発現が確認され，その発現は PGF ならびに IFNG によって刺激されることが明らかとなったことから，黄体細胞由来の MMPs が黄体細胞周囲の ECM を分解することで黄体細胞のリンパ管への流出を促進し，急速な黄体消失に貢献している可能性が示された。

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ホルスタイン種乳牛における黄体形成およびプロジェステロン分泌機能を評価するため, 発情後8～10日に超音波画像診断装置を用いて卵巣を観察し, 描出された黄体組織面積 (黄体面積より黄体内腔面積を減じた), 黄体内腔の有無および大きさと血中プロジェステロン値 (P₄値) との関係を調査した.供試した154例のうち153例に黄体が存在し, それらの血中P₄値はいずれも1ng/ml以上であった.血中P₄値は黄体組織面積が3cm²未満のもので低く, その面積が増えるに連れて高くなった.黄体内腔の存在および大きさは黄体組織面積や血中P4値に影響しなかった.以上のように, 黄体組織面積が大きくなるに連れて血中P₄値が高くなり, 超音波画像診断装置による黄体組織面積の測定は黄体のプロジェステロン分泌機能の評価に有用なことが示唆された.

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【目的】黄体ステロイド合成細胞 (LSC) に分化する前の卵胞顆粒層および卵胞内膜細胞は増殖能を有するが、黄体化することにより増殖能は失われると考えられている。このことから、排卵後の黄体の成長は LSC の増殖ではなく、細胞サイズの増加であると考えられている。しかし、黄体の成長機構は不明な点が多く詳細は明らかではない。本研究では、ウシ黄体の形成機構を明らかにする目的で、LSC の増殖能について検討を行うと共に、黄体化誘導因子である黄体形成ホルモン (LH) の LSC の増殖能に及ぼす影響についても併せて検討した。【方法】LSC の増殖能を評価するため、1) 発情周期を通じた黄体組織における Ki-67 (細胞増殖マーカー) 発現を免疫組織化学により調べた。2) 発現が認められた周期について、Ki-67 と LSC の指標となる HSD3B の二重染色を行った。3) LSC の増殖能を評価するため、形成期および中期黄体から LSC を単離し、その増殖能を DNA assay により調べた。4) LSC の増殖能に及ぼす LH の影響を検討するため、形成期および中期黄体から単離した LSC に LH を添加し、細胞の増殖性を DNA assay により調べると共に細胞周期調節因子発現 (CCND2、CCNE1、CDKN1A および CDKN1B) を定量的 RT-PCR 法で調べた。【結果】初期、形成期、中期黄体において、Ki-67 陽性細胞が確認された。HSD3B と Ki-67 の共発現は初期、形成期および中期黄体で確認され、中期黄体と比較して初期および形成期黄体で共発現細胞数が多かった。形成期および中期黄体から単離した LSC のDNA 含量は共に増加したが、形成期 LSC のDNA 増加率が有意に高かった。また、LH 添加により中期黄体 LSC の DNA 増加率のみ減少した。形成期黄体 LSC の細胞周期調節因子は LH の影響を受けなかったが、中期黄体 LSC の CCND2 mRNA 発現は LH により抑制された。本研究より、ウシ LSC は増殖し、LSC の増殖は初期黄体、形成期黄体で活発であること、また LH は CCND2 発現を抑制することにより、LSC の増殖能を調節する可能性が示唆された。

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【目的】黄体は妊娠の成立と維持に必須なプロジェステロンを産生する一時的な内分泌組織で，排卵後の卵胞より形成される。妊娠が成立しない場合，黄体は速やかに退行するが，そのメカニズムは未だ不明な点が多い。本研究では，ウシの退行期黄体に出現する動静脈吻合に類似した構造物の形成過程を明らかにし，この構造物の形成がウシ黄体の退行メカニズムにどのように関与するかを明らかにすることを目的とした。【方法】ウシの黄体組織（中期: Days 8–12，後期: Days 15–17，退行期: Days 19以降）を4%PFAにて一晩浸漬固定し，常法に従いパラフィンに包埋した。パラフィン切片を作製し，HE染色および血管平滑筋マーカーのα-smooth muscle actin（SMA）に対する抗体を用いて免疫染色を行った。【結果】ウシ退行期黄体のうち，直径1 cm以下の黄体組織をHE染色により観察したところ，厚い壁をもち，蛇行して走行する血管構造が充満していた。抗SMA抗体により染色すると，血管構造の壁が強く染色された。SMA陽性の細胞はふくらみを増し，上皮様の形態を示しており，皮下組織に見られる動静脈吻合の形態に類似していた。この動静脈吻合類似の構造物の形成過程を明らかにするため，中期，後期，および退行期のウシ黄体組織をSMA染色し，血管構造を観察した。SMA陽性の細胞は中期黄体では黄体周辺部の太い血管の中膜で認められるほか，黄体組織内に散在していた。後期黄体では，黄体組織内におけるSMA陽性細胞の数が増加し，黄体周辺部の太い血管や黄体組織内を走行する中程度の太さの血管周辺に集積していた。また，黄体組織内の小血管の壁も膨らみを増したSMA陽性細胞により包まれていた。【考察】黄体の退行に伴い，SMA陽性細胞が血管を取り囲むことにより，動静脈吻合様の構造物が形成されることがわかった。虚血は黄体の退行を引き起こすことが知られているが，SMA陽性細胞の血管周囲への集積が，黄体退行時に認められる虚血性変化の一要因となる可能性が考えられる。

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【目的】ウシ黄体はプロジェステロン（P4）を産生することで妊娠成立・維持に重要な役割を果たす。黄体形成期に黄体機能（P4濃度）が低下した場合は胚由来のインターフェロンタウ産生が低くなり，妊娠認識不備による不受胎に繋がる可能性がある。一般的に，母体の加齢に伴い妊孕性が低下する。Malhiら（Biol Reprod 2005）は，ウシ（ヘレフォード）の加齢に伴う血中P4濃度の低下を報告したことから，黄体機能低下が妊孕性低下に影響する可能性が考えらえる。本研究では，ウシ（黒毛和種，ホルスタイン種）における月齢依存的な黄体機能の変化を検証した。【方法】食肉センターで黒毛和種またはホルスタイン種の卵巣を採取した。黒毛和種は62カ月齢以下を若齢区（平均30カ月齢），140カ月齢以上を老齢区（平均185カ月齢）に，ホルスタイン種は60カ月齢以下を若齢区（平均42カ月齢），100カ月齢以上を老齢区（平均120カ月齢）に分類した。黄体は初期，中期，後期，退行期に区分した（発情=Day 0，各期n=8–10）。黄体組織重量を測定し，組織からタンパク質およびRNAを抽出し，黄体組織中のP4濃度およびP4合成関連遺伝子発現を測定した。【結果】黄体組織重量は両種とも黄体初期から中期にかけて増加し，後期から退行期で減少した。黄体組織中P4濃度は黄体期初期から後期で一定し，退行期で低下した。黒毛和種では黄体期初期における組織中P4濃度が老齢区と比較して若齢区で高かった。黄体組織中P4濃度はホルスタイン種に比べて黒毛和種で高かった。P4合成酵素（StAR，P450scc，3βHSD）mRNA発現は黄体期初期から中期で増加し，後期から退行期で減少した。黒毛和種では黄体期初期から後期にかけて，3βHSD mRNA発現が老齢区に比べて若齢区で高い値で推移した。ホルスタイン種では若齢区と老齢区における差は見られなかった。以上から，黒毛和種は黄体期初期において老齢区でP4合成能力が低下する可能性が示され，年齢依存的な黄体機能変化の解析モデルになり得ると考えられた。

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【目的】雌ウシならびにヤギにおいて黄体退行時に血中testosterone（T）濃度が一時的に上昇する。また，ヤギへのT合成阻害剤投与によってTの血中の濃度上昇を抑制すると，黄体の寿命が延長することから，Tは黄体退行に関与すると考えられている。このようにTが黄体退行に関与することが示唆されているが，そのメカニズムは明らかではない。本研究では，ウシ黄体退行機構を解明することを目的とし，発情周期を通じた黄体組織におけるTの受容体であるandrogen receptor (AR) mRNA発現の変化ならびに中期および後期黄体細胞の機能に及ぼすTの影響について検討した。【方法】食肉センターより採取した卵巣を肉眼的所見により排卵日を0日として，初期（Days 2–3），形成期（Days 5–6），中期（Days 8–12），後期（Days 15–17）および退行期（Days 19–21）に分類した。その後，各周期の黄体組織におけるAR mRNA発現量を定量的RT-PCR法により検討した。また，中期および後期黄体から単離した黄体細胞を一晩培養後，T（10，100および1000 pg/ml）を添加し，24および48時間後の上清中progesterone（P4）濃度をenzyme immunoassay（EIA）により，細胞生存率をMTT assayにより測定した。【結果および考察】発情周期を通じた黄体組織におけるAR mRNA発現量は，初期および形成期と比較して後期において有意に高かった（P<0.05）。中期および後期黄体細胞における24および48時間培養上清中P4濃度においてTの影響は認められなかった。また，中期黄体細胞における細胞生存率は，いずれの培養時間においてもTの影響は認められなかった。一方，後期黄体細胞における細胞生存率は，24時間培養した実験区ではTによる影響は認められなかったが，48時間において無添加区と比較して，T添加区（100および1000 pg/ml）において有意に減少した（P<0.05）。本研究より，黄体退行時に上昇する血中Tは後期黄体に作用し黄体細胞の生存性を減少させることが明らかとなり，Tが構造的黄体退行に関与する可能性が示された。

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(目的) 黄体は，その内外で産生される黄体刺激および黄体退行因子によって機能を調節し，妊娠の成立に必須のprogesterone (P4) を産生する一過性の内分泌器官である。Galectin-1 (GAL1) は，細胞表面の糖鎖を介して様々な細胞機能の調節に関与することが知られている。しかし，黄体におけるGAL1の機能および作用機序は明らかにされていない。本研究では，ウシ黄体におけるGAL1の役割を明らかにするために，発情周期を通じた黄体のGAL1発現量の変化を調べるとともに黄体におけるGAL1の機能を調べた。(方法) 1. 黄体の発情周期を通じたGAL1タンパク質発現を調べた。2. 細胞表面上でGAL1が糖鎖と結合しているかどうかを調べるために，培養黄体細胞にLactoseまたはSucroseを添加し，GAL1の細胞表面での発現量を調べた。3. 培養黄体細胞にGAL1を添加し，細胞生存率およびP4 分泌への影響を調べた。4. 糖たんぱく質であるVEGFR-2は黄体細胞で発現し，細胞の生存に関与することからGAL1の標的分子となることが考えられるため，黄体の発情周期を通じたVEGFR-2のmRNAおよびタンパク質発現の変化を調べた。5. VEGFR-2の発情周期を通じた糖鎖修飾についてレクチンブロットにより検討した。(結果) 1. GAL1発現は中期の黄体組織で高かった。2. GAL1はLactose処理により細胞表面における発現が減少した。3. 中期黄体細胞の生存率およびP4分泌はGAL1添加により増加した。4. 黄体におけるVEGFR-2 mRNA発現は退行期を除いて高かったがタンパク質発現は中期で高かった。5. VEGFR-2はDSAレクチンと反応した。(まとめ) VEGFR-2タンパク質はGAL1と同様に中期黄体で発現が高く，GAL1結合性の多分岐型糖鎖で修飾されていた。また，GAL1はLactoseにより発現が減少したことから，細胞表面上のタンパク質と糖鎖を介して結合していることがわかった。これらのことより，GAL1がVEGFR-2を含む膜タンパク質糖鎖を介して結合し，P4分泌および生存シグナルを調節することによって黄体細胞の生存率を上昇させ，黄体機能を維持する役割を担っている可能性が示された。

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【目的】ウシの妊娠は排卵した卵巣側の子宮角で成立する。本研究では，妊娠黄体または妊娠子宮角が，同側および反対側卵巣における卵胞波の出現やGnRH製剤投与により形成された副黄体の維持に及ぼす局所的な影響を検討した。【方法】実験1：人工授精により妊娠したホルスタイン種33頭の経直腸超音波検査所見を解析した。D6～60（発情日=D0）まで6日間隔で1 cm以上の卵胞の位置および直径を記録し，主席卵胞（DF）および卵胞波を同定した。各卵胞波は，黄体と同側群および反対側群に分類した。また，DF径を群間および卵胞波間で比較した。実験2：我々が考案した繁殖プロトコル（前回大会で報告）が実施され，妊娠に至ったホルスタイン種14頭の超音波検査所見を解析した。この繁殖プロトコルでは，人工授精後23日目のGnRH製剤投与によって副黄体形成が誘導される。D23，D35～45およびD60における初期黄体面積および副黄体面積を測定した。D35～45において，初期黄体と同側卵巣内に副黄体が形成された個体を同側群（n=6），反対側に形成された個体を反対側群（n=4）および形成されなかった個体を対照群（n=4）とした。D35～45における副黄体面積およびD60における副黄体維持率について，同側群と反対側群で比較した。また，初期黄体面積については3群間および試験日間で比較した。【結果】実験1：W1（第1卵胞波）を対照値（51.5%）とした黄体同側率は，W4以降で有意に（P<0.05）低下した。一方でDF径は群間および卵胞波間で有意差を認めなかった。実験2：副黄体維持率は，反対側群（0%）と比較して同側群（83.3%）で有意に（P<0.01）高かった。一方で，D35～45における副黄体面積は同側群と反対側群で差はなかった。また，初期黄体面積は3群間および試験日間で有意差を認めなかった。以上より，妊娠黄体または妊娠子宮角と同側の卵巣内において，主席卵胞選抜が抑制的に，副黄体維持が促進的に制御されていることが明らかとなった。

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【目的】Epidermal growth factor receptor（EGFR）に結合するN型糖鎖上のcore fucoseは，epidermal growth factor（EGF）のEGFRへの結合に重要である。EGFは黄体細胞の生存を維持し，EGFRへの結合親和性は機能黄体において高いことから，黄体においてもEGFRの黄体維持作用にcore fucosylationの関与が考えられる。本研究では，1） 発情周期を通じたウシ黄体のcore fucosylationレベルとfucose含有糖タンパク質の局在，2） 黄体細胞のEGFR糖鎖のcore fucosylationの有無，3） EGFの黄体機能維持作用に及ぼすcore fucosylationの影響を検討した。【方法】1） 発情周期を通じた黄体（初期：Days 2–3，形成期：Days 5–6，中期Days 8–12，後期：Days 15–17，退行期：Days 19–21）の膜画分のcore fucosylationレベルをfucoseを認識するAALレクチンを用いて検討し，fucose含有糖タンパク質の局在を解析した。2） 中期黄体細胞から免疫沈降法によりEGFRタンパク質を回収後，core fucosylationの有無を調べた。3） 中期黄体細胞にα-fucosidase（0.01，0.1 units/ml）を添加してcore fucoseを切断し，16時間後のcore fucosylationレベル，上清中のprogesterone（P4）濃度と生存率を検討した。黄体細胞にα-fucosidase（0.1 units/ml）とEGF（5，10 ng/ml）を単独又は組み合わせて添加し，24時間後のP4濃度と生存率を調べた。【結果】1） 黄体の糖タンパク質のcore fucosylationレベルは後期，退行期と比較して，初期，形成期と中期に高く，fucose含有糖タンパク質は黄体細胞に局在した。2） 黄体細胞のEGFR糖鎖はcore fucosylationを受けていた。3） 黄体細胞の糖タンパク質のcore fucosylationレベルと生存率は，α-fucosidase添加区において減少し，P4産生に変化はなかった。EGFによる生存率の増加は，α-fucosidaseの共添加により減少し，P4産生に変化はなかった。以上より，EGFの黄体機能維持作用にEGFRのcore fucosylationが重要であり，core fucosylationの低下が黄体の構造的退行に関与する可能性が示された。

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非繁殖季節に発情誘起し,人工授精された10頭の雌羊において,発情後5日目から25日目まで5日毎に計5回ラパロスコープを用いて卵巣観察を行ない,再発情の有無,および各観察時のP₄濃度と比較検討した。
1頭で黄体が認められなかった。またこれを除く9頭中3頭が非繁殖季節における1回のホルモン処置によって受胎した。
黄体が観察された9頭を卵巣変化によって3群にわけた。すなわち,1群(4頭):20日目までに黄体は消失した,II群(3頭):25日目まで黄体が存在し,受胎した,III群(2頭):20日目に新生黄体が認められたものである。黄体の色調変化は繁殖季節において報告されているものとほぼ一致した。黄体機能の変化の指標とした黄体の大きさや形態よりも色調によるものの方がよいことが示唆された。

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【目的】腟内留置型黄体ホルモン製剤（CIDR）は 12 日間腟内へ留置することで発情が同期化される。CIDR留置により，黄体はプロジェステロン（P4）の分泌能を失うとともに退行するが，その様相について詳細な報告はない。最近我々はカラードプラで測定される黄体周囲の血流（LBF）から黄体機能の推定が可能であることを報告した。本研究では CIDR 留置中の黄体機能の変化を精査することを目的とし，CIDR 留置中の黒毛和種繁殖牛における LBFならびに黄体直径の推移について調べた。【方法】発情日を 0 日として 10 日目（10 日区: n=4）または 16 日目（16 日区: n=5）の黒毛和種繁殖牛に CIDR を挿入し，12 日間留置した。CIDR 挿入日を基準日（Day 0）とし，各区の Day 1 から Day 12 における黄体直径ならびに LBF をカラードプラによって測定するとともに，黄体の退行開始日を比較検討した。【結果】全ての試験牛において，CIDR 抜去後 4 日以内に発情が発現した。10 日区において，LBF は CIDR 留置後一旦上昇し，Day 6 でピークを迎えた後，減少した。一方 16 日区において LBF は Day 3より減少をはじめ Day 7 において消失した。黄体直径はいずれの区においても CIDR 留置開始日より減少を開始したが，16 日区における減少が顕著であり，Day 4 から Day 12 において，10 日区の黄体直径は 16 日区の直径と比較し有意に大きかった（P<0.05）。また，黄体退行を反映するカラードプラ面積の減少が認められた日数は 10 日区と比較し 16 日区において有意に早く（P<0.01），それぞれ Day 8.75±0.5 ならびに Day 2.8±0.4 だった。これらの黄体退行開始日は発情周期ではいずれも 19 日前後に相当し，黄体の寿命は CIDR の影響を受けていないことが示唆された。本研究の結果より，黒毛和種において CIDR 留置により黄体の P4 分泌能は緩徐に低下するが，黄体の寿命は発情周期に依存することが示唆された。

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