2022 Volume 71 Issue 4 Pages 748-753
症例は60代女性。右下腿開放性骨折受傷後に脛骨慢性骨髄炎を発症した。各種抗菌薬の投与，病巣搔爬，抗菌薬含有人工骨やセメントビーズ留置が5回施行された。受傷4年6ヶ月後，慢性骨髄炎の根治目的に今回の入院となった。病巣搔爬術が施行され，嫌気性菌，ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌を検出。複数の抗菌薬投与の後，第45病日以降の骨周囲培養から，Staphylococcus capitis subspecies urealyticusが分離された。寒天平板希釈法および微量液体希釈法での薬剤感受性試験の結果，vancomycin（VCM），teicoplanin（TEIC），daptomycin（DAP）で高いMIC結果を得た（それぞれ4，64，2 μg/mL）。DAP投与歴は無いがDAP非感性を示した。第76病日よりlinezolidの投与を開始後，解熱，白血球数低下と創部の肉眼的所見の改善が見られ，第79病日に骨周囲培養の陰性化を確認，第133病日に退院となった。本症例は受傷2年2ヵ月後にVCM含有人工骨留置を行っており，その際，高濃度のVCMに曝露されたことで細胞壁が肥厚し感受性が低下した株が選択された可能性が考えられる。本症例のように過去にVCMやTEICの局所投与歴があり，同薬に感受性が低下した菌が分離された際は，DAP投与歴が無くとも薬剤感受性試験を実施し，微生物学的有効性を推定して投薬を判断することが重要であると考えられた。
A female in her 60s suffered from chronic osteomyelitis of the tibia after injury resulting in an open fracture of the right lower leg. She was treated with various antibacterials and by curettage of the lesion and artificial bone implantation after indwelling cement beads containing antibacterials five times over four years and six months. The patient was admitted to our hospital for radical cure of her chronic osteomyelitis. Staphylococcus capitis subspecies urealyticus was isolated from the lesion on day 45 of hospitalization. Antibacterial susceptibility testing based on the agar dilution method and/or broth microdilution method showed high minimum inhibitory concentrations (MICs) of vancomycin (VCM), teicoplanin (TEIC), and daptomycin (DAP) (4, 64, and 2 μg/mL, respectively). The patient had no history of DAP administration, but the bacterial isolate was not susceptible to DAP. With linezolid administration since day 76, her fever was relieved, the white blood cell count declined, and the macroscopic findings of the wound were improved. The periapical culture was confirmed to be negative for the bacterium on day 79, and the patient was discharged on day 133. In this patient, VCM-containing artificial bone implantation was performed two years and two months after the injury. A long-term exposure to VCM-containing artificial bone implantation might have selected for these bacteria with low susceptibility to VCM, displaying thickened cell walls, which might have resulted in the reduced susceptibility to DAP. When a bacterium with reduced susceptibility to VCM or TEIC was isolated from a patient with a history of long topical exposure to these antibacterials as in this case, it would be important to predict the efficacy of DAP before administration, even if the patient has no history of DAP administration.
Staphylococcus capitisは，コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属（coagulase negative staphylococci; CNS）に含まれ，ヒトの皮膚・粘膜に常在する菌である。一般にStaphylococcus lugdunensisを除くCNSの病原性は，Staphylococcus aureusと比較すると低く，健常人で感染症の原因となることは殆どないが，骨髄炎や外傷後骨髄炎においては主要な起因菌の一つと報告されている1),2)。
CNSはmethicillin-resistant CNS（MR-CNS）の増加に伴い，治療にはmethicillin-resistant S. aureus（MRSA）治療薬も選択肢の一つとされている1)。その中で，daptomycin（DAP）は我が国では2011年にMRSA感染症の治療薬として承認された環状リポペプチド系抗菌薬であり，Ca2+存在下でグラム陽性菌の細胞膜に結合し，K+を流出させ細胞膜が脱分極することにより，速やかに殺菌すると考えられている3)。
DAP非感性S. aureusの機構の一つとしては，mprF遺伝子変異が報告されている4)。
本邦におけるDAP非感性MRSAについては複数例報告も認められるようになってきた5)が，CNSのDAP非感性報告は未だ稀である6)。
今回我々は，DAP未使用にもかかわらずDAP非感性を示したS. capitis subspecies urealyticusによる治療に難渋した慢性骨髄炎の1例を報告する。
症例：60歳代，女性。
現病歴：20XX年，交通事故を機に右下腿開放性骨折（Gustilo分類Type III B）を受傷し創外固定術を，受傷3ヶ月後に脛骨観血的骨接合術が施行された。創外固定ピン刺入痕からの滲出が持続し，脛骨骨髄炎を発症した。受傷10ヶ月後，プレートの折損を認め偽関節手術・自家骨移植，プレート固定が施行された。術後，創部に瘻孔を形成し滲出液が持続，慢性骨髄炎と診断された。感染制御を目的に受傷1年11ヶ月後から7か月間，各種抗菌薬の投与や病巣搔爬術，抗菌薬含有人工骨やセメントビーズ留置等が5回に渡り施行された。局所治療で投与された抗菌薬をTable 1に示した。
| date of treatment following injury | detention period days | antibacterials used | treatment |
|---|---|---|---|
| 1 year 11 months | 21 | MINO 400 mg | placement of antibiotic-containing cement beads |
| 2 years 0 months | 29 | MINO 600 mg | placement of antibiotic-containing artificial bone |
| 2 years 1 month | 19 | MINO 600 mg + MEPM 3.0 g | placement of antibiotic-containing artificial bone |
| 2 years 2 months | 119 | VCM 1.0 g + CMZ 2.0 g + MINO 200 mg | placement of antibiotic-containing artificial bone |
| 2 years 6 months | 36 | MEPM 3.0 g | placement of antibiotic-containing cement beads |
MINO, minocycline; MEPM, meropenem; VCM, vancomycin; CMZ, cefmetazole.
受傷2年7ヶ月後に抗菌薬含有セメントビーズ抜去，閉創術が施行されたが，再度瘻孔を形成，創処置が継続された。受傷3年2ヶ月後，瘻孔からの滲出液が持続，処置とlevofloxacinやminocycline，amoxicillin/clavulanateの抗菌薬投与にて改善が認められないことから，受傷4年6ヶ月の時点で根治手術を目的に今回の入院となった。
今回の入院後経過（Figure 1）：入院第2病日に骨内の病巣掻爬術が施行された。手術時に採取された骨培養より，Peptostreptococcus spp.，Fusobacterium spp.，Bacteroides vulgatus，Prevotella oris，Corynebacterium spp.，ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌が多量に検出されたため，開放創とし連日創部と骨髄内を滅菌生食水による洗浄がなされた。術後から第12病日までimipenemとclindamycinの併用療法，第13病日から第30病日までdoripenemが投与された。
※1 Bone culture, Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp., Bacteroides vulgatus, Prevotella oris, Corynebacterium spp., Glucose NF-GNR.
※2 Culture from the wound around the bone, Corynebacterium spp.
※3 Culture from the wound around the bone, S. capitis subsp. urealyticus (isolate no.), Corynebacterium spp.
※4 Culture from the wound around the bone, S. capitis subsp. urealyticus, S. epidermidis, Corynebacterium spp.
※5 Blood culture, negative.
※6 Culture from the wound around the bone, negative.
IPM, imipenem; CLDM, clindamycin; DRPM, doripenem; CEZ, cefazolin; CTRX, ceftriaxone; LZD, linezolid;
VAC, vacuum assisted closure therapy; BT, body temperature.
第37病日，髄腔の掻把が施行され，合わせて血流改善を目的として脛骨皮質骨にドリリングがなされた。第39病日より不良肉芽の改善を目的として陰圧閉鎖療法（vacuum assisted closure therapy; VAC）を開始，創部洗浄は週2回に変更され，第40病日から第52病日までcefazolinが投与された。
第45病日の骨周囲の創部培養より，Corynebacterium spp.に加えS. capitis subsp. urealyticusが検出されるようになった。第61病日にVACを中止し，連日洗浄に変更した。第68病日より38℃台の発熱，CRP値3.82 mg/dLと上昇が認められたため，ceftriaxoneが2日間投与された。その後も37～38℃台の発熱が認められたため，第76病日よりlinezolid（LZD）の投与が開始された。LZD投与後に，解熱，白血球数低下と創部の肉眼的所見の改善が認められ，第79病日に骨周囲の創部培養が陰性化した。第93病日に閉創術，第107病日に植皮術が施行され，脛骨慢性骨髄炎は完治し第133病日に退院となった。
第51病日（KI-1），56病日目（KI-2），61病日目（KI-3），67病日目（KI-4）の骨周囲の創部培養より分離された菌株を検査した。API Staph（ビオメリュー・ジャパン）による生化学検査でのMaltose分解性（+），Trehalose分解性（−），Urease（+）などの結果をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology（2nd Edition, Springer, New York）と照合し，16S rRNA領域遺伝子配列解析結果から，S. capitis subsp. urealyticusと同定した。これら4株の生化学検査および16S rRNA配列情報は100%一致した。
2． 薬剤感受性試験薬剤感受性は，MicroScan Pos Combo 1T panelにてMicroScan walkaway 40 plus（ベックマン・コールター）を用いて測定した。また，DAPはCa2+を50 mg/Lに調整したcation-adjusted Mueller-Hinton broth；CAMHB（日本ベクトン・ディッキンソン，以下日本BD）微量液体希釈法にて，vancomycin（VCM），teicoplanin（TEIC），LZDは寒天平板希釈法（Mueller-Hinton agar；日本BD）でも最小発育阻止濃度（MIC）を測定し，ブレイクポイントはClinical and Laboratory Standards Institute M100, 29th Edition（CLSI M100, 29th ed.）に従った7)。
KI-1～-4全てにおいてoxacillin，gentamicin，minocycline，levofloxacinに耐性を示した。DAPのMICは2 μg/mLであり非感性であった。TEICはMICが64 μg/mLを示し耐性，VCMのMICは4 μg/mLを示し感性であったが，その上限の値を示し高めであった。LZDは感性であった（Table 2）。
| isolate no. | days | MIC (μg/mL) | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ※1 | ※2 | ※3 | |||||||||||
| MPIPC | GM | MINO | LVFX | LZD | VCM | TEIC | DAP | LZD | VCM | TEIC | DAP | ||
| KI-1 | 51 | > 4 | > 8 | > 8 | > 4 | 2 | 4 | > 16 | > 1 | 2 | 4 | 64 | 2 |
| KI-2 | 56 | > 4 | > 8 | > 8 | > 4 | 2 | 4 | > 16 | > 1 | 2 | 4 | 64 | 2 |
| KI-3 | 61 | > 4 | > 8 | > 8 | > 4 | 2 | 4 | > 16 | > 1 | 2 | 4 | 64 | 2 |
| KI-4 | 67 | > 4 | > 8 | > 8 | > 4 | 2 | 4 | > 16 | > 1 | 2 | 4 | 64 | 2 |
※1 Method by MicroScan walkaway 40 plus System.
※2 Method by agar dilution.
※3 Method by broth dilution.
MPIPC, oxacillin; GM, gentamicin; MINO, minocycline; LVFX, levofloxacin; LZD, linezolid; VCM, vancomycin; TEIC, teicoplanin;
DAP, daptomycin; Bold, not susceptible according to CLSI M100, 29th ed.
KI-1～-4についてNational Center for Biotechnology Informationに公開されているS. capitis LNZR-1（GenBank Accession No. NZ_JGYJ01000079.1）のゲノム情報に基づいて，mprF領域のPCRプライマーを作成し，既報8)の条件により核酸抽出，PCR産物をQIAGEN PCR Purification Kit（QIAGEN）で精製し，シークエンス解析を行った。
結果，KI-1～-4全てDAP非感性でないS. capitis LNZR-1のMprFと100%一致し，変異は認められなかった。
現在，DAP非感性CNSの報告は稀な状況である。
海外におけるS. capitisを含めたCNSのDAP感性率の報告は，Saderら9)は2002年から9年間に分離されたCNS 22,024株の99.8%がDAP感性であり，S. capitisは，490株中DAP非感性は5株でDAP感性率は99.0%と報告している。また，Saderら10)は2014年から6年間に分離されたCNS 5,088株の99.9%がDAP感性であり，S. capitisは，267株中DAP感性率は100%であったと報告している。
一方，Jiangら11)は2009年から2012年の4年間に分離されたCNS 2,484株のDAP非感性率が2009年，2010年，2011年，2012年にそれぞれ0，4，6，4%と増加しており，要因としてDAP使用量増加を挙げている。また，無作為にDAP非感性を示したCNS 16株を選択し解析した結果，S. capitisが大半を占めていたと報告している11)ことより，MR-CNSへの治療を考える上でメカニズムも含めた今後の動向が注目される。
本邦におけるCNSのDAP感受性状況は，厚生労働省院内感染対策サーベイランス検査部門12)にCNSのDAP感性率の記載は無く，また我々が2021年9月までに医学中央雑誌およびPubMedで検索したが，CNSを対象にしたDAP感受性調査報告は確認できなかった。
症例報告としてHagiyaら6)により心血管デバイス感染症の患者にDAP投与中に非感性化したS. capitis subsp. urealyticusによる2症例の報告が1報認められたが，本邦においてDAP未使用にもかかわらずDAP非感性を示したS. capitis subsp. urealyticusの報告はなく，本症例が初めての報告となる。
S. capitis subsp. urealyticusが第45病日の培養より分離されるようになった要因として，第2病日に術中採取された骨培養では嫌気性菌とCorynebacterium spp.が，第10病日から第42病日の骨周囲の創部培養ではCorynebacterium spp.が多量に発育したため，発育速度が遅いS. capitis subsp. urealyticusの分離が困難であったことが考えられる。創部洗浄を連日実施し，Corynebacterium spp.の菌量が減少した第45病日の骨周囲の創部培養よりS. capitis subsp. urealyticusが分離可能となった。
当時使用していた同定・薬剤感受性測定パネルではDAPの感受性が測定できず，DAP投与案が出たことによりDAPの薬剤感受性が測定可能なMicroScan Pos Combo 1T panelを準備できたのが第51病日の骨周囲の創部培養からであり，その際DAPに非感性を示したことで，注目することとなった。
DAP非感性化のメカニズムとしてS. aureusにおいては，細胞膜の陽性チャージが増えることと細胞壁の肥厚が挙げられている4)。細胞膜の陽性チャージを増すことでDAPが細胞膜に結合できなくなり，その結果，DAP感受性が低下すると考えられている4)。この細胞膜の陽性チャージ変化はいくつかの遺伝子変異が関与しているが，中でもリジルホスファチジルグリセロール合成酵素をコードするmprFの変異による細胞膜上の電荷の変化は，DAP非感性化の主要な要因と報告されているためmprF解析を行った。今回解析したS. capitisのmprF遺伝子から推測されるMprFのアミノ酸配列はゲノム解析されたS. capitis LNZR-1のMprFのアミノ酸配列13)と100%一致し，LNZR-1株はDAP感性であるため14)，本症例で得られた菌株ではDAP非感性化にはMprFタンパク質の影響はないと考えられた。
さらに，我々が注目した点はKI-1～-4のVCM，TEICのMICが4 μg/mL，64 μg/mLと高値を示していたことである。DAPの非感性機序としては，mprFの変異等による膜電荷の変化のほかに，グリコペプチド系抗菌薬の曝露や耐性度との相関が指摘されており，要因の一つとして細胞壁の肥厚が複数報告されている4),15),16)。本症例では受傷2年2ヶ月後に人工骨補填材にVCM 1 gを混入し作成した人工骨留置を施行されていた。金城ら17)は骨セメント40 gにVCM 2 g混入して作成したセメントビーズを留置しVCMの局所濃度を術後24時間，7日，14日で測定したところ，それぞれ85.23，9.34，3.69 μg/mLと高濃度であったと報告している。本症例においてもVCM含有人工骨留置の際，高濃度のVCMに曝露されたことにより，細胞壁の肥厚が生じ，グリコペプチド系抗菌薬のMICが上昇したS. capitis subsp. urealyticusが選択され，それに伴いKI-1～-4のDAPのMICが上昇したことがDAP非感性の要因の1つと推測された。細胞壁の肥厚については本研究では検討できていないため，これらの検討は今後の課題である。
整形外科領域における化膿性関節炎や慢性化膿性骨髄炎などの深部感染症の治療として抗菌薬が使用されるが，全身投与の他に組織移行性の観点から局所的治療として抗菌薬含有セメントビーズや抗菌薬含有骨ペースト充填・人工骨留置が行われている18),19)。高濃度の抗菌薬の溶出を病巣内で期待できるという利点がある反面，長期間留置による耐性菌出現の問題も指摘されている18)。耐性化のメカニズムや交叉耐性への影響についてさらに解明が進むことが望まれる。
本事例では過去にグリコペプチド系抗菌薬の局所投与歴があり，グリコペプチド系抗菌薬に感受性が低下した菌がDAPにも非感性を示した。従ってグリコペプチド系抗菌薬への感受性が低下している場合は，DAPの投与歴が無くても経験的なDAP投与は行わず，当該抗菌薬の薬剤感受性試験を実施し，微生物学的有効性を推定してから投与をするか否かの判断が重要であると考えられた。
本論文の主旨については第26回日本臨床微生物学会において発表した。
本研究は，当院の倫理委員会の承認を得て実施された（承認番号：220301）。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
稿を終えるにあたり，菌株解析など技術的協力を頂きました名古屋大学大学院医学系研究科 分子病原細菌学 岡村奎太氏に深謝致します。
