2024 Volume 159 Issue 5 Pages 295-299
経口投与薬の開発において，消化管吸収率の定量的予測や，薬物誘導性消化器障害のリスク予測は必須の項目の一つである．これまで動物in vivo実験による予測では，結果に大きな種差が観察されるケースがしばしばみられることが報告されている．また，消化管関連のアッセイ系で最も創薬上繁用される大腸がん不死化細胞株Caco-2細胞を用いた実験では，トランスポーター・代謝酵素の遺伝子発現プロファイルが小腸の吸収上皮細胞とは必ずしも一致していないことに起因して，特にトランスポーター・代謝酵素の基質薬物に関してin vitro実験系より予測された消化管吸収性は，in vivoでの吸収率を反映しないケースが複数報告されている．そこで我々は，ヒト／動物crypt由来の消化管幹細胞培養系を創薬スクリーニング系として活用すべく，過去の報告に従い3D培養系を構築すると共に，細胞を単離後2D展開することで，旧来と同じ実験フォーマットでアッセイを実施することが可能となった．幹細胞由来の分化吸収上皮細胞には，ヒト消化管と同レベルの代謝酵素・トランスポーターの発現・機能が認められると共に，本実験系を用いてCYP3A基質薬物のin vivo代謝回避率を定量的に予測しうることを示した．一方，消化器障害のアッセイ系としては，消化管幹細胞スフェロイドに薬物を直接曝露させATPレベルを観察する実験系を用いて，EGF受容体チロシンキナーゼ阻害薬（TKIs）の臨床での下痢の頻度差を説明しうる結果を得た．さらには，嘔吐・悪心のアッセイ系として，enterochromaffin（EC）細胞リッチなスフェロイドを構築し，セロトニンの放出活性を測定する実験系により，ALK/ROS1-TKIsの臨床での嘔吐・悪心リスクの高低とセロトニン放出の薬物濃度依存的な感受性の高低が一致する結果を得た．本実験系は，消化管イベントの種差・部位差をin vitro実験系において再現できる可能性を秘めており，今後更なる創薬スクリーニングへの応用や分子機序解明のための実験系としての利用が期待される．
Prediction of intestinal drug absorption and drug-induced intestinal toxicity is critical for the development of orally-administered drugs. However, it is difficult to accurately predict these events because of large species differences and a lack of appropriate in vitro assay. Then, we proposed the use of human crypt-derived intestinal cells for the prediction of intestinal absorption and the risk of intestinal toxicity. 3D human intestinal spheroids were established from fresh surgical specimens of proximal jejunum and terminal ileum using the conditioned media containing Wnt3a, R-spondin 3, and noggin. To generate 2D monolayer, spheroids were enzymatically dissociated into single cells and plated onto Matrigel-precoated culture plates/inserts. We have confirmed the activities of typical drug-metabolizing enzymes and uptake/efflux transporters in human jejunal spheroid-derived differentiated cells. Intestinal availability (Fg) estimated from the apical-to-basal permeation clearance across the jejunal monolayer showed a good correlation with in vivo human Fg values for five CYP3A substrate drugs. As for the prediction of intestinal toxicity, we found that the degree of ATP decreases in intestinal spheroids incubated with different EGFR-TKIs varied greatly depending on the drugs and the rank order of the extent of ATP decrease corresponded with that of frequency of clinically-observed diarrhea. We also constructed enterochromaffin (EC) cell-rich spheroids and quantified serotonin release from EC cells upon exposure to drugs for the prediction of drug-induced nausea and vomiting. As a result, we found that the serotonin release was related to the high/low risk of nausea and vomiting of each ALK/ROS1 kinase inhibitors.
経口投与薬は，患者の利便性の観点から現在でも臨床上最も繁用される投与ルートである．経口投与薬の開発にあたっては，口から投与された薬物全体のうち，循環血に到達しうる薬物の割合であるバイオアベイラビリティの精緻な予測が求められる．バイオアベイラビリティは，主に3つの要因で決定されるとされており，①小腸管腔内の薬物のうち腸管上皮細胞に取り込まれる割合（Fa），②腸管上皮細胞内の代謝酵素による分解を免れる割合（Fg），③門脈に到達した薬物のうち肝臓内の代謝酵素・トランスポーターによる排泄を免れて循環血に到達できる割合（Fh）の積で定義されている．そのうち，①②は小腸におけるイベントであることから，如何にヒト小腸内での薬物の挙動を正確に予測できるかにかかっている．一方で，特に経口投与薬の場合，消化管内での薬物の暴露濃度は他の部位と比較して非常に高いことが予想される．そのせいもあり，臨床試験における消化器障害の発現頻度は，副作用の中でも最も高いとされている．抗がん薬の一部には，重篤な下痢の副作用が用量規定毒性となっているものもあることから，消化器障害のマネジメントは薬効発現においても重要な意味を持つ．
一方で，ヒトにおける消化管吸収率を予見するために，in vivo動物試験の結果に基づく予測が試みられてきたが，げっ歯類・イヌ・サルいずれの動物を用いても，ヒトにおける消化管吸収率は必ずしも精度よく予測できないことが報告されている1)．特にヒトの近縁種であるサルのデータに限っても，消化管における主要な代謝酵素の一つであるCYP3A基質薬物について消化管吸収率をin vivo試験で観察すると，サルの方がヒトよりも圧倒的に代謝効率が良く，吸収率が低めに見積もられるとする報告がある2)．この原因として，小腸上皮細胞に発現する種々の代謝酵素やトランスポーターの発現分子種や発現量が種間で大きく異なるためと考えられている．また，in vitro試験については，細胞のハンドリングが容易なことから，大腸がん由来不死化細胞株であるCaco-2細胞が創薬現場においてよく用いられている．Caco-2細胞は播種後比較的均一な単層を形成することから，culture insert上に形成された細胞単層を介する薬物の経細胞輸送を観察することによって，消化管透過性を定量化することができる．しかしながら，Caco-2細胞とヒト消化管における代謝酵素・トランスポーターの発現量は中には大きく異なるものもあり，例えば，先述したCYP3Aの発現量は，Caco-2細胞では圧倒的に低いことから，腸管内代謝の影響については，Caco-2細胞では評価できないとされている3)．また，消化器障害についても，in vivo試験における大きな種差の問題や，Caco-2細胞を用いたin vitro試験では感度良くとらえきれない問題があり，未だ良い実験系が存在していない．
自身は，これまでヒト肝臓におけるトランスポーター基質薬物のクリアランス予測に従事してきたが，ヒト凍結肝細胞といったヒト由来検体の直接利用により，ヒトクリアランスの予測精度が飛躍的に向上したという経験を持っている4)．それ故，ヒト消化管吸収についても，ヒト由来消化管検体がもし手に入れば，種差を気にすることなく，直接その細胞を用いた検討ができるのではないかと着想して始めたのが本研究のきっかけである．
ヒト新鮮消化管検体の入手については，国際的にみても極めて困難な状況であるが，我々は筑波大学医学部消化器外科の小田竜也先生の多大なるご協力を得ることで，極めて阻血時間が短い新鮮な検体を極めて高頻度（1～2検体/週）に入手できる体制を構築することができた．当初は，ヒト消化管断片を介したUssing chamber間の薬物の輸送を測定する方法を用いて，トランスポーター基質・非基質に関わらず，組織断片の薬物の透過性とヒト消化管吸収率が1つの理論曲線上にのることを見出した5)．ところが，本実験系の一つの問題点として，切除後4時間経過した検体を用いてトランスポーター基質薬物の透過を観察すると，トランスポーターを介した透過が約半分にまで減少すると共に，細胞間隙輸送により透過するlucifer yellowのような物質の透過性が上昇する結果を見出した5)．すなわち，ヒト検体の採取直後に実験を行わないと，複数のトランスポーターの輸送機能が低下し，細胞間接着のintegrityもまた低下する可能性が示唆された．従って，本実験系を創薬スクリーニングに展開することを考えると，不定期にしか手に入らない状況に加え，一回の実験量が時間の制約から限られてしまう点を考慮すると，不向きであると言わざるを得ないと考えた．
そこで，近年，再生医療関連の知見の集積により，crypt領域に存在する小腸幹細胞がLGR5陽性細胞として明確に定義され，さらに，小腸幹細胞を3D培養により拡大培養することが可能であることが示された6)．本実験系では，拡大培養した幹細胞を凍結保存・再播種することが可能であり，3D培養された細胞を酵素分解することで2D培養系に展開することも可能である．従って，創薬スクリーニングにはより適した系になることが考えられた．そこで我々は，この培養技術を薬物動態・毒性評価に応用すべく，評価系の構築を試みた．Miyoshiらの方法7)に準拠し，L-WRN細胞（Wnt3a/R-spondin 3/Noggin安定発現細胞）の50％馴化培地を用いることで，Matrigel中で小腸幹細胞を3D培養することに成功した（図1）．また，細胞を単離後，単に馴化培地からWRNの3成分を除去するといった単純な方法で小腸上皮細胞に分化させ，細胞単層をculture insert上で形成されることで，Caco-2細胞で行われている実験と全く同様に，薬物の経細胞輸送を観察することで透過性を評価する実験系を確立した（図1）．この実験系では，培地切り替え後1週間程度で，消化管に発現する主な取り込み・排出トランスポーターや代謝酵素が安定的に発現すると同時に，経上皮電気抵抗（TEER）値も安定した値をとることが確認されている8)．さらに，消化管における代表的な排出トランスポーターであるP-gp，BCRP基質の方向性輸送が明確に観察されると共に，Caco-2細胞では観察されづらい第Ⅰ相代謝酵素のCYP3A，CYP2C9や第Ⅱ相抱合酵素のUGTs，プロドラッグの活性化に重要な役割を果たすカルボキシルエステラーゼ（CES）2の活性が確認されている．さらに，Caco-2細胞では評価不能なCYP3Aによる代謝活性が異なる複数の薬物について，経細胞輸送の透過性を測定することで，ヒトにおける消化管代謝回避率（Fg）の良好な予測に成功した（図2）8)．
2種類の計算法を用いて，in vitro実験データを論理的にin vivoデータに変換して予測したFg値（横軸）とヒトFg実測値（縦軸）の相関を示している．
本実験系の特長として，異なる種の消化管幹細胞をほぼ同一のプロトコールで単離・培養可能である点が挙げられる9)．既に我々のところでは，マウス・イヌ・サル・ミニブタなど多種にわたる動物由来の細胞系の樹立も果たしており，現在，分化条件の最適化と種差の検討への活用を見据えた研究を進行中である．さらには，本実験系は，採取したcrypt部位の遺伝子発現プロファイルを分化細胞が維持する性質があることが報告されている10)．実際に我々自身の検討でも，消化管上部に局在するPCFT（proton-coupled folate transporter）や，下部に局在するASBT（apical sodium-dependent bile acid transporter）といったトランスポーターの発現・機能が，それぞれ上部由来・下部由来細胞においてのみ観察されることを確認できており，今後，消化管の吸収領域差を検討できる新規in vitro実験系としての活用も期待できる．また，消化管における代謝酵素・トランスポーターの転写誘導は，基質薬物の消化管吸収に大いに影響を与える可能性が考えうる．Caco-2細胞においては，CYP3Aの転写誘導に重要な役割を果たす核内転写因子PXR（pregnane X receptor）の発現が低いため，PXRを介したCYP3Aの誘導現象は見づらいことが知られている．我々は，PXRの代表的な誘導薬であるrifampicinを用いて，CYP3Aの転写誘導が我々が構築した分化小腸細胞で観察されるかを検討した．その結果，mRNA発現量および典型基質であるmidazolamの代謝活性が約2倍程度上昇した．この結果は，過去に臨床でrifampicin前投与時のヒト小腸におけるmRNA発現量の上昇率とほぼ同等である11)ことから，我々の実験系がヒト臨床における誘導強度を予測できる可能性が示唆された．
このように，ヒト／動物crypt由来分化小腸細胞を用いることで，消化管吸収にまつわる代謝酵素・トランスポーターの機能について，比較的広範な分子種に対して観察可能であることが示唆され，Caco-2細胞に置換可能な実験系になるポテンシャルが確認されたと考えている．今後，更なる定量的な解析を通じて，本実験系の有用性を実証していきたいと考えている．
消化器障害といっても，非常に多岐にわたり，下痢・嘔吐・悪心・腹痛など様々な症状が臨床では観察され，それぞれ多様な機序に基づいていることが推察される．また，消化管は吸収上皮細胞以外にもムチンの分泌に関わるgoblet細胞や抗菌ペプチドの生成に関わるPaneth細胞，内分泌系の細胞等複数の細胞から構成されている．従って，薬物誘導性の消化器障害を包括的に予測するためには，複数の機序に基づく実験系を立て，それらの結果を総合的に判断することで，薬物が標的とする細胞種や機序を推定していく必要があると考えており，我々も，異なる機序に対処可能な実験系の構築を進めている．
まず，消化管幹細胞に対する障害を介した重篤な下痢の予測系の構築に着手した12)．3D培養された消化管幹細胞に対して，薬物を一定時間暴露させた後，細胞内ATPレベルおよび培地中へのLDH漏出レベルを測定するシンプルな実験系を立てた（図3（a））．EGF受容体チロシンキナーゼ阻害薬（EGFR-TKIs）の中には，afatinibのように臨床試験における下痢の頻度がほぼ100％に近いものもあれば，gefitinibやimatinibのように比較的低いものも存在する．この下痢の頻度差を我々の実験系で再現すべく，様々なEGFR-TKIsを用いて検討を進めた．その結果，比較的下痢の頻度が高いEGFR-TKIsについては，極めて低濃度域より細胞内ATP量の減少が観察された．さらに，細胞傷害性（ATPレベルの減少）の可逆性とEGFR-TKIsの阻害の可逆性との関連を探るべく，各種EGFR-TKIsを一定時間細胞に暴露した後，一度培地を洗浄・EGFR-TKIsを含まない培地に交換し，その後のATPレベルの回復を観察した．その結果，EGFR-TKに対する阻害モードが可逆的な薬物においては，薬物除去後は徐々にATPレベルの上昇が観察されたのに対して，阻害モードが不可逆的であるafatinibやpoziotinibでは，ATPレベルの回復が観察されなかった（図3（b））．これらの事象を総合的に判断すると，EGFR-TKIsによる重篤な下痢は，EGFRに対する作用強度と対応付けられることから，オンターゲット毒性である可能性が示唆された．なお，本実験と同様の実験をCaco-2細胞を用いて実施したところ，いずれのEGFR-TKIsにおいても，高濃度域に達するまでATPレベルの減少が観察されず，極めて感度が低いことが分かり，本実験系の有用性が示唆される結果となった．
（a）本実験で用いた評価系の概要，（b）EGFR-TKIsによるATPレベル減少の可逆性の検討．72時間薬物と細胞を暴露した後（exposure），薬物を除去して培養を継続した（removal）．Afatinib，poziotinib，osimertinibはいずれもEGF受容体チロシンキナーゼの不可逆的な阻害薬（但しosimertinibの野生型EGFRに対する阻害定数は大きい）である．
一方で，嘔吐・悪心については，げっ歯類ではそもそも嘔吐現象が見られないなどin vivoによる評価は難しい点があり，さらに嘔吐・悪心については，機序が単一ではないことから，in vitro試験による評価も困難であるとされてきた．我々は，嘔吐・悪心が引き起こされる原因の一つとして，enterochromaffin（EC）細胞からのセロトニンの過度の放出が，嘔吐中枢を過度に刺激するメカニズムを想定して，セロトニン放出を定量する実験系を着想した．その際，EC細胞は消化管の細胞全体の割合でみても1％程度であり，極めて少ないことから，セロトニン放出の変化を通常の小腸オルガノイドで見る際に感度が低くなる懸念が考えられた．そこで我々は，通常の消化管幹細胞スフェロイドに，分泌系細胞への分化を促すとされているDAPTを暴露することで，EC細胞のマーカー遺伝子の発現が飛躍的に上昇したEC細胞リッチなスフェロイドの形成に成功した．それを用いて，セロトニンの細胞外への放出をLC-MS/MSにて定量し，併せて細胞内ATPレベル，細胞外へのLDH漏出も並行して測定することとした．ALK/ROS1チロシンキナーゼ阻害薬（ALK/ROS1-TKIs）の中で，crizotinib，ceritinib，brigatinibは，臨床試験における嘔吐・悪心の発現頻度が比較的高いのに対して，alectinib，lorlatinib，entrectinibは，低いことが分かっている．我々は，EC細胞リッチスフェロイドにおけるセロトニン放出を観察することで，この副作用発現頻度の高低を差別化可能であるか検討を実施した．その結果，嘔吐・悪心の高リスク群に属する薬物では，3～10 μM付近から時間依存的なセロトニンの放出が明確にみられるのに対して，低リスク群の薬物では，ほとんどセロトニン放出が観察されないか，高濃度域までいって初めて放出が観察されるといった状況となった．一方で，セロトニン放出の増加と細胞内ATPレベルとの関係を調べたところ，細胞内ATPレベルが低下する前段階で，セロトニン放出が観察されたことから，この実験系で見られるセロトニン放出は，EC細胞の細胞死によって細胞外へ単純にセロトニンが漏出したものでないことが示唆された．従って，ALK/ROS1-TKIsについては，嘔吐・悪心の臨床での発現リスクとセロトニン放出活性が関連していることが確認され，嘔吐・悪心のリスク評価系として有用であることが示唆される結果を得た．
以上，医薬品の消化管吸収および消化器障害の定量的予測のためのin vitro実験系開発と実証例について概説した．特に毒性評価については，多様な消化器障害に対応すべく，別の機序を再現可能な実験系として，別の指標に基づくリスク判断を行う複数の実験系構築が必要になると考えられ，鋭意研究を進めている．また，前述の通り，in vitro実験により，消化管イベントの種差の再現や原因解明，医薬品の吸収特性や毒性発現における消化管部位差の検討など，本実験系が有する特性を活かした研究も進めていければと考えている．
開示すべき利益相反はない．
本研究の遂行にあたっては，筑波大学医学医療系消化器外科の小田竜也教授，榎本剛史教授，橋本真治准教授，下村治講師，大原佑介講師，宮崎貴寛病院講師，筑波大学附属病院つくばヒト組織バイオバンクセンターの西山博之部長，竹内朋代病院教授に，極めて新鮮度の高いヒト小腸組織の供給にご尽力頂いており，この場を借りて御礼を申し上げたい．
また，本研究は，東京大学大学院薬学系研究科分子薬物動態学教室において行われ，道場一祥博士（現：第一三共（株）），橋本芳樹氏（博士課程3年在学中），楠原洋之教授の多大なる尽力の賜物であり，併せて深謝したい．
前田 和哉（まえだ かずや）
北里大学 薬学部 薬剤学教室，教授，薬学博士．
◇1999年東京大学薬学部卒業，同大学院薬学系研究科 修士課程に進学，2001年，同 修士課程卒業，博士後期課程に進学，2002年，博士課程を中退し，東京大学大学院薬学系研究科寄附講座教員に着任（分子薬物動態学教室）．以後，2003年助手，2007年助教，2012年講師，2020年准教授を経て，2021年より現職．2006年に薬学博士を取得．◇研究テーマ：in vitro実験の結果に基づくヒトin vivo薬物動態の予測法・評価系の開発．特にヒト由来組織検体の利活用による薬物動態の定量的予測に注力している．◇趣味：合唱，カラオケ，ちょっとした作曲，ボウリング，資格取得，懇親会のエンタメ企画のアレンジなどなど．
