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Parathyroid hormone measurement using a rapid-clotting blood collection tube
2017 Volume 66 Issue 5 Pages 508-515
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2017 Volume 66 Issue 5 Pages 508-515
副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone; PTH）測定では，血清および血漿を検体として用いる。血清を検体とした場合，EDTA-2Na血漿と比べて，測定値が低下する事例を経験したため，その原因を検索した。10名の健常成人から採血した検体を使用し，（1）採血管の種類，（2）採血管に添加された薬剤，（3）サンプルカップへの移し替え，（4）検体とサンプルチューブの接触面積，および（5）サンプルチューブの材質がwhole PTH測定に与える影響を解析した。高速凝固採血管を使用すると，他の採血管を使用した場合と比較して，whole PTH測定値は有意に低くなり，またトロンビンは，濃度依存的にwhole PTH測定値を低下させたため，高速凝固採血管に添加されているトロンビンによってwhole PTH測定値が低下しているものと考えられた。サンプルカップへの検体移し替えを行うとwhole PTH測定値は有意に低下し，さらに，サンプルチューブの接触面積とwhole PTH測定値との間には負の相関が認められた。さらにwhole PTH測定値の低下率はサンプルチューブの材質により異なり，また，血清とEDTA-2Na血漿では，同じ材質のサンプルチューブに対する低下率に相違が認められた。
副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone; PTH）は血中のカルシウム濃度を調節する84個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであり，副甲状腺から分泌される。PTHは骨に作用して骨吸収を促進し，腎臓に作用してカルシウムの再吸収を促進するとともに，ビタミンDの活性化を促進して腸管におけるカルシウム吸収を促進することで，血中のカルシウム濃度を上昇させる働きをもっている。これらのPTHの生理活性に重要な構造はN末端側のヘリックス構造であるとされている1)。PTHの血中半減期は2～4分と極めて短く，様々な長さの不完全長のPTH断片が血中に存在するが，健常人であれば速やかに腎臓より排泄される。
PTH測定系のなかで現在多く臨床で使用されているPTHインタクトは，N末端側のPTH(1–34)（1から34個目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する）を認識する抗体とC末端側のPTH(39–84)を認識する抗体の両者を用いることで，生理活性のある完全長のPTHのみを測定しようとするものである。しかし，実際には生理活性部位であるN末端側の配列を欠いた不完全長のPTH(7–84)を測定することが明らかとなっている1)。このPTH(7–84)はPTHアンタゴニストの可能性が示唆されており，PTHインタクトは副甲状腺機能を過大評価する可能性をもっていることになる1)～3)。その後開発されたwhole PTHは，生理活性部位であるPTH(1–6)を認識する抗体を用いることで，PTH(7–84)を含めて測定するPTHインタクトの問題点を解決した。whole PTHは副甲状腺機能をより正確に反映する新しい副甲状腺ホルモン測定系として期待されている。実際に，人工透析患者では重篤な腎機能障害のためにPTH(7–84)が蓄積し，その蓄積量はPTH(1–84)の7割程度にまで達するといわれている1),4),5)一方で，PTHの濃度域によってその割合が変化するという報告もあるため6)，人工透析患者ではwhole PTH測定を行うことが重要であるとされている。しかしながら，現時点ではwhole PTH測定はあまり普及しておらず，未だに臨床ではPTHインタクトを利用することが多い。whole PTHの開発当初は，操作が煩雑で時間がかかるIRMA法を原理とした試薬しか市販されていなかったため，病院内の検査室で測定することが困難であった。また，2011年までwhole PTHを用いた具体的なガイドラインが存在しなかったこともwhole PTHの普及が遅れている原因であると考えられる。しかし，近年，自動免疫測定装置で測定可能なwhole PTH用試薬が発売され，検査室での測定が容易となったため，今後急速にwhole PTHが普及していくものと予想される。
PTHの不確かさの要因として，最も大きな影響要因は保存安定性であり，採血後の検体は速やかに処理する必要がある。また，検体の種類については，PTH濃度に差はないはずであり，これまでの報告でも血清を検体とした場合とEDTA-2Na血漿を検体とした場合でwhole PTH測定値に差はないとされてきた2),4)。今回，我々は，迅速に検体処理を行ったにもかかわらず，血清検体のwhole PTH測定値がEDTA-2Na血漿検体測定値よりも低下傾向を示したため，血清，血漿測定値間に乖離が生じた原因について検索を行った。
我々がwhole PTH測定に使用した血清検体は，高速凝固採血管にて採血を行い，遠心分離後に血清を別の容器に移し替えて測定を行ったため，whole PTH測定値低下の原因として疑われる主な要因は高速凝固採血管の使用と別容器への検体移し替えのプロセスにあると考えられる。そこで，本研究ではこれらの点について解析を行った。
なお，本研究は岡山大学生命倫理審査委員会の承認を得たものである。
同意文書および口頭の説明により同意のとれた健常成人10名から採取した血液を対象とした。
2） 測定試薬および機器測定試薬にはCLEIA法を原理としたルミパルスプレストwhole PTH「DSPB」（DSファーマバイオメディカル株式会社）を，測定機器にはルミパルスプレストII（富士レビオ株式会社）を使用した。この測定法における併行精度および室内精度はそれぞれ1.17～3.16%および1.54～2.88%であった（院内バリデーションデータに基づく）。
3） 採血管積水メディカル株式会社製のインセパックII-D SQ3高速凝固タイプ（以下高速凝固採血管）およびインセパックII-D凝固促進タイプ（以下凝固促進採血管），テルモ株式会社製のベノジェクトII真空採血管プレイン（凝固促進フィルム入り，以下プレイン採血管）およびベノジェクトII真空採血管EDTA-2Na（以下EDTA-2Na採血管）を用いた。なお，添加物として，高速凝固採血管にはトロンビン，シリカ粒子，および血清分離剤が，凝固促進採血管にはシリカ粒子および血清分離剤が，プレイン採血管にはプラスチックフィルムにガラス微粒子をコーティングした凝固促進フィルムが，EDTA-2Na採血管には顆粒状のEDTA-2Naが含まれている。また高速凝固採血管と凝固促進採血管の形状は同じであり，同様にプレイン採血管とEDTA-2Na採血管の形状も同じである。採血量は高速凝固採血管および凝固促進採血管で6 mL，プレイン採血管およびEDTA-2Na採血管で3 mLとした。
4） サンプルカップおよびチューブサンプルカップとしてポリスチレン製のMonoject Sample Cup for 16 mm Tubes（Covidien plc）（以下Monojectカップ）を，サンプルチューブとしていずれもアジア器材株式会社から入手したポリプロピレン製のPP21型丸底スピッツ（アジア器材株式会社，以下丸底スピッツ），ポリスチレン製のPSオートチューブ丸底（以下PSチューブ），ポリプロピレン製のPPオートチューブ丸底（以下PPチューブ），およびスチレンブタジエン共重合樹脂製のKRオートチューブ丸底（以下KRチューブ）を用いた。PSチューブ，PPチューブ，およびKRチューブは容器も形状が同一であり，材質だけが異なるものである。
5） 添加薬剤沢井製薬株式会社の経口用トロンビン細粒1万単位「サワイ」（以下トロンビン），株式会社同仁化学研究所の2NA（EDTA・2Na）（以下EDTA-2Na），および和光純薬工業株式会社のヘパリンリチウム（以下ヘパリンLi）を使用した。
2． 実験方法 1） 検体の採取と前処理血液の採取に際しては，研究担当者が各被験者から25 mLずつ採血を行った。採血はシリンジにて行い，速やかに高速凝固採血管，凝固促進採血管，プレイン採血管，およびEDTA-2Na採血管にそれぞれ規定した量の血液を分注した。分注後の採血管はゆっくりと5回転倒混和を行い，室温で30分間放置した後に，25℃，3,000 rpm（1,930 g），5分間の条件で遠心分離を行い，得られた血清およびEDTA-2Na血漿については速やかに検体として使用し，使用後の検体は保存容器に移し替えて凍結保存した。凍結保存した遠心上清を恒温槽で解凍した後，同じ種類の採血管で処理した10名分の遠心上清を混合し，プール検体として使用した。また，使用後の検体は7日間凍結保存後，恒温槽にて解凍し，同一採血管で採取した検体を混合してプール検体として使用した。
2） 採血管の種類がwhole PTH測定値に与える影響高速凝固採血管，凝固促進採血管，プレイン採血管，およびEDTA-2Na採血管を使用したときのwhole PTH測定値について検討した。検体としては遠心分離直後の新鮮な血清およびEDTA-2Na血漿を使用した。またサンプルカップおよびサンプルチューブへの移し替えは行わず採血管のまま分析を行った。
3） 採血管に含まれる添加薬剤がwhole PTH測定値に与える影響プレイン採血管で採取したプール血清にトロンビン，EDTA-2Na，およびヘパリンLiを添加しwhole PTH測定を行った。最終濃度が，トロンビンは0，50，100，150，200，および250 U/mLとなるように，EDTA-2NaはEDTAの無水塩として0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，および5.0 mg/mLとなるように，ヘパリンLiは0，10，20，30，40，および50 U/mLとなるように調整し，それぞれ3重測定を行った。すべての測定はMonojectカップを使用して行った。
4） 検体をサンプルカップ間で移し替える回数がwhole PTH測定値に与える影響検体をMonojectカップに移し替える回数によるwhole PTH測定値の変動を解析した。検体としては高速凝固採血管から採取したプール血清（以下SQ血清）および EDTA-2Na採血管から採取したプール血漿（以下EDTA-2Na血漿）を用いた。
はじめにMonojectカップに検体を500 μLずつ分注し，whole PTHの測定を行った。その後，新しいMonojectカップへデカンテーションでの移し替えおよびwhole PTHの測定を行う作業を3回繰り返した。この一連の移し替えおよび測定の作業をSQ血清およびEDTA-2Na血漿のそれぞれにおいて10通り，同時に行った。
5） サンプルチューブと検体が接触した面積がwhole PTH測定値に与える影響丸底スピッツの適切な位置に線を引き，それらの容器にそれぞれ1 mLの検体を分注した。そして，その線までの内壁すべてに検体が接触するように丸底スピッツを室温，手動で回転させ，接触操作終了後すぐにwhole PTH測定を行った。各試験条件の接触面積は，6.38 cm2，15.17 cm2，23.97 cm2，および32.77 cm2であった。SQ血清およびEDTA-2Na血漿検体について，4通りの接触条件をそれぞれ5本ずつ用意し同時に測定を行った。
6） サンプルチューブの材質がwhole PTH測定値に与える影響の相違サンプルチューブとしてPSチューブ，PPチューブ，およびKRチューブの3種類を用いた。それぞれの容器に300 μLの検体を分注し，3種類のサンプルチューブをそれぞれ10本ずつ用意し同時にwhole PTH測定を行った。検体にはSQ血清およびEDTA-2Na血漿を使用した。すべての測定において，共通のキャップを用いて10回転倒混和を行った。対照として，丸底スピッツにプールされた検体をサンプルカップ等の別容器に移し替えることをせず，そのまま10重測定を行った。
3． 統計解析統計解析にはGraphPad PRISM 6（GraphPad Software社）を使用し，対応のない一元配置分散分析，対応のある一元配置分散分析，相関分析および多重比較検定を用い，多重比較検定ではDunnett法およびTukey法を用いて解析を行った。いずれの解析においてもp値が0.05未満の時を有意差ありと判定した。
高速凝固採血管を使用すると，凝固促進採血管，プレイン採血管，およびEDTA-2Na採血管を使用した場合と比較して，PTH測定値はそれぞれ7.7，10.4，および6.7%低かった（それぞれp = 0.004，p < 0.001，およびp = 0.011）（Figure 1）。
Fluctuation in PTH measurement value depending on type of blood collection container
SQ, CG, plain, and EDTA-2Na means rapid clotting blood collection tube, clot activator blood collection tube, plain blood collection tube, and EDTA-2Na blood collection tube respectively.
トロンビンとEDTA-2Naを添加した場合は，添加濃度に依存してwhole PTH測定値の低下が認められた。10%以上の低下率を認めたのは，トロンビンで150 U/mL以上，EDTA-2Naで4.0 mg/mL以上を添加した場合であった。ちなみに，150 U/mLのトロンビンを添加した場合，whole PTH測定値は13.7%低下した（p = 0.006）（Figure 2A）。また，4.0 mg/mLのEDTA-2Naを添加した場合，whole PTH測定値には13.5%の低下が認められた（p = 0.044）（Figure 2B）。ヘパリンLiを添加した場合，いずれの濃度においても有意差は認められなかった（Figure 2C）。
Decrease in PTH measurement value due to addition of drug contained in blood collection container to plain serum specimen
SQ血清検体のwhole PTH測定において，検体をMonojectカップに移し替える操作を3回行うと，測定値は7.0%低下した（p < 0.001）（Figure 3A）。EDTA-2Na血漿検体のwhole PTH測定では，2回および3回の移し替えによって測定値は，それぞれ7.8%および16.6%低下した（ともにp < 0.001）（Figure 3B）。
Decrease of measured PTH value by sample transfer to measurement container
SQ血清検体のwhole PTH測定における測定値は，検体が丸底スピッツと接触した面積と中等度の負の相関（r = −0.401）を示した（Figure 4A）。また，EDTA-2Na血漿検体のwhole PTH測定における測定値も，検体が丸底スピッツと接触した面積と強い負の相関（r = −0.889）を示した（Figure 4B）。
Correlation between area of contact of specimen with measurement container and measured value of PTH
whole PTH測定値は検体をサンプルチューブに移し替えることにより低下したが，その低下率はサンプルチューブの材質により異なった。また，SQ血清とEDTA-2Na血漿を比較したとき，サンプルチューブの材質が同じでも低下率に相違が認められた。すなわち，SQ血清検体のwhole PTH測定における測定値は，PPチューブに移し替えることで5.0%低下した（p < 0.001）。同様に，PSチューブおよびKRチューブへの移し替えはwhole PTH測定を，それぞれ13.7%および11.6%低下した（ともにp < 0.001）（Figure 5A）。EDTA-2Na血漿検体を用いて同様の実験を行うと，PPチューブ，PSチューブ，およびKRチューブへの移し替えによって，whole PTH測定値には，それぞれ16.3，19.7，および10.9%の低下が認められた（ともにp < 0.001）（Figure 5B）。PPチューブを使用した場合の低下率は，SQ血清で5.0%であったがEDTA-2Na血漿で16.3%となり10%以上の差を認めた。
Difference in PTH measurement value depending on material of measurement container used for sample transfer
本研究で，whole PTHを測定する際に高速凝固採血管を用いると，その他の採血管と比較してその測定値が低下することが明らかとなった。高速凝固採血管と凝固促進採血管の大きな違いはトロンビンの有無であり，またプレイン血清検体にトロンビンを添加したところwhole PTH測定値が有意に低下したことから，高速凝固採血管を用いた場合に認められたwhole PTH測定値低下の原因の一部はトロンビンによるものであると考えられる。プレイン血清検体に添加したトロンビンはウシ血液由来のものであるがヒト由来のトロンビンと同様の働きをするものと考えられている。またトロンビンの添加物として塩化ナトリウム，アミノ酢酸，およびブタ皮由来のゼラチンを含み，トロンビンの製造工程でブタ肺由来トロンボプラスチンを使用しているが，そのいずれも今回の実験結果に大きな影響を与えるとは考えにくい。トロンビンは活性型凝固第II因子としても知られているセリンプロテアーゼの一種であり，フィブリノーゲンをフィブリンに変える働きを持っている。しかし，トロンビンの働きはそれだけにとどまらず様々なタンパク質を分解してしまうとされている6)。今回，PTHの測定値が低下した現象もこのトロンビンが持つプロテアーゼ活性によるものであると推測できる。トロンビンの活性の強さは濃度に依存するため，高濃度になるとPTHの測定値は大きく低下することが考えられる。そのため，高速凝固採血管の採血量が極端に少ない場合にはトロンビン濃度が非常に高くなり，PTHの測定値を大きく低下させてしまうことが危惧される。これらの結果から，PTHの測定に際しては高速凝固採血管の使用を避けることが望ましいと考えられる。
また，whole PTH測定値は，検体がプラスチック容器と接触することでも低下した。検体と容器が接触した面積は，whole PTH測定値の低下と有意に相関したことから，その低下率を左右する要因であると考えられる。さらに，使用した検体の種類やプラスチックの材質もwhole PTH測定値の低下率に影響することが明らかとなった。
検体と測定容器の接触に起因するPTHの測定値低下は，PTHが容器のプラスチック表面に吸着することが原因であると推定される。タンパク質の疎水性基がプラスチック表面に吸着する現象は知られている。しかし，既知の報告は，いずれも，検体として精製タンパク質の溶液および尿・透析液のようにタンパク質や脂質をあまり含まない溶液を対象とした研究結果であり，これまでに，血清および血漿を検体とした測定で，プラスチック表面での吸着現象が起こったとの報告はない7)～12)。以上のことから，PTHはその他のタンパク質と比べて吸着の影響を受けやすいと考えられる。そのため，検体がプラスチック容器と接触する面積が増加すればPTHの測定値はより低下するものと危惧される。検体の種類と容器の材質によって低下率が変動した。この原因は定かではないが，この結果は検体の種類に合わせてPTHの測定値を低下させにくい材質の容器を選択してより正確な測定を行うことができる余地があることを示唆しているかもしれない。本研究の結果からはPPチューブにおいてEDTA-2Na血漿で血清に比べてPTHの測定値がより低下すると考えられた。今後検体の種類や容器の材質を増やし，より詳細な検討を行っていく必要があると考えられた。
PTHを測定する際に高速凝固採血管を使用すると測定値が低下することが示唆された。そして，その低下の一部は，高速凝固採血管に添加されているトロンビンが原因であると考えられた。検体がプラスチック容器と接触することでもPTHの測定値は低下した。また，検体とプラスチック容器の接触面積がPTHの測定値の低下率に影響していた。さらに，検体の種類および容器の材質もこの低下率を変化させた。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
