Japanese Journal of Medical Technology
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Technical Articles
Evaluation of automated urine particle analyzer, UF-5000, as a screening tool to identify Gram stainability of urinal pathogens
Kae KAWAMURAYoshitsugu IINUMADaisuke USUDAAya HASHIMOTOMasami MATSUMOTOYoshi TANAKA
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2017 Volume 66 Issue 5 Pages 516-523

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Abstract

尿路感染症(urinary tract infection;以下UTI)原因菌検索の迅速検査法として尿グラム染色が実施されているが,尿中有形成分分析装置による細菌弁別判定機能の有用性が期待されている。尿中有形成分分析装置UF-5000(以下UF-5000,シスメックス)は,グラム陽性菌/陰性菌を判定する細菌弁別判定機能が標準搭載され,他の有形成分項目とともに約3分で報告可能である。今回,UF-5000細菌弁別判定と従来法のグラム染色,培養同定を比較評価したので報告する。UTIを疑い提出された尿188検体を対象に,UF-5000の結果が分類不能,または測定エラーだった9件を除外した179検体では,グラム染色,培養同定との一致率はそれぞれ83.2%,81.0%だった。一方,グラム染色と培養同定の一致率は85.1%であり,これに近似した良好な結果であった。また,UF-5000がグラム陰性菌と判定した場合の的中率は,グラム染色,培養同定との比較でいずれも93.3%だった。UF-5000と他2法が不一致だった検体では,細菌スキャッタグラムドット分布を目視判定すると他2法と一致,装置アルゴリズム判定では不一致となる検体があった。UF-5000細菌弁別判定による尿グラム染色性の迅速報告は,UTI原因菌のスクリーニング検査法として有用であると考えられた。

I  はじめに

尿路感染症(urinary tract infection;以下UTI)は,主に腸内細菌科細菌が原因菌となる尿路に発生する感染症の総称である。UTIは,膀胱炎など比較的軽微な感染症から,腎盂腎炎などの重症感染症まで,幅広い疾患スペクトラムを有する頻度の高い感染症であり,市中および院内感染症として迅速な診断および治療が求められる1)。UTIの診断は臨床所見と膿尿,細菌尿の証明が重要である。尿定量培養による原因菌の証明がUTI診断のgold standardであるが,尿定性検査,尿中有形成分分析,尿沈渣法などの尿一般検査による迅速な診断も可能である2)。治療においては原因菌検索が必要であり,グラム染色による尿塗抹検査,尿定量培養が実施される。尿グラム染色は短時間で実施可能だが,すべての検体に対してリアルタイムに実施し,迅速に報告することは容易ではない。また,尿定量培養には手間と時間がかかり結果報告までには少なくとも2日間程度必要である。このため,UTI原因菌検索において,労力をかけることなく,迅速に情報を提供できる検査法が求められる。

フローサイトメトリーを原理とした全自動尿中有形成分分析装置UF-5000(以下UF-5000,シスメックス)は,非遠心尿中の赤血球,白血球,上皮細胞,扁平上皮細胞,円柱,細菌を定量的に測定する装置である。細菌の定量測定時に表示されるBACTスキャッタグラムのドット分布を装置内アルゴリズムで解析し,グラム陽性菌/陰性菌を判定する細菌弁別判定機能が付加情報BACT-infoとして標準搭載され,他の有形成分項目とともに約3分で報告可能である。

今回,我々はUTI疑いの患者尿を用いてUF-5000細菌弁別判定と従来法である尿グラム染色,尿培養同定結果を比較評価したので報告する。なお本研究は金沢医科大学医学研究倫理審査委員会の承認(整理番号I093)を得て実施した。

II  UF-5000測定原理

UF-5000では,白血球,細菌,上皮細胞など,有核成分を分析するCR(Core)チャンネルで細菌を定量測定している。新規開発された核酸染色と青色半導体レーザーを用いて,前方散乱光,側方散乱光,側方蛍光,偏光解消側方散乱光を検出し,複数のパラメーターを組み合わせて有形成分を分類している。成分の大きさや核酸量の違いにより,細菌,酵母様真菌/精子,白血球/上皮細胞の3つの領域に分けて,2次元座標軸散布図が描かれる。細菌領域BACTスキャッタグラムをFigure 1に示す。X軸が核酸染色強度を反映する側方蛍光強度(side fluorescence intensity; FL),Y軸が成分の大きさを反映する前方散乱光強度(forward scatter light intensity; FSC)で描かれた散布図である。UF-5000細菌弁別判定は,この散布図上のドット分布とX軸のなす角度を装置内部アルゴリズムで自動判定し,角度が大きい場合をGram Positive?(グラム陽性菌疑い),角度が小さい場合をGram Negative?(グラム陰性菌疑い),2方向の場合をGram Pos/Neg?(グラム陽性菌/陰性菌混合疑い),どのパターンにも分類できないものをUnclassified(分類不能)と判定している。

Figure 1 

UF-5000 bacteria scattergram

III  対象および方法

1. 対象検体

2015年6月から2016年1月までにUTIを疑い,金沢医科大学病院中央臨床検査部に提出された尿培養検体を対象とし,グラム染色で酵母様真菌を除くグラム陽性菌,グラム陰性菌の何れかを認めた195検体をUF-5000で測定した。

汚染菌を除外するために,UF-5000測定で総細菌数105/mL未満,白血球数10/μL以下の何れかを満たした7検体を除外し,188検体を解析対象とした。総細菌数105/mL未満で除外となった5検体は全てUF-5000細菌弁別判定がUnclassifiedとなった。

解析対象188検体は男性78名,女性110名,平均年齢65.4歳(2ヶ月~101歳)であり,入院70名,外来118名であった。

2. 尿グラム染色方法

非遠心尿1 μLをスライドガラスに塗布し,広げることなく自然乾燥し,火炎固定後にグラム染色を実施した。グラム染色は,グラム染色液neo-B&Mワコー(和光純薬)を使用した。尿グラム染色は一般的に10 μLで実施するが,本検討では菌量が多い検体を対象としており,1 μLで実施した。

3. 尿培養同定方法

尿培養は1 μL定量白金耳で尿検体を塗布した5%ヒツジ血液寒天培地(栄研化学)を35℃炭酸ガス培養,ドリガルスキー寒天培地(極東製薬)を35℃好気培養で最大2日間培養し,発育菌を同定した。発育菌の同定は,MicroScan WalkAwayのPos Combo Panel,Neg Combo Panel(ベックマン・コールター)を中心とした生化学的性状法で同定した。また,グラム染色結果と発育菌に違いがある場合は,RSブルセラHK寒天培地,PV加RSブルセラHK寒天培地(極東製薬)を使用して35℃,最大4日間の嫌気培養を追加実施し,発育菌をRapID ANA II(アムコ)で同定した。

4. UF-5000測定方法と評価方法

尿グラム染色,尿培養培地への塗布後に尿検体を4℃保存し,4時間以内にUF-5000で測定した。

UF-5000細菌弁別判定結果,グラム染色結果,培養同定結果について,菌の形態(桿菌,球菌),菌量に関わらず,グラム染色性が一致した場合を一致,異なる場合を不一致と評価した。

IV  結果

1. 尿培養発育菌

解析対象188検体の尿培養発育菌の割合をFigure 2に示す。1菌種のみ発育した検体が63.8%,複数菌が発育した検体は36.2%だった。1菌種発育検体では,腸内細菌科細菌を中心としたグラム陰性菌が68.3%を占めた。一方,複数菌種発育検体ではグラム陽性菌と陰性菌の混合が半数以上の54.4%を占めた。

Figure 2 

Isolated microorganisms

2. UF-5000細菌弁別判定とグラム染色の比較

UF-5000細菌弁別判定とグラム染色の比較結果をTable 1に示す。全体の一致率は79.3%で,グラム陽性菌と陰性菌混合検体の一致率が63.9%と低かった。UF-5000がUnclassifiedまたは測定エラーだった9件を除外した179検体の一致率は83.2%であった。また,UF-5000がGram Negative?と判定した場合の的中率は93.3%と高かった。

Table 1  Comparison of UF-5000 and Gram-staining
UF-5000 Gram-staining Total PPV
Gram Positive Gram Negative Gram Pos/Neg
Gram Positive? 42 8 6 56 75.0%
Gram Negative? 1 84 5 90 93.3%
Gram Pos/Neg? 4 6 23 33 69.7%
Unclassified 0 1 2 3
Measurement error 2 4 0 6
Total 49 103 36 188
CR 85.7% 81.6% 63.9% 79.3%
Aggregate excluding “Unclassified” and “Measurement error”
Total 47 98 34 179
CR 89.4% 85.7% 67.6% 83.2%

CR: concordance rate, PPV: positive predictive value

3. UF-5000細菌弁別判定と培養同定の比較

UF-5000細菌弁別判定と培養同定の比較結果をTable 2に示す。全体の一致率は77.1%で,UF-5000がUnclassifiedまたは測定エラーだった9件を除外した179検体の一致率は81.0%であった。グラム染色との比較と同様に,UF-5000がGram Negative?と判定した場合の的中率は93.3%と高かった。

Table 2  Comparison of UF-5000 and culture
UF-5000 Culture Total PPV
Gram Positive Gram Negative Gram Pos/Neg
Gram Positive? 42 4 10 56 75.0%
Gram Negative? 0 84 6 90 93.3%
Gram Pos/Neg? 4 10 19 33 57.6%
Unclassified 1 1 1 3
Measurement error 2 3 1 6
Total 49 102 37 188
CR 85.7% 82.4% 51.4% 77.1%
Aggregate excluding “Unclassified” and “Measurement error”
Total 46 98 35 179
CR 91.3% 85.7% 54.3% 81.0%

CR: concordance rate, PPV: positive predictive value

培養同定結果を1菌種,複数菌種に分けて比較した結果をTable 3に示す。培養同定1菌種の一致率は,菌種による差はみられず,すべて80%以上であった。一方,複数菌種では,グラム陽性菌のみ,グラム陰性菌のみの一致率は80%以上だが,グラム陽性菌と陰性菌混合検体の一致率が51.4%と低かっ‍た。

Table 3  Comparison of UF-5000 and culture (Monomicrobial, Polymicrobial)
UF-5000 Culture (Monomicrobial) Total
Gram Positive Gram Negative
STAPH ENT-C OTHER GPR ENT-R PA
Gram Positive? 8 11 6 8 3 0 36
Gram Negative? 0 0 0 0 64 4 68
Gram Pos/Neg? 1 0 0 1 9 0 11
Unclassified 0 0 1 0 1 0 2
Measurement error 0 1 0 1 1 0 3
Total 9 12 7 10 78 4 120
CR 88.9% 91.7% 85.7% 80.0% 82.1% 100.0% 84.2%

CR: concordance rate, PPV: positive predictive value

STAPH: Staphylococcus spp., ENT-C: Enterococcus spp., OTHER: Other gram positive cocci, GPR: Gram positive rod, ENT-R: Enterobacteriaceae, PA: Pseudomonas aeruginosa

UF-5000 Culture (Polymicrobial) Total
Gram Positive Gram Negative Gram Pos/Neg
Gram Positive? 9 1 10 20
Gram Negative? 0 16 6 22
Gram Pos/Neg? 2 1 19 22
Unclassified 0 0 1 1
Measurement error 0 2 1 3
Total 11 20 37 68
CR 81.8% 80.0% 51.4% 64.7%

CR: concordance rate , PPV: positive predictive value

4. 3法(UF-5000,グラム染色,培養同定)の比較

3法の一致状況をTable 4に示す。3法の結果がすべて一致した検体は全体の71.8%で,UF-5000のみ不一致が9.6%,グラム染色のみ不一致が5.3%,培養同定のみ不一致が7.4%であった。

Table 4  Matching status by the three methods (n = 188)
Matching status Number (%)
Three methods matched 135 (71.8%)
UF-5000 only mismatched 18 (9.6%)
Gram staining only mismatched 10 (5.3%)
Culture only mismatched 14 (7.4%)
Three methods mismatched 2 (1.1%)
Results of UF-5000
“Unclassified” or “Measurement error”
9 (4.8%)

Figure 3にUF-5000のみが不一致だった検体のBACTスキャッタグラム例を示す。UF-5000のみ不一致18件中7件はグラム陽性菌と陰性菌の混合検体で,グラム陽性菌または陰性菌のどちらかの菌数が105/mL未満と少なく,少ない菌を検出できずに不一致となっていた。この不一致の傾向は,比較的総細菌数が少ない検体(105~106/mL)で多く見られた(Figure 3-Sample 1)。総細菌数が多い検体(108/mL以上)ではBACTスキャッタグラムのドット分布が膨化し,グラム陽性菌およびグラム陰性菌をGram Pos/Neg?と判定した例が2件あった(Figure 3-Sample 2)。また,BACTスキャッタグラムドット分布角度を目視判定すると,他2法と一致しているように見えるが,アルゴリズム判定結果では不一致となった検体が4件あった(Figure 3-Sample 3–6)。

Figure 3 

Scattergrams and the test results of the UF-5000 mismatched samples

V  考察

UTIは臨床経過から急性と慢性,尿路および全身の明らかな基礎疾患の有無から単純性と複雑性,感染の部位により上部尿路(腎盂腎炎),下部尿路(膀胱炎)に大別され,原因菌の種類,治療法などが異なる。急性単純性膀胱炎や腎盂腎炎では,グラム陰性桿菌が約80%を占め,そのうち約90%がEscherichia coliである。また,閉経前女性の急性単純性膀胱炎ではStaphylococcus saprophyticusなどのグラム陽性菌も17%ほどを占めるとされている。一方,膀胱直腸障害や前立腺肥大などの尿通過障害を有する症例や尿道カテーテル挿入中に発症する複雑性尿路感染では,腸内細菌科細菌やPseudomonas aeruginosaなどのブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の他,グラム陽性球菌(Enterococcus属,Staphylococcus属など),時に真菌など多岐にわたり,薬剤耐性菌や複数菌が原因菌となることも多い3)。UTIにおいて原因菌特定は抗菌薬選択に有用なだけでなく,病態推定に繋がる情報にもなり得る。原因菌検索の迅速検査としては,一般に尿グラム染色が実施されており,本検討でのグラム染色と培養同定の一致率は85.1%であった。UF-5000細菌弁別判定はグラム染色性のみの情報であるが,グラム染色と近似した性能を有し,原因菌検索のスクリーニング検査として,迅速報告ができる有用な検査法と言える。

結果の不一致はグラム染色,培養同定が要因の場合もあり,Lactobacillus spp.,Gardnerella spp.などのグラム不定菌や培養条件に合わない菌の存在も疑われる。また,本検討では抗菌薬投与の有無を調査していないため,抗菌薬の影響なども疑われる。UF-5000が不一致となった要因として,1つには細菌数が考えられる。細菌弁別判定には,BACTスキャッタグラム上のドット分布にある程度の集積が必要である。総細菌数では最低105/mL以上が必要と考えられ,グラム陽性菌/陰性菌の混合検体では,グラム陽性菌,陰性菌それぞれで105/mL以上の菌数が必要と思われた。また,BACTスキャッタグラムドット分布の目視判定では他2法と一致,アルゴリズム判定では不一致となる例があった。判定アルゴリズムを改良工夫することにより,更なる精度向上が期待できるものと考えられた。

前機種UF-1000iでもBACTスキャッタグラムの分布からグラム染色性や形態の推定が可能であるとの報告がある4)~6)。UF-1000iはUF-5000とは異なる核酸染色法,半導体レーザーを用いて細菌を測定している。細菌弁別判定プログラムはオプションとして追加可能であるが,UF-5000とは異なる判定プログラムを用いている。中川ら4)は,UF-1000iスキャッタグラムのX軸から30度毎の3区分に分け,角度30度以下の領域では,グラム陰性桿菌が90%を占めたと報告している。村谷ら5)は,スキャッタグラムの角度30度未満を示した検体の89.2%ではグラム陰性菌が分離され,グラム陽性菌のみが分離された検体では83.3%が30度以上を示したことから,ある程度の菌種推定が可能であると報告している。小澤ら7)は,30度より下の下方から30度より上の上方まで幅広く分布する“幅広パターン”では,複数菌が多く検出され,多剤耐性菌検出頻度が有意に高かったと報告している。UF-1000i細菌弁別判定プログラムでは,結果表示はRods?(桿菌疑い),Cocci/Mixed?(球菌/混合)の2種類である。このプログラムを用いた報告では,山根ら6)が培養同定との比較において,一致率72.8%,的中率がRods? 67.3%,Cocci/Mixed? 74.3%であったと報告している。今回検討した最新機種UF-5000細菌弁別判定は,報告形式がグラム染色性で,機能が標準搭載されており,さらに判別性能が向上していると考えられた。UF-5000での薬剤耐性菌検出に関しては検討を行っていないが,更なる分析性能の向上などにより,耐性菌疑いを判別し,初期治療薬選択において,より正確な情報を提供できる可能性がある。

UF-5000細菌弁別判定の実臨床での運用は,尿路原性敗血症(ウロセプシス)のリスクが高いグラム陰性桿菌の判定に関しては,UTI原因菌としての検出頻度も高く,UF-5000的中率も高いため,Gram Negative?はそのまま報告し,検出頻度が少なく,UF-5000的中率が低いGram Positive?,Gram Pos/Neg?は,グラム染色を迅速実施後に報告するなど,運用方法によって結果の信頼度を高めることも可能である。また,前機種UF-1000iの報告ではUTIにおける細菌尿の陰性予測率が約99%と極めて高い8),9)と報告されている。この性質とマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析装置(MALDI-TOF MS)による菌の迅速同定との組合せにより,UTI原因菌の同定を迅速に行うことができたとの報告もあり,フローサイトメトリーを原理とした全自動尿中有形成分分析装置の新たな活用法として注目され‍る10),11)

VI  結語

UF-5000細菌弁別判定による尿グラム染色性の迅速報告は,UTIの初期治療薬選択において有用な情報を提供可能であると考える。グラム染色性の推定情報であるため,結果表記法や信頼性について,臨床と相談してルールを決める必要はあると思われるが,性能はグラム染色に近似しており,手間やコストをかけることなく,安定かつ迅速に報告できる利点は大きい。今後,アルゴリズム判定方法の改良によっては,更なる性能向上が望めるものと期待する。

 

本論文の要旨は第65回日本医学検査学会(2016年9月,神戸)において報告した。

COI開示

本論文に関連し,開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献
 
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