Possibility of harmonization for immune serum items: Second report

Abstract

我々は，前立腺特異抗原（prostate specific antigen; PSA），フェリチン（ferritin），αフェトプロテイン（α-fetoprotein; AFP），癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen; CEA）を対象項目として外部精度評価調査試料の適正性の検討を行い，プール血清の有用性について第1報で報告した。今回，機器，試薬メーカー13社を対象として再検討を行った。異なる患者血清を用いて，PSA，フェリチン，AFPでは2系列，CEAでは4系列，5段階の希釈系列の調査試料を作製した。測定を行った結果，PSAでの測定値のCVは8.6～11.9%となったが乖離する値は認めなかった。フェリチンでのCVは13.5～19.5%となり，2機種で試料の由来による差を認めた。AFPでは1機種で1試料のみ乖離する値を認め，CVが10.6%となったが，他の試料でのCVは4.5～7.2%であった。CEAでは異なる臓器癌患者の血清より作製した試料を測定した結果，大腸癌患者由来の試料でのCVの平均は10.9%，乳癌患者由来の試料では19.9%となり，臓器癌の違いにより反応性に差を認めた。

I　 はじめに

免疫血清検査項目では，基準測定法や標準物質は存在せず，測定体系の標準化が達成されていない。各団体が外部精度評価調査を実施し，試薬および機器間差の要因を報告しているが，調査によりその評価は異なっている。その要因の一つとして，調査に用いた試料の反応性の違い（マトリックス効果）が推定されている。

以前，我々は機器メーカー4社を対象に，プール血清，日臨技精度管理調査試料，市販コントロールを調査試料とし，前立腺特異抗原（prostate specific antigen; PSA），フェリチン（ferritin），αフェトプロテイン（α-fetoprotein; AFP），癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen; CEA）の4項目を評価した結果，プール血清より作製した試料の成績が良好であったことを報告した^1),2)。しかし，プール血清でも評価基準を満たさない試料が存在したことから，どのような背景の患者血清を用いて試料を作製したかを明確にする必要性が示唆された。今回，さまざまな疾患の患者の血清を用いてプール血清を作製し，機器，試薬メーカー13社を対象として検討を行った。

II　 対象及び試料

1． 対象

PSA，フェリチン，AFP，CEAを測定項目とし，機器，試薬メーカー13社を対象として調査を実施した（Table 1）。PSAは10社13種類，フェリチンは12社16種類，AFPは10社12種類，CEAは10社11種類の機器，試薬を対象とした。なお，本調査は岩手医科大学医学部倫理審査委員会の承認（H25-112）のもと，日臨技検査値標準化委員会が実施した。

Table 1 

Measurement devices and reagents

A：PSA

メーカー	機器	試薬
アボット	アーキテクト i2000SR	アーキテクト・PSA
オーソ	ビトロス5600	ビトロス PSAII試薬パック
シスメックス	HISCL-5000	HISCL PSA試薬
シーメンス	アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス PSA
シーメンス	ディメンション EXL200	フレックスカートリッジ TPSA
ベックマン・コールター	アクセス 2	アクセス ハイブリテック PSA試薬
ロシュ	コバス e602	エクルーシス試薬 PSA II
積水メディカル	日立 7170	ナノピア PSA
東ソー	AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (PSAII)
富士レビオ	ルミパルスG1200	ルミパルス PSA-N
富士レビオ	ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト PSA
和光純薬	スフィアライト ワコー	スフィアライト PSA［II］
和光純薬	日立 7180	LTオートワコー PSA (2)

B：ferritin

メーカー	機器	試薬
アボット	アーキテクト i2000SR	アーキテクト・フェリチン
オーソ	ビトロス5600	ビトロス フェリチン 試薬パック
シスメックス	HISCL-5000	HISCL フェリチン試薬
シーメンス	アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス FER
シーメンス	ディメンション EXL200	フレックスカートリッジ FERR
ニットーボーメディカル	日立 7170S	N-アッセイ LA フェリチン ニットボー
ベックマン・コールター	アクセス 2	アクセス フェリチン試薬
ロシュ	コバス e602	エクルーシス試薬 フェリチン
極東製薬	東芝 FX8	ランピア ラテックス フェリチン
東ソー	AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (FER)
富士レビオ	ルミパルスG1200	ルミパルス フェリチン-N
富士レビオ	ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト フェリチン
和光純薬	スフィアライト ワコー	スフィアライト フェリチン
和光純薬	日立 7180	LTオートワコー フェリチン
LSIメディエンス	日立 7180	イアトロ フェリチン
LSIメディエンス	エプピア NV7	エルピアエース フェリチンII

C：AFP

メーカー	機器	試薬
アボット	アーキテクト i2000SR	アーキテクト・AFPEx
オーソ	ビトロス5600	ビトロス AFP試薬パック
シスメックス	HISCL-5000	HISCL AFP試薬
シーメンス	アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス AFP
ベックマン・コールター	アクセス 2	アクセス AFP 試薬
ロシュ	コバス e602	エクルーシス試薬 AFP II
東ソー	AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (AFP)
富士レビオ	ルミパルスG1200	ルミパルス AFP-N
富士レビオ	ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト AFP
和光純薬	スフィアライト ワコー	スフィアライト AFP
和光純薬	ミュータスワコー i30	ミュータスワコー AFP-L3
LSIメディエンス	ステイシア	ステイシアCLEIA AFP

D：CEA

メーカー	機器	試薬
アボット	アーキテクト i2000SR	アーキテクト・CEA
オーソ	ビトロス5600	ビトロス CEA試薬
シスメックス	HISCL-5000	HISCL CEA試薬
シーメンス	アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス CEA
ベックマン・コールター	アクセス 2	アクセス CEA 試薬
ロシュ	コバス e602	エクルーシス試薬 CEA II
東ソー	AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」IICEA
富士レビオ	ルミパルスG1200	ルミパルス CEA-N
富士レビオ	ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト CEA
和光純薬	スフィアライト ワコー	スフィアライト CEA
LSIメディエンス	ステイシア	ステイシアCLEIA CEA

2． 試料

さまざまな疾患の患者から得られた血清を用い，検査項目ごとに高濃度試料を作製した（Table 2）。さらにプールした低濃度血清を用いて，高濃度試料を希釈して5段階の希釈系列を作製した。PSAは複数の前立腺癌患者のプール血清と，任意の前立腺癌患者1名の採血時間が異なる血清を混合した試料を高濃度試料とし，PSA濃度が0.003 ng/mLの患‍者プール血清で希釈し2系列の試料を作製した。フェリチンは不特定の患者のプール血清と，任意の急性骨髄性白血病（AML）患者1名の採血時間が異なる血清を混合した試料を高濃度試料とし，フェリチン濃度が4.0 ng/mLの患者プール血清で希釈し2系列の試料を作製した。AFPは肝癌，肝硬変患者を対象としてPIVKA-II濃度40 mAU/mL以上と40 mAU/mL以下の2群に分けたプール血清を高濃度試料とし，AFP濃度が4.4 ng/mLの健常者プール血清で希釈し2系列の試料を作製した。なお，PIVKA-IIの測定はルミパルス G1200（富士レビオ）を用いて岩手医科大学附属病院中央臨床検査部で行った。CEAは明らかな癌の転移を認めない大腸癌，直腸癌，乳癌，肺癌の患者のプール血清を高濃度試料とし，CEA濃度が1.5 ng/mLの健常者プール血清で希釈し，4系列の試料を作製した。

Table 2 

Origins of measurement samples

A：PSA

試料	高濃度試料	希釈用試料
P1～5	前立腺癌　19例	不特定患者
P6～10	任意患者（前立腺癌）　1例

B：ferritin

試料	高濃度試料	希釈用試料
F1～5	不特定患者　22例	不特定患者
F6～10	任意患者（AML）　1例

C：AFP

試料	高濃度試料	希釈用試料
A1～5	肝癌，肝硬変 （PIVKA-II　40 mAU/mL以上）　13例	健常者
A6～10	肝癌，肝硬変 （PIVKA-II　40 mAU/mL以下）　14例

D：CEA

試料	高濃度試料	希釈用試料
C1～5	大腸癌　13例	健常者
C6～10	直腸癌　10例
C11～15	乳癌　11例
C16～20	肺癌　15例

III　 方法

1． 測定方法

機器，試薬メーカー13社を対象として，冷蔵状態で試料を送付し，Table 1に示す機器で測定を行った。

2． 評価方法

各試料の測定値より平均値，変動（CV）を求めて評価を行った。また，総平均値を基準として線形回帰式を希釈系列別に求め，得られた回帰式の傾きの比を求めた。尚，統計計算はエクセル（マイクロソフト社）を用いて行った。

IV　 結果

1． PSA

PSAでのCVは8.6～11.9%であった（Table 3A）。各方法の測定値には比例系統誤差を認めたが，乖離した値は認めず，直線性が認められた（Figure 1）。各方法での試料P1～5とP6～10の回帰式の傾きの比は94～108%であった（Table 4A）。

Table 3 

Mean and variation of each samples

A：PSA

試料	平均値	CV（%）	試料	平均値	CV（%）
P1	3.3	11.9	P6	3.4	11.1
P2	6.5	10.6	P7	6.7	10.9
P3	12.8	8.9	P8	13.1	11.1
P4	24.9	9.5	P9	25.5	10.9
P5	48.2	8.6	P10	49.2	8.6

（ng/mL）

B：ferritin

試料	平均値	CV（%）	試料	平均値	CV（%）
F1	18.1	19.1	F6	21.1	19.4
F2	33.2	17.1	F7	38.7	19.5
F3	62.7	15.4	F8	73.7	16.9
F4	121.1	14.7	F9	140.4	15.8
F5	233.0	13.5	F10	272.9	14.8

（ng/mL）

C：AFP

試料	平均値	CV（%）	試料	平均値	CV（%）
A1	18.9	5.7	A6	15.9	5.0
A2	32.5	6.1	A7	34.0	4.5
A3	59.9	5.8	A8	49.6	4.6
A4	114.4	7.2	A9	94.5	6.5
A5	223.9	10.6	A10	181.6	5.3

（ng/mL）

D：CEA

	平均値	CV（%）	試料	平均値	CV（%）
C1	7.7	11.5	C6	7.1	12.8
C2	17.2	10.0	C7	12.8	12.2
C3	25.7	10.0	C8	23.6	12.6
C4	50.4	10.3	C9	45.9	12.3
C5	99.9	12.8	C10	89.2	15.9
C11	8.2	18.8	C16	7.6	15.9
C12	15.0	19.3	C17	13.8	17.9
C13	28.7	20.6	C18	25.9	16.8
C14	56.7	19.5	C19	49.8	16.1
C15	110.4	21.3	C20	96.9	18.6

（ng/mL）

Figure 1 

Scatter plot of PSA

Table 4 

Ratio of slope of relation of each method

A：PSA

機器	試薬	P6-10/P1-5（%）
アーキテクト i2000SR	アーキテクト・PSA	103
ビトロス5600	ビトロス PSAII試薬パック	97
HISCL-5000	HISCL PSA試薬	97
アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス PSA	108
ディメンション EXL200	フレックスカートリッジ TPSA	105
アクセス 2	アクセス ハイブリテック PSA試薬	94
コバス e602	エクルーシス試薬 PSA II	99
日立 7170	ナノピア PSA	101
AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (PSAII)	97
ルミパルスG1200	ルミパルス PSA-N	102
ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト PSA	99
スフィアライト ワコー	スフィアライト PSA［II］	99
日立 7180	LTオートワコー PSA (2)	99

B：ferritin

機器	試薬	F6-10/F1-5（%）
アーキテクト i2000SR	アーキテクト・フェリチン	121
ビトロス5600	ビトロス フェリチン 試薬パック	95
HISCL-5000	HISCL フェリチン試薬	107
アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス FER	104
ディメンション EXL200	フレックスカートリッジ FERR	97
日立 7170S	N-アッセイ LA フェリチン ニットボー	95
アクセス 2	アクセス フェリチン試薬	99
コバス e602	エクルーシス試薬 フェリチン	95
東芝 FX8	ランピア ラテックス フェリチン	95
AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (FER)	87
ルミパルスG1200	ルミパルス フェリチン-N	109
ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト フェリチン	106
スフィアライト ワコー	スフィアライト フェリチン	103
日立 7180	LTオートワコー フェリチン	100
日立 7180	イアトロ フェリチン	92
エプピア NV7	エルピアエース フェリチンII	95

C：AFP

機器	試薬	A6-10/A1-5（%）
アーキテクト i2000SR	アーキテクト・AFPEx	102
ビトロス5600	ビトロス AFP試薬パック	99
HISCL-5000	HISCL AFP試薬	102
アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス AFP	98
アクセス 2	アクセス AFP 試薬	106
コバス e602	エクルーシス試薬 AFP II	104
AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」II (AFP)	107
ルミパルスG1200	ルミパルス AFP-N	100
ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト AFP	102
スフィアライト ワコー	スフィアライト AFP	104
ミュータスワコー i30	ミュータスワコー AFP-L3	105
ステイシア	ステイシアCLEIA AFP	79

D：CEA

機器	試薬	C6-10/C1-5（%）	C11-15/C1-5（%）	C16-20/C1-5（%）
アーキテクト i2000SR	アーキテクト・CEA	109	106	127
ビトロス5600	ビトロス CEA試薬	108	76	64
HISCL-5000	HISCL CEA試薬	94	133	125
アドヴィア ケンタウルス XP	ケミルミ ケンタウルス CEA	99	135	124
アクセス 2	アクセス CEA 試薬	90	84	101
コバス e602	エクルーシス試薬 CEA II	116	91	82
AIA-2000	ST Eテスト「TOSOH」IICEA	102	96	92
ルミパルスG1200	ルミパルス CEA-N	101	101	116
ルミパルスPrestoII	ルミパルスプレスト CEA	106	86	94
スフィアライト ワコー	スフィアライト CEA	93	97	107
ステイシア	ステイシアCLEIA CEA	83	98	83

2． フェリチン

フェリチンでのCVは13.5～19.5%であった（Table 3B）。各方法の測定値には比例系統誤差を認めたが，乖離した値は認めなかった（Figure 2）。各方法での試料F1～5とF6～10の回帰式の傾きの比を求めた結果，アーキテクトi2000SRは121%，AIA-2000は87%であったが，それ以外の方法では92～109%であった（Table 4B）。

Figure 2 

Scatter plot of ferritin

3． AFP

AFPでは試料A5でのCVが10.6%となったが，それ以外のCVは4.5～7.2%であった（Table 3C）。各測定値には比例系統誤差を認めた（Figure 3）。各方法での試料A1～5とA6～10の回帰式の傾きの比を求めた結果，ステイシアは79%であったが，それ以外の方法では98～107%であった（Table 4C）。

Figure 3 

Scatter plot of AFP

4． CEA

CEAでの各試料のCVは大腸癌のC1～5で10.0～12.8%，直腸癌のC6～10では12.2～15.9%，乳癌のC11～15で18.8～21.3%，肺癌のC16～20は15.9～18.6%であった（Table 3D）。各方法の測定値には比例系統誤差を認めた（Figure 4）。CVの平均値が最小となった試料C1～5と，他の希釈系列の回帰式の傾きの比を求めた結果，試料C6～10では83～116%，C11～15では76～135%，C16～20は82～127%であった（Table 4D）。

Figure 4 

Scatter plot of CEA

V　 考察

今回我々は，さまざまな疾患の患者のプール血清から希釈系列を作製し，PSA，フェリチン，AFP，CEA測定における試料の反応性について検討を行った。各機器および試薬の違いばかりではなく，測定に使用した患者血清の違いにより測定結果は異なる挙動を示したことから，試料のマトリックス効果による影響が推定された。

PSAを対象として2系統の希釈系列を測定した結果，比例系統誤差を認め各試料のCVは8.6～11.9%となったが，乖離する試料は存在しなかった。また，各方法で直線性を認め，プール血清由来と1患者由来の回帰式の傾きは一致したことから，各試薬での反応性に差はないと推察された。

フェリチンを対象として2系統の希釈系列を測定した結果，比例系統誤差を認め，各試料のCVは13.5～19.5%となった。各方法で直線性を認めたが，回帰式の傾きの比はアーキテクトi2000SRでは121%，AIA-2000は87%となり，試料により差を認めた。

AFPを対象として肝疾患のマーカーの一つであるPIVKA-II濃度で2群化した2系統の希釈系列を測定した結果，比例系統誤差を認め，試料A5のCVは10.6%となった。試料A1～4はA5をプール血清で希釈し作製したが，僅かな組成の差により反応性が異なったものと推定された。回帰式の傾きの比はステイシアで79%となり試料により差を認めた。

CEAを対象として4系統の希釈系列を測定した結果，用いる試料により変動の差を認めた。各希釈系列でのCVの平均は大腸癌患者では10.9%，直腸癌患者で13.3%，乳癌患者で19.9%，肺癌患者で17.1%であった。各系列の回帰式の傾きの差を求めた結果，試料の由来により差を認めたことから，各方法の抗CEA抗体と各臓器癌が産生するCEAの反応性には差があると推定された。

各方法間の測定値の互換性の評価は，パネル血清の測定により行うことが理想的である。パネル血清の作製方法は明確に定義されてはいないが，1患者1採血の残余血清を用いることが望ましいと考える。しかし，必要検体量の微量化，採血における患者負担の軽減が行われている現状では，残余血清の収集量には限界があり，パネル血清の作製は困難である。

日臨技精度管理調査免疫血清部門は2011年よりプール血清を用いたメーカーサーベイを実施し，調査試料の適正性の評価を行っている。その結果，調査試料とプール血清の反応性に差異を生じることを報告している³⁾。また，河野ら⁴⁾は5年間のメーカーサーベイでのプール血清での変動を検証した結果，CEAでの変動は12.1～46.5%となり，プール血清でもロット間差が生じることから，今後の検討課題として試料のマトリックス効果が及ぼす影響を明確にする必要性を指摘している。疾患の違いによる試薬の反応性との関連は明らかではないが，プール血清の作製に際しては原疾患などを明確にする必要があることが示唆された。今後，試料作製にあたり患者情報などを蓄積し，得られた測定結果を解析しながら，種々の要因を明確にすることが求められる。

現在，国際的なハーモナイゼーションへの取組みは米国，日本，韓国の各機関が参画するInternational Consortium for Harmonization of Clinical Laboratory Results（ICHCLA）が中心となり行われている。日本から日本臨床検査標準協議会（Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards; JCCLS）が参加し，各定量検査項目の参照物質の開発を行っている。今後，免疫血清検査項目を対象とした参照物質の作製が望まれる。

VI　 結語

免疫血清検査項目のハーモナイゼーションに際し，その結果を検証する必要があるが評価方法は確立されていない。今回我々は，診断名が明らかな患者血清より作製した調査試料を用いて，機器や試薬の違いによる反応性の違いを評価した。PSAでは反応性に差異を認めなかったが，フェリチン，AFPでは試料により挙動が異なる機器や試薬を認めた。CEAでは原発癌の違いにより各方法での測定値に差異を認めた。今後，原疾患などを考慮した適切な調査試料の作製方法を確立する必要がある。

 

なお，本論文の要旨は第65回日本医学検査学会で発表した。

謝辞

今回論文作成に際し，ご高閲を賜った岩手医科大学医学部臨床検査医学講座の諏訪部章教授に深謝します。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

• 1)  日本臨床衛生検査技師会：平成23年度日臨伎臨床検査精度管理調査報告書，東京，2012.
• 2)  斎藤 篤，他：「免疫血清検査におけるハーモナイゼーションの可能性について　第2報」，第65回日本医学検査学会抄録集．
• 3)  日本臨床衛生検査技師会：平成24年度日臨伎臨床検査精度管理調査報告書，東京，2013.
• 4)  河野 久，他：「免疫血清検査におけるハーモナイゼーションの可能性について　第1報」，第65回日本医学検査学会抄録集．