2018 Volume 67 Issue 5 Pages 755-759
我が国で市販されているBordet-Gengou血液寒天培地（ボルデジャング培地），ボルデテラCFDN寒天培地（CFDN寒天培地），およびチャコール寒天培地の3種類の百日咳菌（Bordetella pertussis; B. pertussis）分離用培地について，発育支持能および夾雑菌抑制能を比較検討した。発育支持能試験にはB. pertussisの臨床分離株を用い，夾雑菌抑制能試験には分離頻度の高い細菌のATCC株または臨床分離株を用いた。両試験はMiles & Misra法に準拠し行った。発育支持能試験では，CFDN寒天培地は10−5希釈まで，ボルデジャング培地およびチャコール寒天培地は10−6希釈まで発育支持を認めた。また10−5希釈での発育コロニー数の平均値は，ボルデジャング培地，CFDN寒天培地およびチャコール寒天培地で，36.5，20.4，および40.5 CFUであった。夾雑菌抑制能試験では，ボルデジャング培地には全ての夾雑菌が発育し，チャコール寒天培地は全ての夾雑菌を抑制した。CFDN寒天培地はMoraxella catarrhalisを抑制できず，巨大コロニーが形成されてB. pertussis分離の妨げになる可能性があった。以上の結果から，チャコール寒天培地は発育支持能および夾雑菌抑制能に優れ，検討した3種類の培地の中でB. pertussis分離に最も適した培地と考えられた。
百日咳は百日咳菌（Bordetella pertussis; B. pertussis）の感染により引き起こされる呼吸器感染症で，3カ月未満の乳児では重症化し，時として致命的となる。近年，ジフテリア・破傷風・百日咳混合（diphtheria-tetanus-acellular pertussis; DTaP）ワクチンの高い接種率にもかかわらず，年長児や成人を中心に百日咳の増加傾向が認められ問題視されている1)。
百日咳の病原診断には実験室診断が不可欠であり，そのゴールドスタンダードは百日咳菌の分離である2)。B. pertussisは一般的な細菌培養に用いられるヒツジ血液寒天培地，チョコレート寒天培地に発育せず，B. pertussisの分離には専用培地が必要である。我が国ではB. pertussisの分離培地としてBordet-Gengou血液寒天培地（ボルデジャング培地）およびボルデテラCFDN寒天培地（CFDN寒天培地）が生培地として，チャコール寒天培地が粉末培地として市販されている。今回，それら3種のB. pertussis分離用培地の発育支持能および夾雑菌抑制能を比較検討した。
ボルデジャンク培地（極東製薬工業），CFDN寒天培地（日研生物医学研究所），およびチャコール寒天培地（OXOID社）の3種類とした。
2． 供試菌株発育指示能試験：B. pertussis 臨床分離株 15株
夾雑菌抑制能試験：小児の鼻腔から検出される頻度の高い菌を供試菌株（10株）とした。その内訳は，Streptococcus pneumoniae ATCC49619 1株，Haemophilus influenzae（β-lactamase non-producing ampicillin susceptible［BLNAS］）ATCC49766 1株，Haemophilus influenzae（β-lactamase non-producing ampicillin resistant［BLNAR］）ATCC49247 1株，Stapylococcus aureus（methicillin-resistant Stapylococcus aureus［MRSA］）ATCC43300 1株，Moraxella catarrhalis 臨床分離株 6株。
3． 方法発育支持能および夾雑菌抑制能の両試験はMiles & Misra法3)に準拠し行った。すなわち，各菌株を滅菌生理食塩水にMcFarland 0.5相当に懸濁した菌液を作成し，その後10−1から10−7まで段階希釈した。各菌株の菌液希釈系列より20 μLずつを各培地に滴下し，35℃好気培養にてB. pertussisは7日間，その他の菌株は24時間培養後，発育したコロニー数およびコロニー形態を観察した。
なお，本研究は当院の治験・臨床研究審査委員会の承認を得て行った（No. 28-018，2016年8月10日）。
発育支持能試験の結果をTable 1に示す。CFDN寒天培地は10−5希釈まで，ボルデジャング培地およびチャコール寒天培地は10−6希釈まで全ての菌株の発育支持を認めた。また，10−5希釈での発育コロニー数の平均値（> 100を100として計算）は，ボルデジャング培地，CFDN寒天培地，およびチャコール寒天培地において，36.5，20.4，および40.5 CFUであった。コロニー形態およびコロニー径に明確な差は認められなかった。
| Medium and strain | Dilution | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 10−3 | 10−4 | 10−5 | 10−6 | 10−7 | |
| Bordet-Gengou agar medium | |||||
| B. pertussis 1 | > 100 | 63 | 5 | 2 | 0 |
| B. pertussis 2 | > 100 | > 100 | 57 | 36 | 5 |
| B. pertussis 3 | > 100 | 62 | 10 | 5 | 2 |
| B. pertussis 4 | > 100 | 77 | 26 | 4 | 1 |
| B. pertussis 5 | > 100 | 71 | 13 | 7 | 3 |
| B. pertussis 6 | > 100 | > 100 | 45 | 7 | 0 |
| B. pertussis 7 | > 100 | > 100 | 33 | 10 | 0 |
| B. pertussis 8 | > 100 | > 100 | 39 | 15 | 1 |
| B. pertussis 9 | > 100 | > 100 | 47 | 10 | 3 |
| B. pertussis 10 | > 100 | > 100 | > 100 | 26 | 5 |
| B. pertussis 11 | > 100 | > 100 | 33 | 10 | 0 |
| B. pertussis 12 | > 100 | > 100 | 57 | 21 | 2 |
| B. pertussis 13 | > 100 | 74 | 19 | 3 | 0 |
| B. pertussis 14 | > 100 | > 100 | 28 | 6 | 0 |
| B. pertussis 15 | > 100 | > 100 | 35 | 12 | 3 |
| Bordetella CFDN agar medium | |||||
| B. pertussis 1 | > 100 | 32 | 2 | 0 | 0 |
| B. pertussis 2 | > 100 | 85 | 26 | 17 | 2 |
| B. pertussis 3 | > 100 | 37 | 4 | 2 | 0 |
| B. pertussis 4 | > 100 | 34 | 12 | 2 | 0 |
| B. pertussis 5 | > 100 | 55 | 13 | 1 | 0 |
| B. pertussis 6 | > 100 | 60 | 21 | 6 | 0 |
| B. pertussis 7 | > 100 | > 100 | 34 | 3 | 0 |
| B. pertussis 8 | > 100 | > 100 | 39 | 13 | 3 |
| B. pertussis 9 | > 100 | > 100 | 21 | 9 | 2 |
| B. pertussis 10 | > 100 | > 100 | 42 | 11 | 0 |
| B. pertussis 11 | > 100 | 41 | 12 | 0 | 0 |
| B. pertussis 12 | > 100 | > 100 | 16 | 0 | 0 |
| B. pertussis 13 | > 100 | 46 | 11 | 2 | 0 |
| B. pertussis 14 | > 100 | > 100 | 33 | 2 | 0 |
| B. pertussis 15 | > 100 | 45 | 20 | 4 | 0 |
| Charcoal agar medium with Bordetella selective supplement | |||||
| B. pertussis 1 | > 100 | 45 | 7 | 1 | 0 |
| B. pertussis 2 | > 100 | > 100 | 39 | 17 | 4 |
| B. pertussis 3 | > 100 | 53 | 5 | 3 | 1 |
| B. pertussis 4 | > 100 | 61 | 17 | 8 | 2 |
| B. pertussis 5 | > 100 | 51 | 9 | 5 | 0 |
| B. pertussis 6 | > 100 | > 100 | > 100 | 15 | 2 |
| B. pertussis 7 | > 100 | 65 | 10 | 1 | 0 |
| B. pertussis 8 | > 100 | > 100 | 25 | 11 | 3 |
| B. pertussis 9 | > 100 | > 100 | > 100 | 34 | 5 |
| B. pertussis 10 | > 100 | > 100 | > 100 | 25 | 2 |
| B. pertussis 11 | > 100 | > 100 | 45 | 23 | 3 |
| B. pertussis 12 | > 100 | > 100 | 60 | 17 | 2 |
| B. pertussis 13 | > 100 | > 100 | 23 | 10 | 0 |
| B. pertussis 14 | > 100 | > 100 | 43 | 16 | 3 |
| B. pertussis 15 | > 100 | > 100 | 24 | 6 | 1 |
(CFU/20 μL)
夾雑菌抑制能試験の結果をTable 2に示す。ボルデジャング培地では全ての菌株の発育を抑制できなかった。CFDN寒天培地ではS. pneumoniae，H. influenzae（BLNAS），H. influenzae（BLNAR），およびS. aureus（MRSA）の発育を抑制したが，M. catarrhalis 6株のうち3株の発育を抑制できなかった。ボルデジャング培地に発育したM. catarrhalisのコロニー径は3～6 mm程度であったが，CFDN寒天培地に発育したM. catarrhalisのコロニー径は最大10 mm程度と大きくなった。チャコール寒天培地では全ての菌株の発育を抑制した。
| Medium and strain | Dilution | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10−1 | 10−2 | 10−3 | 10−4 | 10−5 | 10−6 | 10−7 | |
| Bordet-Gengou agar medium | |||||||
| S. pneumoniae ATCC49619 | > 100 | > 100 | 48 | 7 | 0 | 0 | 0 |
| H. influenzae (BLNAS) ATCC49766 | > 100 | > 100 | 100 | 76 | 43 | 24 | 11 |
| H. influenzae (BLNAR) ATCC49247 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 34 | 17 |
| S. aureus (MRSA) ATCC43300 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 61 | 14 |
| M. catarrhalis 1 | > 100 | > 100 | > 100 | 41 | 20 | 16 | 14 |
| M. catarrhalis 2 | > 100 | > 100 | > 100 | 62 | 44 | 23 | 3 |
| M. catarrhalis 3 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 33 | 16 | 2 |
| M. catarrhalis 4 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 79 | 54 | 22 |
| M. catarrhalis 5 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 87 | 16 | 10 |
| M. catarrhalis 6 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 65 | 41 | 19 |
| Bordetella CFDN agar medium | |||||||
| S. pneumoniae ATCC49619 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| H. influenzae (BLNAS) ATCC49766 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| H. influenzae (BLNAR) ATCC49247 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| S. aureus (MRSA) ATCC43300 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 4 | > 100 | 21 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 5 | > 100 | > 100 | 21 | 16 | 3 | 1 | 0 |
| M. catarrhalis 6 | > 100 | > 100 | 36 | 27 | 18 | 16 | 2 |
| Charcoal agar medium with Bordetella selective supplement | |||||||
| S. pneumoniae ATCC49619 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| H. influenzae (BLNAS) ATCC49766 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| H. influenzae (BLNAR) ATCC49247 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| S. aureus (MRSA) ATCC43300 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| M. catarrhalis 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
(CFU/20 μL)
百日咳の実験室診断のゴールドスタンダードはB. pertussisの分離であり，その要である分離用培地について基礎的検討を行った。ボルデジャング培地は発育支持能に優れていたが，夾雑菌抑制試験では全ての夾雑菌の発育を抑制できなかった。ボルデジャング培地には抗菌薬が添加されておらず，夾雑菌を抑制できないため，臨床検体にボルデジャング培地を用いる際には，夾雑菌抑制を目的とした工夫が必要である。
CFDN寒天培地は血液を含まないため培地の長期保存が可能であり4)，B. pertussis分離用培地として頻用されている。しかし，CFDN寒天培地は発育支持能でボルデジャング培地およびチャコール寒天培地よりやや劣る結果であった。CFDN寒天培地にはcefdinirおよびvancomycinが添加されており5)，夾雑菌抑制試験においてほとんどの夾雑菌を抑制したが，M. catarrhalisの株を抑制できなかった。さらに，CFDN寒天培地では発育したM. catarrhalisのコロニー径が非常に大きくなる傾向がある4)。そのためCFDN寒天培地にM. catarrhalisとB. pertussisが同時に発育した場合，M. catarrhalisの巨大コロニーがB. pertussis分離の妨げになるであろう。
チャコール寒天培地は，発育支持能および夾雑菌抑制能の両試験で優れた成績であった。我々はこれまでチャコール寒天培地を使用しており6),7)，LAMP法によるB. pertussis DNA検出例の61%からB. pertussisの分離が可能であった8),9)。これは既存の報告10)と同等以上の成績であり，臨床材料におけるチャコール寒天培地のB. pertussis分離能の高さを示している。以上より，発育支持能および夾雑菌抑制能に優れたチャコール培地はB. pertussis分離に有用と考えられた。ただし，チャコール寒天培地の短所として，生培地が市販されておらず作成に手間がかかること，血液を含む培地のため使用期限が短いこと，および培地の精度管理方法が挙げられる。当院では，チャコール寒天培地の作成時に，培地作成日・作成者を記録するとともに，孵卵器で培地を一昼夜放置し，雑菌混入の有無を確認することで精度管理を行っている。
B. pertussisの薬剤耐性菌として，米国，中国などではerythromycinに耐性を示す株が報告されている11),12)。erythromycinは百日咳治療の第一選択薬であると同時に，予防薬としても使用されており2),13)，erythromycin耐性B. pertussisのまん延は臨床上大きな問題になるであろう。また，我が国ではキノロン系抗菌薬であるnalidixic acidに耐性を示すB. pertussisも分離されている14)。B. pertussisにおける耐性菌の出現を察知するためには，B. pertussisの分離が必須である。平成30年1月に感染症法が一部改定され，百日咳は5類感染症の小児科定点把握疾患から全数把握疾患に変更された15)。したがって，B. pertussisの分離は実験室診断および耐性菌検出の両面から，今後一層重要性を増すことが考えられる。
チャコール寒天培地は発育支持能および夾雑菌抑制能に優れており，本研究において検討した3種類の培地の中でB. pertussis分離に最も適した培地と考えられた。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
