A rapid detection method for ESBL-producing Enterobacteriaceae using glass beads

Abstract

近年，基質特異性拡張型βラクタマーゼ（Extended-spectrum β-lactamases; ESBLs）産生菌の検出頻度は増加傾向であり，それに伴って迅速検出法が多く考案されている。Nordmannによって報告されたESBL NDP（Nordmann/Dortet/Poirel）testは，迅速かつ正確にESBLs産生菌の検出が可能である。しかし，蛋白抽出試薬として20 mmol/L-トリス-塩酸緩衝液（BPERII Bacterial Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific）を用いるため酵素抽出の過程に30分間の時間を要する。そこで，我々はガラスビーズを用いて菌体から酵素を粉砕抽出することでESBLs産生菌を簡便で，迅速かつ安価に検出できるガラスビーズ試験（Glass beads test; GB test）について考案した。今回，GB testの基本性能をNDP testと比較することでESBLs産生菌のスクリーニング検査としての有用性について評価を行った。対象にはESBLsの表現型試験陽性となり，遺伝子型が決定した111株と第3世代セファロスポリン系薬に感受性を示しESBL非産生菌と判定した109株を用いた。GB testとNDP testの判定一致率は100%であった。両検査法の感度，特異度は94.6%，100%であった。さらに，GB testでは酵素抽出時間を30秒に短縮できたことでNDP testと比較して陽性までの検査所要時間が有意に短縮した（p < 0.01）。GB testはESBLs産生菌のスクリーニング法としてNDP testよりも安価でさらに迅速性，簡便性に優れていた。

I　 序文

近年，カルバペネマーゼ産生菌や基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（Extend-spectrum β-lactamases; ESBLs）産生菌などの薬剤耐性菌の検出頻度の増加に伴って迅速検出法が数多く報告されている。特に，ESBLs産生菌の検出頻度は世界的に著しく増加傾向であり^1)～3)，これらを迅速に検出することは適切な抗菌薬治療や感染対策の早期介入に繋がる。現在，ESBLs産生菌の迅速検出法として様々な方法が報告されているが^4)～6)，Nordmannら⁷⁾のESBL NDP（Nordmann/Dortet/Poirel）testは特別な機器を必要とせず感度，特異度ともに良好であり約60分で検出可能である。しかし，NDP testでは酵素抽出の過程で20 mmol/L-トリス-塩酸緩衝液（BPERII Bacterial Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific）を用いるため，時間と手間を要することや試薬コストの問題がある。

我々は安価なガラスビーズを用いることで迅速かつ簡便にβラクタマーゼを粉砕抽出する方法（Glass beads test; GB test）について考案した。今回，保存菌株を用いたGB testの基本性能をNDP testと比較し，ESBLs産生菌の迅速スクリーニング検査としての有用性について評価したので報告する。

なお，本論文は菌株を用いた解析であり個人情報に触れていないため倫理委員会の承認は得ていない。

II　 対象と方法

1． 対象菌株

陽性対象株のESBLs産生菌は，臨床検体から分離同定された第3世代セファロスポリン系薬のいずれかに耐性を示し，表現型確認試験としてAmoxicillin/Clavulanate（AMPC/CVA），Ceftazidime（CAZ），Cefotaxime（CTX），Cefpodoxime（CPDX），Aztreonam（AZT），Cefepime（CFPM）ディスクを用いた Double Disk Synergy Test（DDST）で陽性となった腸内細菌科細菌111株（CTX-M型：102株，SHV型：7株，TEM型：2株）を用いた。また，ESBLs産生菌はシカジーニアス^®ESBL遺伝子型検出キット（関東化学）を用いて遺伝子型の決定を行った。本検討においてTEM型およびSHV型についてシークエンス解析を実施できていないためESBLかどうかは不確かである。そのため，SHV型とTEM型は単独で検出され表現型試験陽性となった株をSHV型ESBL，TEM型ESBLとしてそれぞれの対象に含めた。また，CTX-M型と同時保有のTEM型はnon-ESBLの可能性が高く⁸⁾，さらにKlebsiella pneumoniaeのSHV型は相同性の高い染色体性のLEN-1やSHV-1遺伝子の可能性が高いためnon-ESBLと判断しCTX-M型に含めた^9),10)。陰性対象株は，臨床検体から分離同定された第3世代セファロスポリン系薬全てに感性を示し，ESBL非産生菌と判定した腸内細菌科細菌109株を用いた。

その他に，AmpC型βラクタマーゼ産生菌47株と‍遺伝子型が決定しているカルバペネマーゼ産生菌‍ 9株も同様に評価した。AmpC型βラクタマーゼ‍産‍生‍菌は，第3世代セファロスポリン系薬のいず‍れかに耐性であり，さらにCefmetazole（CMZ）ま‍た‍はFlomoxef（FMOX）に耐性を示し，m-Aminophenylboronic Acid Hydrochoride（BA，和光純薬）50 mg/mLとCPDX，CMZディスクを用いた確認試験で陽性となった株を対象とした。確認試験は，BA添加ディスク（6 μL/disk滴下）の阻止円径が未添加ディスクと比較して5 mm以上拡張した場合に陽性と判定した。

2． 試薬調整

1） NDP test

滅菌精製水16.6 mLに0.5%フェノールレッド溶液2 mLとCTXの最終濃度が3 mg/mLとなるようにCefotaxime sodium salt（和光純薬）55.8 mgを加え，1 mol/LのHClとNaOHで pH 7.8に調整したものをNDP試薬として用いた。NordmannらはCTXにTazobactam（TAZ）を添加した試薬を同時に用いて検査することでESBLs産生菌の確定を行っているが，本検討ではあくまでESBLs産生菌のスクリーニングを目的としているためCTX添加試薬のみを調整した。

2） GB test

pH以外の試薬調整は上記のNDP testと同様に行った。GB testでは試薬とガラスビーズをボルテックスして反応させる際に試薬pHがアルカリ性側へと変化する。そのため，ガラスビーズと試薬混和後にpH 7.8になるように予めpH 6.5に調整したものをGB試薬として用いた。本検討ではpH 6.5と設定したが，ガラスビーズのLot差によるpHの変動に違いがあるかは確認がとれていないため，試薬とガラスビーズを混和時のpHが7.8になるように調整することが重要である。

3． 方法

1） NDP test

マイクロチューブに20 mmol/L-トリス-塩酸緩衝液を150 μL加え，被験菌株1白金耳量（10 μL loop）を懸濁する。vortex adapterを用いて，室温で30分間強く混和後に10,000 g，5分間遠心分離する。分離後の上清30 μLをNDP試薬100 μLへ加え，37℃で30分間インキュベートする。

2） GB test（Figure 1）

Figure 1 

Procedure of GB test

マイクロチューブに3 mmと0.1 mmのガラスビーズ（アズワン）を150 mgずつ加え，被検菌株1白金耳量（10 μL loop）とGB試薬200 μLを加える。30秒間ボルテックス後，37℃で30分間インキュベートする。

被検菌株は，5%ヒツジ血液寒天培地（栄研化学）で37℃，16～20時間，炭酸ガス培養を行ったものを使用した。両検査法においてインキュベート開始後，陽性に転じるまでの時間を5分単位で判定した。判定基準は，陰性コントロール（Escherichia coli ATCC 25922）を使用した場合と比較して黄変したものを陽性とした。GB testとNDP testで全被検菌株における判定一致率を比較し，GB testでのESBLs産生菌とESBL非産生菌を対象とした場合の感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率について評価した。さらに，ESBLs産生菌において両検査法で検査開始から陽性判定までの検査所要時間について比較した。GB testとNDP testの相違点を示す（Table 1）。

Table 1  The differences between GB test and NDP test

相違点		NDP test	GB test
酵素抽出	試薬 方法 時間	20 mmol/L-トリス-塩酸緩衝液 vortex adapterで強く混和 30分間	ガラスビーズ ボルテックス 30秒間
反応試薬	pH 必要量	7.8 100 μL／件	6.5 200 μL／件
価格		30円／件	12円／件

III　 結果

1． 判定一致率

ESBLs産生菌（111株），ESBL非産生菌（109株），AmpC型βラクタマーゼ産生菌（47株），カルバペネマーゼ産生菌（9株）におけるNDP testとGB testの判定一致率は100%であった（Table 2, 3）。

Table 2  Comparison of positive results for ESBL producing and non-producing strain

phenotype	species	genotype	No. of isolates	No. of positive results
				NDP test (%)	GB test (%)
ESBL	Escherichia coli	CTX-M-1 group	19	19/19 (100%)	19/19 (100%)
		CTX-M-1 group, TEM*	7	7/7 (100%)	7/7 (100%)
		CTX-M-2 group	2	2/2 (100%)	2/2 (100%)
		CTX-M-9 group	51	51/51 (100%)	51/51 (100%)
		CTX-M-9 group, TEM*	18	18/18 (100%)	18/18 (100%)
		TEM	2	2/2 (100%)	2/2 (100%)
		SHV	2	1/2 (50%)	1/2 (50%)
	Klebsiella pneumoniae	CTX-M-1 group, TEM*, SHV*	3	3/3 (100%)	3/3 (100%)
		SHV	2	0/2 (0%)	0/2 (0%)
	Klebsiella oxytoca	SHV	1	0/1 (0%)	0/1 (0%)
	Citrobacter koseri	SHV	2	0/2 (0%)	0/2 (0%)
	Proteus mirabilis	CTX-M-2 group	2	2/2 (100%)	2/2 (100%)
non-ESBL Enterobacteriaceae		n.t.**	109	0/109 (0%)	0/109 (0%)

*Accurate β-lactamase typing for TEM and SHVtype, ESBL or penicillinase, were not identified. Strains producing TEM and SHV type β-lactamases simultaneously detected with CTX-M type β-lactamase were assumed to be TEM-1, SHV-1 or LEN-1 type (penicillinase). **Not tested.

Table 3  Comparison of positive results for AmpC type β-lactamase and carbapenemase producing strains

phenotype	species	genotype	No. of isolates	No. of positive results
				NDP test (%)	GB test (%)
AmpC	Escherichia coli	n.t.*	20	1/20 (5%)**	1/20 (5%)**
	Enterobacter cloacae	n.t.*	14	1/14 (7%)**	1/14 (7%)**
	Enterobacter aerogenes	n.t.*	4	0/4 (0%)	0/4 (0%)
	Citrobacter koseri	n.t.*	1	0/1 (0%)	0/1 (0%)
	Citrobacter freundii	n.t.*	7	0/7 (0%)	0/7 (0%)
	Serratia marcescens	n.t.*	1	0/1 (0%)	0/1 (0%)
Carbapenemase	Klebsiella pneumoniae	KPC, TEM, SHV	1	1/1 (100%)	1/1 (100%)
		IMP-1, SHV	2	2/2 (100%)	2/2 (100%)
		OXA-48***, TEM, SHV	1	0/1 (0%)	0/1 (0%)
		GES, SHV	1	1/1 (100%)	1/1 (100%)
	Serratia marcescens	IMP-1	1	1/1 (100%)	1/1 (100%)
	Acinetobacter baumannii	OXA-23***	1	0/1 (0%)	0/1 (0%)
	Pseudomonas aeruginosa	KPC	1	1/1 (100%)	1/1 (100%)
		VIM	1	1/1 (100%)	1/1 (100%)

*Not tested. ** 2 strains, E. coli and E. cloacae, indicated positive in both methods. CTX-M-1 and 9 type β-lactamase gene were detected by PCR, respectively. *** OXA type carbapenemase producing A. baumannii and K. pneumoniae indicated negative in both methods. MIC of cefotaxime about these strains were > 32 μg/μL.

2． 感度，特異度，陽性適中率，陰性的中率

感度94.6%（105/111株），特異度100.0%，陽性的中率100.0%，陰性的中率94.8%であった。ESBLs産生菌の遺伝子型別による感度はCTX-M型100% （102/102株），SHV型14.2%（1/7株），TEM型100%（2/2株）であった。AmpC型βラクタマーゼ産生菌では2株を除いた45株で陰性となり，カルバペネマーゼ産生菌ではOXA型2株を除いた7株で陽性を示した。

3． 検査所要時間の比較

GB testはNDP testに比較してESBLs産生菌を迅速に検出することが可能であった（p < 0.01）。GB testでは，30分間の反応時間でESBLs産生菌の94.6%が陽性へと転じた（Figure 2）。さらに，SHV型で偽陰性を示した6株は反応時間を60分間まで延長することで全株陽性へと転じた。遺伝子型別に見た陽性までの検査所要時間は，CTX-M型11.9 ± 6.6分，SHV型45.0 ± 13.9分，TEM型15.0 ± 0.0分（平均±標準偏差）であった。

Figure 2 

Reaction time required for positive and cumulative frequency with GB test

*6 strains of SHV type ESBL indicated negative result turned positive by prolonging the reaction time up to 60 minutes.

IV　 考察

一般的に，ESBLs産生菌の検出は薬剤感受性試験の結果や選択培地での発育性からその存在を疑い，その後に表現型確認試験としてClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）が推奨するCLSI法¹¹⁾やDDSTを実施するか，PCRで遺伝子型を決定している施設が多い。しかし，これらの方法では検出に時間を要し，さらに検査手技が煩雑となる。Nordmannら⁷⁾はESBLs産生菌の迅速検出法としてNDP testの有用性について報告した。NDP testは，ESBLsがCTXを加水分解し，βラクタム環が開裂する際に生じるH⁺をpHの変化として捉える原理に基づいている。NDP testは前処理の過程で20 mmol/L-トリス-塩酸緩衝液による30分間の酵素抽出を必要とするため手間と時間，コストを要する。GB testでNDP testと同様の試薬を用いると，ガラスビーズの主成分であるアルカリ性物質のSiO₂が試薬中に溶出するためpH上昇の影響を受け，陽性までに時間を要するという問題があった。そのため，ガラスビーズと試薬を混和した際にpH 7.8となるように予めGB testではpH 6.5と低く調整することで影響を軽減できた。さらに，大小2種類のガラスビーズを配合することで破砕効率が向上し，ペリプラズム領域に蓄積されたβラクタマーゼをより迅速に抽出することが可能となり，抽出時間が30秒間と大幅に短縮することができ，操作ステップの簡便化を実現した。今回，結果を省略するが前検討によって両検査法は，培養時間と培養条件が重要であり最も感度よくESBLs産生菌を検出できたのは16～20時間の炭酸ガス培養を行った被検菌株を用いた場合であった。好気培養や24時間以上の長期間培養行った菌株では検出感度が著しく低下し，さらにマッコンキー寒天培地やBTB寒天培地などの糖分解を観察する培地ではコロニーが酸性に傾くため偽陽性となる傾向があるため注意が必要である。両検査法の判定一致率100%と良好で，ESBLs産生菌の検出感度は94.6%（CTX-M型：100%，SHV型：14.2%，TEM型：100%），特異度100%であり，特にCTX-M型において良好な成績を示した。世界的にもESBLs遺伝子はCTX-M型が大半を占めており^12),13)，本邦においては90%以上であることからGB testは非常に有効な検査法となり得る^2),14)。偽陰性となったSHV型6株は判定時間を60分間まで延長することで全株が陽性へと変化し検出感度100%となった。しかし，本邦でのTEM型およびSHV型のESBLの検出頻度の低さから最終の判定時間は30分で設定が可能であると考える。MIC値が低いSHV型では，CTXに対する分解能が弱いため陽性へと変化しにくいと報告があるが⁷⁾，本検討ではMIC-range（2 – > 64 μg/mL）に関係なくCTX-M型と比較して陽性までに時間を要した。これは，CTX-M型のESBLsはCTXに対して高い分解活性を有するためであると考えられた。AmpC型βラクタマーゼ産生菌で陽性を示した2株は遺伝子解析の結果，E. coliはCTX-M-9型，Enterobacter cloacaeはCTM-1型の保有株であった。さらに，DDSTを実施したところ，ClassCのβラクタマーゼに分解されにくいCFPMにおいて阻止帯が確認されESBLs産生菌の表現型試験も陽性を示した。本検討においてAmpC型βラクタマーゼ単独産生株は両検査法で全株が陰性を示したが，過剰産生菌では陽性を示した報告もあることから注意が必要である⁷⁾。また，一部の遺伝子型を除いたカルバペネマーゼ産生菌ではESBL遺伝子の有無に関係なく陽性を示すため，あくまでGB testはESBLs産生菌のスクリーニング試験であり，確定試験ではないことに注意しなければならない。OXA型のカルバペネマーゼは，表現型試験で偽陰性を示しやすいことが報告されており^15),16)，GB testでも同様の結果となった。

当院では，培養1日目にグラム陰性桿菌の発育を認めた際には全症例において血液寒天培地上のコロニーからGB testを実施している。GB testが陽性の場合，主治医へESBLs産生菌疑いであることを中間報告し，CLSIに記載された表現型確認検査を先行して実施することで，後日に薬剤感受性結果とともにESBLs産生菌として最終報告している。本研究ではあくまでGB testをESBLs産生菌の迅速スクリーニング検査としてデザインしているため，この検査だけでは確認検査としては用いることができない。ただし，反応試薬にβラクタマーゼ阻害剤（クラブラン酸，スルバクタム，タゾバクタム）が配合された感受性検査用ディスクを1枚追加した後に同様の操作をすることでESBLs産生菌では陰性，カルバペネマーゼ産生菌は陽性となりESBLsの確定が可能であったため，確認試験となり得ることが示唆された。今後，対象株を増やした検討を行い，確認検査としての確立を目指す。

初期投与抗菌薬が不適切であったESBLs産生菌による感染症患者で入院期間の延長や死亡率の増加が懸念されているが^17),18)，スクリーニング検査としてGB testを導入することで，科学的根拠に基づいた早期の抗菌薬変更が可能となり，結果として患者の予後改善に繋がり検査室として臨床に大きく貢献できると考える。さらに，接触感染対策が早期に行えることで感染対策上も役立つと考えられた。

V　 結語

GB testはNDP testと比較して同等の性能を持ち，さらに検査所要時間や操作の簡便性，低コストの面からも優れており導入が容易であると考える。GB testは，ESBLs産生菌による感染症に早期の適正治療や感染対策を可能とし，患者の予後改善や院内感染対策に繋がる方法であると考えられた。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

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