Genetic investigation of bla_CTX-M typing in extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli isolates from Ehime Prefectural Central Hospital

Abstract

愛媛県立中央病院において分離したextended-spectrum β-lactamase（ESBL）産生Escherichia coli 268株を対象として，薬剤感受性検査成績の調査を行った。I期（2003–05年），II期（2009–10年），III期（2014–16年）にかけてESBL産生E. coliのceftazidime（CAZ），aztreonam（AZT）に対する非感性率の上昇を認めた。DNAシークエンスによりbla_CTX-M-typingを実施したところ，I期，II期ではbla_CTX-M-14が優位であったが，III期ではbla_CTX-M-14に加えてbla_CTX-M-27とbla_CTX-M-15も優位であった。bla_CTX-M-27陽性株とbla_CTX-M-15陽性株は，bla_CTX-M-14に比べてCAZとAZTに対する非感性率が高かった。したがって，ESBL産生E. coliのCAZとAZTに対する非感性率の上昇は，bla_CTX-M-27陽性株とbla_CTX-M-15陽性株の増加によることが明らかになった。さらに，bla_CTX-M-27陽性株とbla_CTX-M-15陽性株においてD240Gのアミノ酸置換変異が検出されたことからCAZに対する非感性率の上昇につながったと考えられた。

I　 序文

基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（extended-spectrum β-lactamase; ESBL）産生菌は，ペニシリンを分解するペニシリナーゼがその基質特異性を拡張することによって第3世代あるいは第4世代セファロスポリン系薬を分解できるようになった酵素を獲得した菌種である¹⁾。ESBLは，クラブラン酸などのβ-ラクタマーゼを阻害する薬剤によりその酵素活性が阻害される特徴を持っている¹⁾。

ESBLをコードする遺伝子は，主として染色体とは独立して自立複製可能なプラスミドと呼ばれる遺伝因子上に存在し，腸管内で水平伝播することが指摘されている²⁾。そのためESBLの耐性情報は施設内や環境内に拡散・伝播しやすいため，感染対策上もESBL産生菌の検出意義は高い³⁾。ESBL産生菌は抗菌薬による選択圧が高く，医療施設内において敗血症などの重症感染症の原因菌であるとともに^4),5)，尿路感染症などの市中感染症の原因菌としても注目されている⁶⁾。

ESBLをコードする遺伝子として，bla_TEM型，bla_SHV型，bla_CTX-M型が知られている。近年，日本を含む世界各国においてbla_CTX-M型ESBL産生菌の分離頻度が増加し，本酵素がESBLの主要酵素になっている⁷⁾。bla_CTX-M型ESBLsには多数の遺伝子型が存在するが，bla_CTX-M-1 group，bla_CTX-M-2 group，bla_CTX-M-9 group，bla_CTX-M-8 group，およびbla_CTX-M-25 groupの5グループに大別される⁸⁾。

本研究では，2003年から2016年の間に臨床材料から分離したESBL産生Escherichia coliの薬剤感受性検査を行った。さらに，分離した年代別によるbla_CTX-M型遺伝子の調査を行うことにより，bla_CTX-M型と薬剤感受性検査成績の関係について調査を行った。

II　 方法

1． 検査材料

愛媛県立中央病院において臨床（患者）材料から分離したESBL産E. coli 268株を供試菌株とした（Table 1）。供試菌株の分離された年によってI期（2003–05年），II期（2009–10年），およびIII期（2014–16年）に分類した。供試菌株の内訳は，I期：44株，II期：55株，およびIII期：169株であった。

Table 1  List of clinical specimens isolated ESBL-producing E. coli

Clinical specimens	No. of isolates
stool	40
urine	118
secretion	18
sputum	25
bronchial lavage fluid	3
vein blood	22
arterial blood	9
bile	7
pus	9
ascites	9
otorrhea	3
nasal cavity	5
Total	268

2． ESBL産生菌の確認法

McFarland 0.5に調整した被検菌液をミューラーヒントンS寒天培地（栄研化学）上に塗抹し，clavulanic acid/amoxicillin（CVA/AMPC）ディスクを培地中央に置き，中央から25 mmの間隔でceftazidime（CAZ），cefotaxime（CTX），cefpodoxime（CPDX），cefepime，ceftriaxone，およびaztreonam（AZT）のKirby-Bauer（KB）ディスク（栄研化学）を配置した。一昼夜培養後，CVA/AMPCディスク側に阻止帯の拡張が認められた株をESBL産生菌と判定した⁹⁾。

3． 薬剤感受性検査

薬剤感受性検査は，ampicillin（ABPC），CTX，CAZ，CPDX，AZT，amikacin（AMK），levofloxacin（LVFX）の7種類の抗菌薬について，KBディスクを用いClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）のドキュメントに準拠して行った¹⁰⁾。臨床的ブレイクポイントの判断基準はCLSIのドキュメントに従い，感性（Susceptible; S），中等度耐性（Intermediate; I），耐性（Resistant; R）のクライテリアとした¹¹⁾。

4． bla_CTX-M型の遺伝子型別

bla_CTX-M groupの検出は，Sibata¹²⁾，Yagi¹³⁾，およびWoodford¹⁴⁾らの報告に従い，bla_CTX-M-1 group，bla_CTX-M-2 group，bla_CTX-M-8 group，bla_CTX-M-9 group，bla_CTX-M-25 groupについてPCRにより確認した。bla_CTX-M型遺伝子シークエンス用プライマーは，瀬戸¹⁵⁾および八柳¹⁶⁾らの報告に従い，検出されたbla_CTX-M-1 group，bla_CTX-M-2 group，bla_CTX-M-9 groupについてPCR型別を行った。PCRプライマーを用いてダイレクトシークエンス法によりその塩基配列を決定した。その後，BLASTn¹⁷⁾を用い遺伝子型を決定した。さらにアミノ酸配列を推定するともに240番目のアミノ酸置換変異の検出を行った。

III　 結果

1． 薬剤感受性検査成績

薬剤感受性検査成績をTable 2に示した。ABPC，CTX，CPDXは供試した268株全て非感性を示したが，AMKは全て感性を示した。CAZに対する非感性率は25.4%（68/268），AZTに対する非感性率は48.1%（129/268），LVFXに対する非感性率は75.0%（201/268）であった。

Table 2  Results of antimicrobial susceptibility of ESBL-producing E. coli isolates between 2003 and 2016

Period; Year (No. of isolates)	Antimicrobial susceptibility test
	ABPC			CTX			CAZ			CPDX			AZT			AMK			LVFX
	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R
I: 2003–05 (n = 44)			44		10	34	44					44	26	11	7	44			17	2	25
II: 2009–10 (n = 55)			55		11	44	50	1	4			55	36	10	9	55			18		37
III: 2014–16 (n = 169)			169		32	137	106	18	45			169	77	40	52	169			32	11	126
Total			268		53	215	200	19	49			268	139	61	68	268			67	13	188

S; Susceptible, I; Intermediate, R; Resistant

ABPC; ampicillin, CTX; cefotaxime, CAZ; ceftazidime, CPDX; cefpodoxime, AZT; aztreoname, AMK; amicacin, LVFX; levofloxacin

供試菌株の分離された年次別のCAZ，AZT，LVFXに対する非感性率をみると，I期では，それぞれ0%（0/44），40.9%（18/44），61.4%（27/44），II期では，9.1%（5/55），34.5%（19/55），67.3%（37/55），III期では，37.3%（63/169），54.4%（92/169），81.1%（137/169）であり，I期，II期，III期にかけて非感性率の上昇が確認された。

2． bla_CTX-M型別

bla_CTX-M groupの型別結果をTable 3に示した。bla_CTX-M-9 groupが最も多く80.6%（216/268），次いで，bla_CTX-M-1 groupが14.9%（40/268），bla_CTX-M-2 groupが4.5%（12/268）であった。bla_CTX-M-1 group 40株のうちbla_CTX-M-15が32株で最も多く検出され，bla_CTX-M-55が6株，bla_CTX-M-3が2株であった。bla_CTX-M-2 groupの12株は，全てbla_CTX-M-2であった。bla_CTX-M-9 groupの216株はbla_CTX-M-14が134株と最も多く，次いでbla_CTX-M-27が77株，bla_CTX-M-9が4株，bla_CTX-M-24が1株であった。

Table 3  Distribution of bla_CTX-M types of ESBL-producing E. coli isolates between 2003 and 2016

Period; Year (No. of isolates)	blaCTX-M-1 group (n = 40)			blaCTX-M-2 group (n = 12)	blaCTX-M-9 group (n = 216)
	blaCTX-M-3	blaCTX-M-15	blaCTX-M-55	blaCTX-M-2	blaCTX-M-9	blaCTX-M-14	blaCTX-M-24	blaCTX-M-27
I: 2003–05 (n = 44)				5	2	36		1
II: 2009–10 (n = 55)	1	3	2	4	1	38	1	5
III: 2014–16 (n = 169)	1	29	4	3	1	60		71
Total	2	32	6	12	4	134	1	77

I期に分離された44株の内訳は，bla_CTX-M-14が36株と最も多く，bla_CTX-M-2が5株，bla_CTX-M-9が2株，bla_CTX-M-27が1株であった。II期に分離された55株の内訳はbla_CTX-M-14が38株と最も多く，bla_CTX-M-27が5株，bla_CTX-M-2が4株，bla_CTX-M-15が3株，bla_CTX-M-55が2株，bla_CTX-M-3，bla_CTX-M-9，bla_CTX-M-24がそれぞれ1株であった。III期に分離された169株の内訳は，bla_CTX-M-27が71株と最も多く，bla_CTX-M-14が60株，bla_CTX-M-15が29株，bla_CTX-M-2が3株，bla_CTX-M-3，bla_CTX-M-9がそれぞれ1株であった。

3． bla_CTX-M型別と薬剤感受性検査成績の関係

bla_CTX-M型別のCAZ，AZTに対する薬剤感受性検査成績をTable 4に示した。CAZ，AZTに対する非感性率は，同順でbla_CTX-M-15陽性株が65.6%（21/32），87.5%（28/32），bla_CTX-M-55陽性株が，66.7%（4/6），66.7%（4/6）と高く，次いでbla_CTX-M-27陽性株が31.2%（24/77），45.5%（35/77）であった。bla_CTX-M-14陽性株は，13.4%（18/134），34.3%（46/134）であった。

Table 4  Antimicrobial susceptibility of CAZ and AZT in bla_CTX-M types

blaCTX-M group	blaCTX-M type (No. of isolates)	Antimicroboal susceptibility test
		CAZ			AZT
		S	I	R	S	I	R
blaCTX-M-1 group	blaCTX-M-3 (n = 2)	1		1			2
	blaCTX-M-15 (n = 32)	11	10	11	4	7	21
	blaCTX-M-55 (n = 6)	2		4		2	4
blaCTX-M-2 group	blaCTX-M-2 (n = 12)	12			1	8	3
blaCTX-M-9 group	blaCTX-M-9 (n = 4)	4			3	1
	blaCTX-M-14 (n = 134)	116	1	17	88	27	19
	blaCTX-M-24 (n = 1)	1			1
	blaCTX-M-27 (n = 77)	53	8	16	42	16	19

S; Susceptible, I; Intermediate, R; Resistant

CAZ; ceftazidime, AZT; aztreoname

4． 240番目のアミノ酸置換変異の検出

bla_CTX-M型別のアミノ酸置換変異の検出成績をTable 5に示した。bla_CTX-M-15，bla_CTX-M-55，およびbla_CTX-M-27において240番目のアミノ酸が，アスパラギン酸からグリシンへの置換変異が検出された。

Table 5  Detection of D240G amino acid mutation in bla_CTX-M-types

blaCTX-M group	blaCTX-M- type	D240G
blaCTX-M-1 group	blaCTX-M-3	−
	blaCTX-M-15	+
	blaCTX-M-55	+
blaCTX-M-2 group	blaCTX-M-2	−
blaCTX-M-9 group	blaCTX-M-9	−
	blaCTX-M-14	−
	blaCTXM-24	−
	blaCTX-M-27	+

D; Aspartic acid, G; Glycine

IV　 考察

近年，ESBL産生菌の分離率が急速に上昇しており，臨床上および感染対策上，極めて大きな問題となっている⁶⁾。八柳ら¹⁶⁾は，2003年以降bla_CTX-M型ESBL産生E. coliの分離株数が顕著に増加傾向にあると報告している。さらに，bla_CTX-M-15型ESBL産生菌が秋田県の医療機関において侵淫し，CAZを加水分解する株が拡張し始めていると報告している¹⁶⁾。

そこで，本研究において，2003年から2016年の間に愛媛県立中央病院において臨床材料から分離したESBL産生E. coliの薬剤感受性検査成績について調査を行った。さらに，分離されたESBL産生E. coliのbla_CTX-M型遺伝子の調査を行うことにより，bla_CTX-M型と薬剤感受性検査成績の関連性について検討を行った。

薬剤感受性検査成績では，ペニシリン系薬のABPC，セファロスポリン系薬のCTXおよびCPDXに対しては，全ての株が非感性を示すことが確認されたが，セファロスポリン系薬の中でもオキシイミノ基としてカルボキシプロポイミノ基を有するCAZおよびAZTに対する非感性率は低くかった。しかし，I期，II期，III期にかけて年次別に比較すると，CAZおよびAZTの非感性率の上昇が確認された。さらに，I期，II期，III期にかけてLVFXに対する非感性率の上昇が確認された。近年，ESBL産生E. coliにおいてフルオロキノロン系薬に対して耐性を示す株が増加している¹⁸⁾。今後は，病院内において多くの抗菌薬に耐性を示すESBL産生E. coliの監視と抗菌薬の適正使用が重要であることが考えられた。

bla_CTX-M groupの遺伝子型においては，bla_CTX-M-9 groupが最も多く検出され，木場ら¹⁹⁾およびChongら²⁰⁾の報告と同様に臨床材料から分離されるESBL産生E. coliにおいて優位なgroupであることが確認された。bla_CTX-M型の遺伝子型については，約170種類ある中で，bla_CTX-M-9 groupのbla_CTX-M-14が最も多く，次いでbla_CTX-M-27，bla_CTX-M-1 groupのbla_CTX-M-15の検出頻度が高かった。しかし，年次別でbla_CTX-M型についてみると，I期からII期，すなわち2003年から2010年頃までは，bla_CTX-M-9 groupのbla_CTX-M-14が最も多く検出されたが，III期の2014年から2016年にはbla_CTX-M-27が増加し，bla_CTX-M-14よりも多く検出された。また，bla_CTX-M-1 groupは，II期の2009年頃よりbla_CTX-M-15，bla_CTX-M-55が検出されるようになった。さらに，III期の2014年から2016年には，bla_CTX-M-15の検出数の増加がみられた。Kurodaら²¹⁾は，2008年から2009年に分離されたESBL産生E. coli 101株の内訳は，bla_CTX-M-14が最も多く，次いでbla_CTX-M-27，bla_CTX-M-15の順で検出されたと報告している。またHaraら²²⁾は，2000年から2010年のなかで，2010年にはbla_CTX-M-27およびbla_CTX-M-15が検出されるようになったと報告しており，検出されるESBL産生E. coliの遺伝子型の種類が増えると共に遺伝子型が変化していることが確認された。Johnsonら¹⁸⁾によると，bla_CTX-M-1 groupのbla_CTX-M-15が世界各国において優位に分離されるようになってきたと報告している。今回，2010年以降にbla_CTX-M-15の検出頻度が高くなったことの関連性が示唆された。

bla_CTX-M型における各薬剤に対する薬剤感受性検査成績では，分離株数の多かったESBL産生E. coli株では，bla_CTX-M-14と比較してbla_CTX-M-27およびbla_CTX-M-15おいてCAZおよびAZTに対する非感性率が高かった。このことからI期からII期，III期にかけてbla_CTX-M-27およびbla_CTX-M-15の検出頻度が高くなったことがCAZおよびAZTに対する非感性率が上昇した原因と考えられた。

bla_CTX-M-27にコードされるCTX-M-27は，D240Gというアミノ酸置換変異により，活性中心の構造変化に関与することによって，CAZの分解効率を上昇させることが報告されている²³⁾。その他に，bla_CTX-M-15においても同様なアミノ酸置換変異は，CAZの分解効率を上昇させることが報告されている²⁴⁾。各bla_CTX-M型によるD240Gのアミノ酸置換変異を検出すると，bla_CTX-M-27およびbla_CTX-M-15の他にbla_CTX-M-55においても陽性であったことから共通のアミノ酸置換変異がCAZに対する分解効率の上昇につながったものと考えられた。また，AZTについてもCAZ同様にオキシイミノ基としてカルボキシプロポイミノ基を有することから，非感性率の上昇につながったと考えられた。

近年，フルオロキノロン系薬に対して耐性を示すESBL産生E. coliに関する報告が数多くみられるようになってきた。bla_CTX-M型E. coliの中でもbla_CTX-M-15型のmultilocus sequence typing（MLST）131などの特定のクローンの流行が指摘されている²⁵⁾。今後は，MLST131も含めてLVFX対する薬剤耐性遺伝子解析も検討していく予定である。

V　 結語

臨床材料から分離したESBL産生E. coliの薬剤感受性検査成績の調査を行った。III期（2014–16年）に分離された株のCAZ，AZT，およびLVFXに対する非感性率が高かった。そこで，薬剤感受性検査成績とESBL産生E. coliのbla_CTX-M-typingを行い比較検討した。結果として，III期ではbla_CTX-M-27が最も多く，次いでbla_CTX-M-14，bla_CTX-M-15の順であった。さらに，D240Gのアミノ酸置換変異を検出するとbla_CTX-M-27の他にbla_CTX-M-15およびbla_CTX-M-55においても陽性であったことからCAZに対する非感性率の上昇につながったと考えられた。AZTについてもCAZ同様にオキシイミノ基としてカルボキシプロポイミノ基を有することから，非感性率の上昇につながったと考えられた。

 

本研究はヒトを扱った研究ではないため，本学の規定により倫理委員会の対象とはらならなかった。

本論文の要旨は第66回日本学検査学会（2017年6月，千葉）において報告した。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

• 1)   Bush  K et al.: “A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure,” Antimicrob Agents Chemother, 1995; 39: 1211–1233.
• 2)   Kliebe  C et al.: “Evolution of plasmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins,” Antmicrob Agents Chemother, 1985; 28: 302–327.
• 3)   川上  小夜子，他：「当院で分離されたEscherichia coliとKlebsiella pneumoniaの産生するExtended-Spectrum β-Lactamase（ESBL）に関する基礎的研究―第2報」，感染症学雑誌，1999; 74: 24–29.
• 4)   Wang  G et al.: “CTX-M β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in Suburban New York, New York USA,” Emerg Infec Dis, 2013; 19: 1803–1810.
• 5)   夏目  聖子，他：「当院における血液培養からのESBL産生腸内細菌の検出状況について」，医学検査，2014; 63: 11–17.
• 6)   Ma  L et al.: “Characterization of cefotaxime-resistant Escherichia coli isolates from a nosocomial outbreak at three geriatric hospitals,” J Infect Chemother, 2002; 8: 155–162.
• 7)   Canton  R et al.: “The CTX-M β-lactamase pandemic,” Curr Opin Microbiol, 2006; 9: 466–475.
• 8)   Lartigue  MF et al.: “In vitro analysis of IS Ecp1B-mediated mobilization of naturally occurring β-lactamase gene bla_CTX-M of Kluyvera ascorbate,” Antimicrob Agents Chemother, 2006; 50: 1282–1286.
• 9)   Ho  PL et al.: “Comparison of novel, inhibitor-potentiated disc-diffusion test with other methods for the detection of extended-spectrum β-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae,” J Antimicrob Chemother, 1998; 42: 49–54.
• 10)  Clinical and Laboratory Standards Institute: “Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; Approved standard-12th edition,” Wayne, PA, 2012; M02–A11.
• 11)  舘田 一博，他：「抗菌薬感受性検査のための標準法―第22版（M100-S22）」，42–59，日本臨床微生物学会（監），CGI，東京，2012.
• 12)   Shibata  N et al.: “PCR classification of CTX-M-type β-lactamase genes identified in clinically isolated Gram-negative bacilli in Japan,” Antimicrob Agents Chemother, 2006; 50: 791–795.
• 13)   Yagi  T et al.: “A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan,” FEMS Microbiology Letters, 2000; 184: 53–56.
• 14)   Woodford  N et al.: “ Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding CTX-M extended-spectrum β-lactamases,” J Antimicrob Chemother, 2006; 57: 154–155.
• 15)   瀬戸  順次，他：「Diffuse outbreak患者から分離されたCTX-M-15型基質拡張型βラクタマーゼ遺伝子保有Shigella sonnei」，感染症誌，2012; 86: 608–609.
• 16)   八柳  潤，他：「秋田県内の医療機関，鶏肉，市中におけるCTX-M型基質拡張型β-ラクタマーゼ（ESBL）遺伝子保有株の分離状況」，秋田県健康環境センター年報，2012; 8: 38–43.
• 17)  DNA Data Bank of Japan: Blastn. http://ddbj.nig.ac.jp/blast/blastn?lang=ja（2015年8月23日アクセス）
• 18)   Johnson  JR et al.: “Abrupt emergence of a single dominant multidrug-resistant srain of Echerichia coli,” J Infect Dis, 2013; 207: 919–928.
• 19)   木場  由美子，他：「広島大学病院におけるESBLs産生菌の分離状況」，医学検査，2012; 61: 567–571.
• 20)   Chong  Y et al.: “Clinical and molecular epidemiology of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherihia coli and Klibsiella pneumoniae in a long-term study from Japan,” Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011; 30: 83–87.
• 21)   Kuroda  H et al.: “Molecular characteristics of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli in Japan: Emergence of CTX-M-15 producing E. coli ST131,” Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2012; 74: 201–203.
• 22)   Hara  T et al.: “ Prevalence and molecular characterization of CTX-M extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli from 2000 to 2010 in Japan,” Jpn J Antibio, 2015; 68: 75–84.
• 23)   Bonnet  R et al.: “Effect of D240G substitution in a novel ESBL CTX-M-27,” J Antimicrob Chemother, 2003; 52: 29–35.
• 24)   Chen  Y et al.: “Atomic resolution structures of CTX-M β-lactamases: Extended spectrum activities from increased mobility and decreased stability,” J Mol Biol, 2005; 348: 349–362.
• 25)   Johnson  JR et al.: “Eschrichia coli sequence type ST131 as the major cause of serious multidrug-resistant E. coli infection in the United States,” Clin Infect Dis, 2010; 51: 286–294.