Evaluation of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae screening using CHROMagar mSuper CARBA

Abstract

カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae; CPE）スクリーニング寒天培地であるクロモアガーmSuper CARBA生培地（関東化学）を用いて発育支持能の検討を行った。当施設保存株のうちPCR法により耐性機序が判明している腸内細菌科細菌各種薬剤耐性50株を対象とした。カルバペネマーゼ産生遺伝子の内訳は，IMP型16株，GES型2株，NDM型3株，KPC型2株，SMB型1株，VIM型2株，OXA型2株と，その他耐性菌としてAmpC産生8株，ESBL単独産生9株，その他5株を使用した。発育支持能試験は，Miles & Misra法に準拠して行い，35℃で24時間培養後に発育したコロニー数を確認した。CPE検出感度は100%，特異度86.4%と良好であり，CPE28株中25株が1.0 × 10² CFU/mLまで発育を認めた。一方，IMP型3株においては1.0 × 10⁵ CFU/mLで発育を認めず，いずれもカルバペネム系抗菌薬のMIC値が低値であった。感度，特異度ともに良好であり，CPEスクリーニング検査の一つとして有用であることが示唆された。一方で，発育はカルバペネム系抗菌薬のMIC値と相関するため，培地の特性を把握したうえで，適切に使用することが重要であると考えられた。

近年，カルバペネム系薬をはじめとする複数の抗菌薬に耐性を獲得したカルバペネマーゼ耐性腸内細菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; CRE）が世界的に問題となっており，これらによる感染症は，有効性が期待できる抗菌薬がほとんどなく予後も極めて深刻なことが報告されている¹⁾。

本邦において，CREによる感染症は年間約1,500例を超えており，2014年には5類感染症に指定された²⁾。特に，カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae; CPE）を原因菌とする感染症においては，β-ラクタム系薬以外の抗菌薬にも耐性を示す機序を併せもち，治療に難渋する場合が多いことから，最も重要な耐性菌として位置付けられている³⁾。

日本におけるCPEの遺伝子型は欧米の型とは異なり，IMP型が多く，中でも，カルバペネム系薬の薬剤感受性結果が必ずしも耐性を示さない“ステルス型”とよばれる株が存在する^3),4)。一方で，カルバペネマーゼ非産生株であっても，基質拡張型βラクタマーゼ（extended-spectrum beta-lactamase; ESBL）産生やAmpC型βラクタマーゼ産生に外膜蛋白変異が加わることで，カルバペネム系薬に耐性化することがあるため，これらの株を早期に区別することが重要である。

薬剤耐性菌検出には，スクリーニング培地が使用されることが多い。スクリーニング培地を用いたCPEの検出は，日常検査において非常に簡便で有用であるが，その検出感度は，各培地に含まれる薬剤によって異なる。米国をはじめとする海外でのCPEスクリーニング培地の性能を評価した報告では，遺伝子型によって感度に差があり，偽陰性となる場合も報告されている⁵⁾。一方，日本におけるCPE検出率は欧米や東南アジアと比較して低く，国内でのCPEスクリーニング培地の性能評価に関する文献は未だ報告されていない。

したがって，今後国内でも増加が予想されるCPEのスクリーニング培地の評価は，抗菌薬適正使用や院内感染対策を行う上で重要である。今回，CPEを効率的に検出する選択培地として開発された「クロモアガーmSuper CARBA生培地」の性能評価を目的として，基礎的検討を行ったので報告する。

I　 対象・方法

1． 供試菌株

供試菌株は，当施設にて保存（カシトン培地および−80℃スキムミルク）されている，標準菌株を含む腸内細菌科細菌各種薬剤耐性50株を使用した。標準菌株はKlebsiella pneumoniae ATCC^® BAA-1705^TM由来株，Klebsiella pneumoniae NCTC 13439由来株，Klebsiella pneumoniae NCTC 13442由来株，Enterobacter cloacae ATCC^® BAA-2468^TM由来株，Klebsiella pneumoniae ATCC^® BAA-2146^TM由来株，Klebsiella pneumoniae NCTC 13443由来株を使用した。耐性機序の確認は，既報のディスク拡散法を用いた各種確認法⁶⁾およびPCR法^7)～10)により決定した。

耐性菌株の内訳は，標準菌株を含むCPE28株（Ambler Class A：GES型2株，KPC型2株，Ambler Class B：IMP型16株，NDM型3株，SMB型1株，VIM型2株，Ambler Class D：OXA-48型2株），non-CPE22株（ESBL単独産生菌9株，AmpC産生菌8株，その他外膜蛋白変異5株）とした。

2． 供試培地

検討対象培地は，クロモアガーmSuper CARBA生培地（以下mSuper CARBA，関東化学）を用いた。mSuper CARBAは，CPEの中でもEscherichia coliは藤色，その他の腸内細菌はメタリック青のコロニーで判別可能である（Figure 1）。比較対照培地として，chromID CARBA 寒天培地（以下chromID CARBA，シスメックス・ビオメリュー），バイタルメディアESBL/MBLスクリーニング寒天培地（以下ESBL/MBL，極東製薬工業）を用いた（Figure 2）。ESBL/MBLは，分画Iにcefpodoxime（CPDX），分画IIにceftazidime（CAZ）の抗菌薬が含有されており，両方の分画で発育を認めた菌株においては，ESBLs 産生菌，メタロβラクタマーゼ産生菌およびAmpC 産生菌が推定される¹¹⁾。

Figure 1 

クロモアガーmSuper CARBA培地

左：NDM型Klebsiella pneumoniae，右：IMP-6型+ESBL産生Escherichia coli

Figure 2 

培地比較検討

a：mSuper CARBA，b：ESBL/MBL，c：chromID CARBA，左：OXA-48型Klebsiella pneumoniae，右：OXA-48型Escherichia coli

CAZ：ceftazidime，CPDX：cefpodoxime

3． 発育支持能試験

保存株を用いた発育支持能試験は，ミスラ法（Miles & Misra法）に準拠し行った¹²⁾。各菌株を滅菌生理食塩水でMcFarland 0.5に調整後，この調整菌液を用いて10倍希釈系列を作製し，各希釈菌液とした。菌液希釈10⁻³，10⁻⁴，10⁻⁵，10⁻⁶の各希釈菌液を10 μLずつ各検討培地表面に滴下し，35℃，24時間培養後，各選択培地のコロニー数を計測し，比較した。3培地間の比較検討では，10⁻³から10⁻⁶までの希釈濃度における発育を確認した。薬剤感受性試験にはドライプレート‘栄研’DP31（栄研化学）を使用し，imipenem及びmeropenemのMIC値を測定した。方法は添付文書に従い実施した。判定はCLSI M100-S27⁶⁾に準拠して行った。

II　 結果

1． 発育支持能試験

CPE28株のうち25株は，mSuper CARBA培地で原液の10⁻⁶倍まで発育を認めた。3株は10⁻³倍で発育が認められなかったが，希釈倍率を下げた10⁻²倍ではいずれも発育を認めた。3株はいずれもIMP型であった（Table 1）。検出濃度の平均値はそれぞれAmbler Class A 5.5 × 10⁰ CFU/mL，Class B 1.37 × 10⁵ CFU/mL（> 1.0 × 10⁶ CFU/mLの株は，1.0 × 10⁶ CFU/mLとして計算した。），Class D 1.38 × 10¹ CFU/mLであった（Table 2）。non-CPE 22株のうち，19株（ESBL 9株，AmpC 8株，その他2株）は発育を認めなかった。3株は原液の10⁻⁶倍まで発育を認め，いずれもAmpCと外膜蛋白変異を持つ株（AmpC産生＋外膜蛋白変異2株，AmpC産生＋ESBL産生＋外膜蛋白変異1株）であった（Table 3）。

Table 1  CPEの発育支持能試験

菌株No.	菌名	耐性機序	検出濃度（CFU/mL）	MIC値（μg/mL）		発育コロニー
				imipenem	meropenem	10−3	10−4	10−5	10−6
1​	Citrobacter freundii	IMP-1	5.0 × 100	4	> 8	○	○	○	2
2​	Klebsiella aerogenes	IMP-1	9.1 × 100	< 1	< 1	○	○	11	—
3​	Enterobacter cloacae	IMP-1	2.0 × 100	> 8	> 8	○	○	○	5
4​	Enterobacter cloacae	IMP-1	> 1.0 × 106	2	< 1	—	—	—	—
5​	Enterobacter cloacae	IMP-1	5.0 × 101	2	2	○	○	2	—
6​	Klebsiella oxytoca	IMP-1	2.0 × 100	8	> 8	○	○	○	5
7​	Klebsiella pneumoniae	IMP-1	> 1.0 × 106	2	8	—	—	—	—
8​	Serratia marcescens	IMP-1	3.7 × 100	> 8	> 8	○	○	27	—
9​	Escherichia coli	IMP-6 + ESBL	> 1.0 × 106	< 1	> 8	—	—	—	—
10​	Klebsiella oxytoca	IMP-6 + ESBL	2.5 × 100	< 1	> 8	○	○	○	4
11​	Klebsiella pneumoniae	IMP-6 + ESBL	3.3 × 102	< 1	8	○	3	—	—
12​	Klebsiella pneumoniae	IMP-6 + ESBL	2.0 × 100	4	> 8	○	○	○	5
13​	Klebsiella pneumoniae	IMP-6 + ESBL	3.3 × 100	< 1	> 8	○	○	○	3
14​	Klebsiella pneumoniae	IMP-6 + ESBL	3.3 × 103	< 1	8	3	—	—	—
15​	Klebsiella pneumoniae	IMP-6 + ESBL	1.0 × 101	< 1	> 8	○	○	○	1
16​	Serratia marcescens	IMP-6	3.3 × 100	4	> 8	○	○	○	3
17​	Klebsiella pneumoniae	GES	1.0 × 101	< 1	< 1	○	○	○	1
18​	Klebsiella pneumoniae	GES	2.0 × 100	2	1	○	○	○	5
19​	Klebsiella pneumoniae	KPC	5.0 × 100	> 8	> 8	○	○	○	2
20​	Serratia marcescens	SMB	1.0 × 101	> 8	> 8	○	○	○	1
21​	Enterobacter cloacae	VIM	3.3 × 101	2	< 1	○	○	3	—
22​	Escherichia coli	OXA	2.5 × 101	< 1	< 1	○	○	4	—
23​1)	Klebsiella pneumoniae	KPC	5.0 × 100	> 8	> 8	○	○	○	2
24​2)	Klebsiella pneumoniae	VIM	4.3 × 100	4	1	○	○	23	—
25​3)	Klebsiella pneumoniae	OXA	2.5 × 100	1	< 1	○	○	○	4
26​4)	Enterobacter cloacae	NDM	5.0 × 100	4	8	○	○	○	2
27​5)	Klebsiella pneumoniae	NDM	1.7 × 100	> 8	> 8	○	○	○	6
28​6)	Klebsiella pneumoniae	NDM	5.0 × 100	> 8	> 8	○	○	○	2

CPE：カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae）

○：培地上に≥ 10 CFUの発育を認める

—：培地上に発育を認めず

¹⁾ ATCC^® BAA-1705^TM由来株

²⁾ NCTC 13439由来株

³⁾ NCTC 13442由来株

⁴⁾ ATCC^® BAA-2468^TM由来株

⁵⁾ ATCC^® BAA-2146^TM由来株

⁶⁾ NCTC 13443由来株

Table 2  Ambler Class別検出濃度

	検出濃度（CFU/mL）
	Class A（4）	Class B（22）	Class D（2）
平均値	5.50 × 100	1.37 × 105	1.38 × 101
範囲	（2.0 × 100–1.0 × 101）	（2.0 × 100–> 1.0 × 106）	（2.5 × 100, 2.5 × 101）

Table 3  発育支持能試験で偽陽性を示したnon-CPE 3株

菌名	耐性機序	検出濃度（CFU/mL）	MIC値（μg/mL）		発育コロニー
			imipenem	meropenem	10−3	10−4	10−5	10−6
Klebsiella aerogenes	C-AmpC1)＋外膜	5.0 × 100	4	1	○	○	○	2
Escherichia coli	ESBL+C-AmpC1)＋外膜	1.0 × 101	< 1	4	○	○	○	1
Klebsiella pneumoniae	AmpC2)＋外膜	2.0 × 100	8	> 8	○	○	○	5

○：培地上に≥ 10 CFUの発育を認める

¹⁾C-AmpC：chromosomal AmpC

²⁾DHA型AmpC

2． 培地比較検討

当施設保存株28件（CPE 18株，non-CPE 10株）を用いて3培地の比較検討を行った。各培地の感度はmSuper CARBA，chromID CARBA，ESBL/MBLの順に100%（18/18），77.8%（14/18），61.1%（11/18）であった。chromID CARBAではOXA-48型2株，IMP型2株で偽陰性を示し，ESBL/MBLではKPC型1株，GES型2株，IMP型2株，OXA-48型1株，VIM型1株で偽陰性を認めた。特異度はmSuper CARBA，chromID CARBA，ESBL/MBLの順に100%（0/10），90%（1/10），90%（1/10）であった。偽陽性を示した株は，chromID CARBAではESBL産生株，ESBL/MBLではAmpC産生株であった（Table 4）。

Table 4  培地比較検討

		CPE選択培地
		mSuper CARBA	chromID CARBA	ESBL/MBL
CPE	感度	100%（18/18）	77.8%（14/18）	61.1%（11/18）
	偽陰性株（n）		OXA-48（2） IMP（2）	KPC（1） GES（2） IMP（2） OXA-48（1） VIM（1）
non-CPE	特異度	100%（0/10）	90%（1/10）	90%（1/10）
	偽陽性株（n）		ESBL（1）	AmpC（1）

CPE：カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae）

III　 考察

当施設保存株50株を用いて行ったmSuper CARBAの性能評価は，感度100%，特異度86.4%であり，CPEスクリーニング培地としての性能は十分な結果であった。国内では，“ステルス型”と呼ばれるIMP型が多く検出されているが^4),13)～15)，本型はカルバペネム系薬の分解能が低く，必ずしも薬剤感受性試験結果で耐性を示さない場合がある。本検討で用いたIMP型16株のうち，13株は低濃度の菌液でも検出可能であったが，IMP-1型2株，IMP-6型1株については10⁵ CFU/mL濃度での発育を認めなかった。これらに対して，希釈倍率を下げて再検討したところ，10⁶ CFU/mL濃度ではすべて発育を認めた。菌種はE. coli，E. cloacae，K. pneumoniaeで，いずれの菌種もイミペネムのMIC値が< 1または2の低値を示すものであった。カルバペネム系薬のMIC値が低値である株は，上記3株以外にも存在したが，すべてにおいて10⁴ CFU/mL以下で良好な発育が認められていたことから，10⁵ CFU/mL濃度での発育を認めなかった3株については，酵素産生量が他の株よりも低い可能性が示唆された。

一方で，偽陽性を示した株は3株存在し，いずれもAmpC産生と外膜変異を併せもった株であり，これらはすべてカルバペネム系薬のMIC値が高いもの（> 4 μg/mL）であった。Nordmannら¹⁶⁾は，non-CPEのうちCPEスクリーニング培地で発育を認めた株の多くは，エルタペネムに耐性を示す株や外膜蛋白変異を併せもつ株であったと報告している。ESBLやAmpCの高度産生や外膜蛋白変異を併せもつ株ではカルバペネム系薬が耐性となる株が含まれていることを念頭に置き，偽陽性を示す可能性があることに注意しなければならない。CPEの確認方法は，CarbaNP法やディスク拡散法によるDouble disk法，メロペネム含有薬剤ディスクを利用したmodified Carbapenem Inactivation Method（mCIM）法がある⁶⁾。本培地で発育が認められた場合には，併せて追加の確認試験を行い，薬剤感受性試験結果をふまえ判断することが必要である。

mSuper CARBA，chromID CARBAおよびESBL/MBLの3培地を用いた検討では，Ambler Class A，Class Bのカルバペネマーゼ産生菌についてはmSuper CARBAおよびchromID CARBAで同等の発育支持能を認めたが，ESBL/MBLではGES型，VIM型で検出率が低くなる傾向にあった。OXA-48型2株についてはESBL/MBLで1株，mSuper CARBAでは2株すべての発育を認めた。本検討で用いたOXA-48型は，カルバペネム系薬のMIC値が低値を示しており，（IPM < 1–1 μg/mL, MEPM < 1 μg/mL）このような株においても検出が可能であるのは，mSuper CARBAに添加されている選択剤の効果が考えられた。さらに，各培地で発育を認めた株の比較においてもVIM型およびSMB型ではmSuper CARBAで感度よく検出可能であることが示された。よって，mSuper CARBAは，現在市販されているCRE選択培地の中で最も感度が優れた培地であると考える。

Class別での検出濃度の平均値はそれぞれAmbler Class A 5.5 × 10⁰ CFU/mL，Class B 1.37 × 10⁵ CFU/mL，Class D 1.38 × 10¹ CFU/mLであり，カルバペネマーゼ低産生株が多いと報告されているVIM型やNDM型もすべて検出可能であった。これらの結果は，Class Bを除き，同様の培地を用いて行った既報と同等であった¹⁷⁾。Class Bでは菌株により検出感度にバラつきが認められたため，検出濃度の平均値が他のclassと比較し高い傾向となった。これまでのCPEスクリーニング培地の性能評価において，OXA-48型の検出に苦慮する場合が特に多く報告されているほか，カルバペネム系薬に感受性を示し，ESBL高度産生を併せもつ株でスクリーニング培地での検出率が低くなる傾向あることが課題であった⁵⁾。mSuper CARBAを用いた本検討結果においては，これらの問題点は認められず，OXA-48型およびIMP-6型のような株についても検出が可能であり，既報と同様に高い検出感度を示した^18),19)。しかしながら，通常，臨床検体から直接スクリーニングを行う場合，尿路感染症や下気道感染症など，患者背景や検査材料によって起炎菌となる菌量が異なる。本検討結果から，スクリーニング培地で陰性であっても，一定量の菌量がなければ検出できない可能性があることに注意が必要である。

日本におけるCPE検出率は，未だ低い状況にあるが，今後海外を含めたさらなる流行拡大の可能性があり，海外からの流行地域において治療を行った患者を受け入れる場合には，積極的なスクリーニングを実施することが重要となる。本検討で用いたmSuper CARBA生培地はCPEスクリーニング検査として日常業務での使用に有用であり，抗菌薬適正使用および院内感染対策に貢献できると考えられた。

IV　 結語

本検討で用いたmSuper CARBA生培地は，CPEに対する検出感度・特異度共に良好であり，スクリーニング培地として有用性が高いと考えられた。一方で，発育はカルバペネム系抗菌薬のMIC値と一定の相関を示すため，CPEスクリーニング培地としての特性を把握したうえで，適切に使用することが重要であると考えられた。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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