Measurement accuracy evaluation of urinary Mandel acid by restricted maximum likelihood method

Abstract

現在，尿中マンデル酸は複数の高速液体クロマトグラフィー分析装置（以下，HPLCと略す）で検査を行っており，各HPLCの精度管理データから号機間精度，日間精度，併行精度，室内精度の推定は，欠側値（一部の分析装置稼動の場合）があり，枝分かれ分散分析法の解析は困難である。そこで，不揃いなデータでの枝分かれ実験の複数誤差の同時推定が可能な制限付き最尤法（restricted maximum likelihood; REML）の解析を試みた。REML法では号機間精度，日間精度，併行精度，室内精度の推定ができ，低濃度（0.30 g/L），高濃度（0.96 g/L）のコントロール検体での室内精度はC.V.が2%以下で良好な結果を得た。これらの結果より，複数装置で欠測値のある精度管理法において，REMLが有効な解析手法であった。

Translated Abstract

Currently, urinary Mandel acid is measured using several high-performance liquid chromatography (HPLC) analytical instruments. As for precision management data, it is difficult to estimate precision values such as instrument-to-instrument precision, day-to-day precision, repeat precision, and intermediate precision by nested analysis of variance owing to missing values (operation of a part of analytical instruments). Thus, we tried the restricted maximum likelihood (REML) method, which can be used for the simultaneous estimation of multiple errors from missing values. The REML method can be used to estimate instrument-to-instrument precision, day-to-day precision, repeat precision, and room precision. The intermediate precision values of low control (0.30 g/L）and high control (0.96 g/L) were less than 2.0%. From the above experiments, the REML method was confirmed to be effective for the urinary Mandel acid assay.

I　 緒言

スチレンは，主として呼吸器を通して肺胞から血液へと体内に取り込まれ，大部分は主に肝臓で代謝されて尿中マンデル酸として排泄される。尿中マンデル酸の測定はスチレンに曝露される機会のある労働者の労働衛生管理のため予防的情報を得る生物学的モニタリングとして有用である。

また，エチルベンゼンは主として塗料の溶剤に使用され，作業者は吸入による曝露の可能性がある。エチルベンゼンも肝臓で代謝されて尿中マンデル酸として排出される。

これらの有機溶媒の重視すべき有害性として，ヒトに対する発がん性が挙げられる¹⁾。

当社では尿中マンデル酸の検査を8台の高速液体クロマトグラフィー分析装置（以下，HPLCと略す）を用いて，検査を行っている。この検査は低値と高値コントロールを用いて，X(Bar)-R管理図で個々のHPLCの精度管理を行っている。号機間差の推定に関して，公益財団法人日本適合性認定協会では，全号機稼動時における完備型枝分かれ分散分析法を推奨している。しかし，HPLCが部分稼動している検査日があり，欠測値がある日は完備型枝分かれ分散分析法では評価できないのが現状である。

一方で，日本臨床検査標準協議会や日本適合性認定協会の不確かさ計算プログラムなどで，「不確かさ」や「妥当性の評価」方法として，枝分かれ分散分析法が採用されている。検査室における精度管理のコントロールデータは，欠測値などで，非釣り合い型データや効率の良いスタッガード型実験や誤差要因の解析のために多段の枝分かれ実験になることがある。このようなコントロールデータは，枝分かれ分散分析法での解析は困難である。尿中マンデル酸の検査は，コントロールデータに欠測値がある枝分かれした実験である。このような線形混合モデルにもっとも適した解析法が，制限付き最尤法（restricted maximum likelihood; REML）である²⁾。

そこで，当社における尿中マンデル酸の精度管理データに関して，REMLでの解析を試みた。

II　 試料，分析装置，測定原理及び解析法

1． 試料

自社製コントロール（低値，高値）は社内ボランテイアの尿にマンデル酸（富士フィルム和光純薬社製）を添加して，低値コントロール（0.30 g/L）と高値コントロール（0.96 g/L）を調製した。

2． 分析装置

分析装置はUHPLC Nexera（島津製作所製）を用い，カラムはL-column2 ODS 3.0 × 100 mm. 2 μm（資生堂社製）を使用した。

3． 測定原理

精製水によって10倍希釈した検体を，UHPLCに注入する。カラムで分離した後，UV検出（波長210 nm）して，スタンダードと比較して尿中濃度を算出する。

4． 解析法

1） 完備型枝分かれ分散分析法

完備型枝分かれ分散分析法は，多くの市販の実験計画の本や公益財団法人日本適合性認定協会のホームページにも記載されているので，ここでは概略を記載する。号機間精度，日間精度，併行精度，総合精度（室内精度）を求めるために平方和分解後，分散分析表を作成して各分散の期待値を推定する（Table 1）。

Table 1  分散分析表

要因	平方和	自由度	不偏分散
号機間精度	SA	dfA = l − 1	VA
日間精度	SB	dfB = l(m − 1)	VB
併行精度	SE	dfE = lm(n − 1)	VE
総合精度	ST	dfT = lmn − 1	VT

l：分析装置数；m：日数；n：測定数；df：自由度

分散成分の推定は分散分析表の期待値から下記のように計算する。

  

$${\sigma }_A^2=\frac{1}{mn}\left(V_A-V_B\right){\sigma }_B^2=\frac{1}{n}\left(V_B-V_E\right)$$

$${\sigma }_E^2=V_E{\sigma }_{\mathrm{T}}^2={\sigma }_{\mathrm{A}}^2+{\sigma }_{\mathrm{B}}^2+{\sigma }_E^2$$

この平方和分解による方法では，欠測値があると計算が困難になる。

今回，計算は統計解析ソフトJMP（SAS社製）を用いて，マンデル酸の1ヶ月間，8台の分析装置のコントロールデータ（低値，高値）に関して，全号機稼働日のみでの完備型枝分かれ分散分析法で解析を行った。

2） REML

REMLは，線形混合モデルの分散の推定に使用される。

  

$$y=X\beta +Zu+e$$

yはデータのベクトル，XとZは計画行列，βは固定効果ベクトル，uは変量効果ベクトルとして，uとeは互いに独立で平均0の多変量正規分布に従うとする。データyに関する尤度f(y)と固定効果の尤度g(β)の比を最大化する尤度比から各分散を推定する。

  

$$L=\frac{f\left(y\right)}{g\left(\beta \right)}$$

対数尤度は下記の式になる。

  

$$-2\ln L=-2\times \left(\ln f\left(y\right)-\ln g\left(\beta \right)\right)$$

統計解析ソフトJMPを用いて，マンデル酸の1ヶ月間，8台の分析装置の31日の全コントロールデータ（低値，高値）を使用して，REMLで解析を行った。

III　 結果

2018年3月（31日間）における尿中マンデル酸の分析装置8台の低値と高値コントロールの平均値は，それぞれ0.296 g/L，0.963 g/Lであった。8台すべて稼動した日は9日，運休日は5日であった（Table 2, 3）。

Table 2  低値コントロール（尿中マンデル酸）

日	1号		2号		3号		4号		5号		6号		7号		8号		平均
1	0.29	0.29	0.30	0.30	0.29	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.29					0.295
2	0.29	0.29	0.30	0.30	0.29	0.29	0.30	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30			0.296
3	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.29	0.30	0.31	0.29	0.29	0.30	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.297
4	0.29	0.29			0.29	0.29					0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.30	0.291
6	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30					0.30	0.30	0.30	0.30	0.300
7	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.299
8	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.31			0.300
9	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.293
10	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.296
11	0.29	0.29	0.28	0.29	0.29	0.29			0.30	0.30					0.30	0.30	0.293
13	0.29	0.30			0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.298
14	0.29	0.30			0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.299
15	0.29	0.30	0.28	0.29	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.296
16	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.30	0.291
17	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.31	0.30	0.31	0.298
18	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.29	0.29	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.294
20	0.29	0.29							0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.29	0.290
21	0.29	0.29			0.29	0.30			0.28	0.29	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.29	0.291
23	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.29	0.29	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.295
24	0.30	0.31			0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.31	0.301
25	0.29	0.29	0.30	0.30					0.29	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.30	0.296
27	0.30	0.30	0.30	0.31													0.303
28	0.30	0.30	0.29	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.29	0.29							0.296
29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.31	0.30	0.32	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30			0.302
30	0.29	0.29	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30	0.30							0.298
31	0.30	0.30	0.29	0.30	0.29	0.30	0.30	0.30	0.29	0.29			0.30	0.30			0.297
平均	0.295		0.296		0.295		0.299		0.294		0.296		0.298		0.298		0.296

（単位g/L）

Table 3  高値コントロール（尿中マンデル酸）

日	1号		2号		3号		4号		5号		6号		7号		8号		平均
1	0.94	0.95	0.95	0.96	0.94	0.95	0.95	0.95	0.95	0.96	0.94	0.94					0.948
2	0.96	0.96	0.95	0.96	0.96	0.96	0.96	0.97	0.96	0.96	0.96	0.97	0.97	0.97			0.962
3	0.94	0.97	0.96	0.98	0.95	0.96	0.96	0.99	0.95	0.97	0.97	0.98	0.96	0.99	0.96	0.98	0.967
4	0.96	0.97			0.95	0.96					0.96	0.96	0.95	0.96	0.97	0.97	0.961
6	0.96	0.98	0.96	0.97	0.97	0.97	0.98	0.99					0.97	0.98	0.98	0.99	0.975
7	0.96	0.97	0.95	0.96	0.97	0.98	0.97	0.97	0.96	0.97	0.97	0.97	0.96	0.97	0.97	0.98	0.968
8	0.97	0.98	0.96	0.97	0.96	0.98	0.96	0.98	0.96	0.96	0.96	0.97	0.97	0.98			0.969
9	0.95	0.96	0.93	0.96	0.94	0.95	0.95	0.97	0.93	0.96	0.95	0.96	0.96	0.97	0.95	0.97	0.954
10	0.95	0.96	0.95	0.95	0.95	0.97	0.96	0.97	0.94	0.96	0.96	0.97	0.94	0.97	0.97	0.98	0.959
11	0.97	0.98	0.94	0.96	0.96	0.96			0.98	0.98					0.97	0.99	0.969
13	0.95	0.95			0.95	0.96	0.97	0.97	0.94	0.95	0.96	0.96	0.94	0.95	0.95	0.95	0.954
14	0.96	0.96			0.95	0.96	0.96	0.96	0.96	0.96	0.95	0.95	0.96	0.97	0.94	0.97	0.958
15	0.96	0.97	0.98	0.99	0.95	0.98	0.96	0.97	0.96	0.97	0.95	0.97	0.96	0.97	0.95	0.97	0.966
16	0.97	0.98	0.96	0.97	0.96	0.96	0.95	0.97	0.96	0.97	0.95	0.97	0.96	0.96	0.97	0.99	0.966
17	0.95	0.97	0.96	0.98	0.95	0.96	0.95	0.98	0.95	0.97	0.95	0.98	0.96	0.99	0.96	0.99	0.966
18	0.94	0.98	0.95	0.96	0.94	0.95	0.93	0.95	0.95	0.96	0.95	0.95	0.98	0.99	0.98	0.99	0.959
20	0.95	0.96							0.97	0.97	0.94	0.95	0.95	0.95	0.95	0.96	0.955
21	0.94	0.94			0.94	0.95			0.94	0.95	0.95	0.95	0.95	0.95	0.94	0.95	0.946
23	0.96	0.97	0.94	0.96	0.94	0.95	0.95	0.97	0.94	0.96	0.95	0.96	0.95	0.97	0.95	0.96	0.955
24	0.99	0.99			0.99	0.99	0.99	0.99	0.99	0.99	0.98	0.99	0.99	0.99	0.95	1.03	0.989
25	0.96	0.97	0.97	0.97					0.96	0.97	0.96	0.97	0.96	0.97	0.94	0.96	0.963
27	0.97	0.97	0.98	0.99													0.978
28	0.97	0.98	0.95	0.96	0.96	0.97	0.96	0.96	0.94	0.95							0.960
29	0.96	0.97	0.99	0.99	0.98	0.99	0.99	0.99	0.98	0.99	0.98	0.99	0.97	0.97			0.981
30	0.95	0.95	0.97	0.97	0.96	0.97	0.97	0.97	0.95	0.96							0.962
31	0.97	0.97	0.96	0.96	0.95	0.95	0.96	0.97	0.95	0.95			0.97	0.97			0.961
平均	0.963		0.963		0.96		0.967		0.96		0.961		0.966		0.968		0.963

（単位g/L）

Table 2，3に示すコントロールの測定値は，欠測値（一部のみの装置稼動日）があり，REMLで解析を行う対象となる。

1） 完備型枝分かれ分散分析法

全号機稼働日は9日間で低値コントロールの寄与率は総合精度を100%とした場合，号機間精度が7.1%，日間精度が19.0%，併行精度が73.9%であった（Table 4）。号機間精度のC.V.は0.50%，日間精度のC.V.は0.82%，併行精度のC.V.は1.62%，室内精度のC.V.は1.89%であった。

Table 4  完備型枝分かれ分散分析法（低値コントロール）

変量効果	F（分散比）	V（分散）	s.d.	c.v.（%）	%（寄与率）
号機間精度	0.096	0.0000022	0.00149	0.50	7.1
日間精度	0.258	0.0000059	0.00243	0.82	19.0
併行精度		0.0000229	0.00479	1.62	73.9
合計（室内精度）		0.0000310	0.00557	1.89	100.0

全号機稼働日は9日間で高値コントロールの寄与率は総合精度（室内精度）を100%とした場合，号機間精度が7.1%，日間精度が5.7%，併行精度が87.3%であった（Table 5）。号機間精度のC.V.は0.37%，日間精度のC.V.は0.33%，併行精度のC.V.は1.31%，室内精度は1.40%であった。

Table 5  完備型枝分かれ分散分析法（高値コントロール）

変量効果	F（分散比）	V（分散）	s.d.	c.v.（%）	%（寄与率）
号機間精度	0.081	0.0000129	0.00359	0.37	7.1
日間精度	0.065	0.0000103	0.00321	0.33	5.7
併行精度		0.0001590	0.01261	1.31	87.3
合計（室内精度）		0.0001823	0.01350	1.40	100.0

2） REML

低値コントロールの寄与率は総合精度（室内精度）を100%とした場合，号機間精度が5.0%，日間精度が42.3%，併行精度が52.7%であった（Table 6）。号機間精度のC.V.は0.43%，日間精度のC.V.は1.25%，併行精度のC.V.は1.39%，室内精度のC.V.は1.92%であった。

Table 6  REML（低値コントロール）

変量効果	F（分散比）	V（分散）	s.d.	c.v.（%）	%（寄与率）
号機間精度	0.095	0.0000016	0.00127	0.43	5.0
日間精度	0.804	0.0000136	0.00369	1.25	42.3
併行精度		0.0000170	0.00412	1.39	52.7
合計（室内精度）		0.0000322	0.00568	1.92	100.0

高値コントロールの寄与率は総合精度（室内精度）を100%とした場合，号機間精度が0.9%，日間精度が45.7%，併行精度が53.4%であった（Table 7）。号機間精度のC.V.は0.14%，日間精度のC.V.は1.00%，併行精度のC.V.は1.08%，室内精度のC.V.は1.48%であった。

Table 7  REML（高値コントロール）

変量効果	F（分散比）	V（分散）	s.d.	c.v.（%）	%（寄与率）
号機間精度	0.017	0.0000018	0.00135	0.14	0.9
日間精度	0.857	0.0000934	0.00967	1.00	45.7
併行精度		0.0001091	0.01046	1.08	53.4
合計（室内精度）		0.0002043	0.01429	1.48	100.0

完備型枝分かれ分散分析法とREMLとも低値と高値コントールの室内精度のC.V.は2%以下であった。

IV　 考察

有機溶剤を扱う作業者の健康管理のためには，この有機溶剤健康診断から得られる情報が非常に重要である。労働安全衛生法が規定する有機溶剤中毒予防規則による健康診断項目として測定する場合，厚生労働省通達の「分布区分」に従う。この数値は曝露（体内への吸収量）の多少を判定するための目安であり，正常・異常の鑑別を目的としたものではない。尿中マンデル酸濃度は分布1：0.3 g/L以下，分布2：0.3 g/L超～1.0 g/L以下，分布3：1.0 g/L超に区分けされている。

スチレンに接触する作業者において分布3の場合，8時間労働に換算し時間加重平均濃度50 ppmに相当する曝露を受けていると考えられる。この曝露量では健康影響を生じる可能性があり，健康状態とともに作業場の環境や作業方法が適切か確認し，すぐに必要な対策を取らなければならない¹⁾。従って，低濃度（0.30 g/L），高濃度（0.96 g/L）コントロール領域の室内精度が分布の区分けに影響を及ぼす。

現在，REMLはJMPや統計分析フリーソフト「R」など多くの統計ソフトで使用でき，併行精度，日差精度，総合精度，誤差要因の解析などが可能である。完備型のデータの測定精度の解析では，古典的な分散分析法とREMLは同じ結果になる。このため古典的な分散分析法から問題なくREMLに移行できると考える。REMLでは，スタッガード型，欠測値のある場合などの非釣り合い型のデータでも解析でき，古典的な分散分析法よりも優れている。

尿中マンデル酸の低濃度，高濃度コントロールの室内精度のC.V.は完備型枝分かれ分散分析法とREMLはほぼ同等であった。一方で，完備型枝分かれ分散分析法の号機間精度のC.V.は低値コントロール0.50%と高値コントロール0.37%に対して，REMLは低値コントロール0.43%と高値コントロール0.14%と高かった。

また，完備型枝分かれ分散分析法の日間精度のC.V.は低値コントロール0.82%と高値コントロール0.33%に対して，REMLは低値コントロール1.25%と高値コントロール1.00%と高かった。

この結果の相違は解析に用いたデータ数によるもので，REMLでは全データを使用しているのに対して，完備型枝分かれ分散分析法では欠測値のない日のデータしか使用できないためである。完備型枝分かれ分散分析法は一部のデータのみの解析で，同じデータを用いてREMLで計算すると同じ結果になる。つまり，欠測値のないデータならば完備型枝分かれ分散分析法とREMLは同じ結果が得られる。REMLでは全データが使用でき，データ数が多くなり信頼性の高い結果が得られる。この解析結果より，尿中マンデル酸は分析装置の号機間差は小さく，日間精度のばらつきを管理する重要性を示唆している。

尿中マンデル酸の欠測値のある精度管理データに関して，号機間精度，日間精度，併行精度，日差精度や総合精度などの誤差要因がREMLで解析可能であった。

V　 結語

日常検査に関して，欠側値のあるコントロール測定結果を評価する上でREMLは有効な解析方法であることが実証された。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

• 1)  緒方 正名，他：「（3）尿中代謝産物の測定法」，有機溶剤健康診断のすすめ方，135–141，労働省労働基準局労働衛生課（監），全国労働衛生団体連合会事務局，東京，1990.
• 2)   南  美穂子：「制限付き最尤推定法（REML推定法）」，応用統計学，1996; 25: 73–78.