2019 Volume 68 Issue 3 Pages 476-480
今回我々は，デタミナーCL IL-2R NXにおける，非特異反応の原因解析を行った。さらに，原因物質の抑制剤を添加した改良試薬の，非特異反応の抑制効果と基本性能を検討した。非特異反応の原因と考えられるアルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase; ALP），フィブリンおよびヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibody; HAMA）の抑制剤を添加した試薬を用いて解析したところ，ALPが非特異反応に関与していることが明らかとなった。非特異検体の希釈試験を行ったところ，改良前試薬では希釈前に42,946 U/mLであったが，希釈により低下し8倍希釈で1,904 U/mLになった。一方，改良試薬では原液を含むいずれの希釈倍率でもほぼ同じ値で非特異反応を認めなかった。ALP非特異抑制剤の濃度を，種々の割合で変えた試薬を用いて非特異検体を測定し，非特異反応の抑制効果を検討した。その結果，改良前試薬の10倍の抑制剤濃度からsIL-2R値はほぼ同程度となり，非特異反応が抑制された。改良試薬の同時再現性，正確性と希釈直線性は，良好な結果が得られた。以上の結果より，改良試薬は，改良前試薬と同等の基本性能を有しており，ALPに対する非特異反応が抑制されていることから，日常検査に有用と考えられた。ただし，今回の検討では，1例の非特異検体しか解析できなかった為，異なる検体でのさらなる検討が必要と考えられた。
We analyzed the cause of nonspecific reactions of the reagent “Determiner CL IL-2R NX” for the measurement of the soluble interleukin-2 receptor. Furthermore, the basic performance of this improved reagent and its inhibitory effect on nonspecific reactions were investigated. The improved reagent was added to suppress the causative agent. As a result of the analysis of the cause of nonspecific reactions using the improved reagent that was added to suppress alkaline phosphatase (ALP), fibrin and HAMA, it was revealed that ALP participated in nonspecific reactions. We performed a dilution analysis of a sample for nonspecific reactions. The sIL-2R value of the undiluted sample analyzed using the currently used reagent was 42,946 U/mL, but it decreased and became 1,904 U/mL after 8-fold dilution. On the other hand, the sIL-2R value obtained using the improved reagent was similar to those of the diluted and undiluted samples. We measured the sIL-2R value of nonspecific samples using the improved reagent that changed the concentration of ALP, which was a causative agent of nonspecific reactions, to examine the suppression of such reactions. As a result, the nonspecific reactions were inhibited by tenfold those of a currently used reagent. Satisfactory precision, accuracy, and linearity were obtained with the improved reagent. In summary, our results suggest that the improved reagent “Determiner CL IL-2R NX” showed sufficient performance for routine examinations and its basic performance is equal to that of the currently used reagent. Moreover, the nonspecific reactions with ALP were inhibited. However, it was considered that further examinations using different samples are necessary because we were able to analyze only one nonspecific sample in this work.
血中可溶性インターロイキン2受容体（soluble interleukin-2 receptor; sIL-2R）は，悪性リンパ腫，成人T細胞性白血病／リンパ腫，癌，感染症，自己免疫疾患や血球貪食症候群で高値となるため，診断や経過観察に用いられている1),2)。以前，血中sIL-2R濃度は，酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA）で測定されていたが，現在は化学発光酵素免疫法やラテックス凝集法を原理とする自動分析装置を用いた測定法が普及しつつある3),4)。これらの測定法は，ELISAに比べ迅速，簡便で日常検査に有用である。しかし，以前我々がsIL-2R測定試薬の基本性能を評価した際に，デタミナーCL IL-2R NX（協和メデックス株式会社）において，非特異反応により偽高値を呈する検体が認められた5)。この検体をジチオスレイトールにより処理し，IgMを不活化すると非特異反応が消失したため，IgMが原因と推察されたが，詳細な原因は明らかとなっていない。
そこで今回我々は，上述の偽高値を呈した検体1症例を用いてデタミナーCL IL-2R NXにおける非特異反応の原因解析を行った。さらに，原因物質の抑制剤を添加した改良試薬の，非特異反応の抑制効果と基本性能を検討した。
当院において，sIL-2Rおよび免疫グロブリン（IgG, IgA, IgM）を測定した患者の残存血清を用いた。異常免疫グロブリン検体の内訳は，IgG高値35例，IgA高値14例，IgM高値14例，モノクローナルな増加30例であった（いずれも重複検体を含む）。また，非特異反応の原因解析に用いた症例は，肝硬変と寒冷凝集素症と診断されており，IgM濃度は1,501 mg/dLであった。
2． 方法 1） 測定試薬および機器改良前後のデタミナーCL IL-2R NXを用い，「全自動化学発光免疫測定装置CL-JACK NX（協和メデックス株式会社）で測定した。改良試薬は，改良前試薬にアルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase; ALP）非特異抑制剤が30倍の濃度で含まれている。なお，改良試薬を含む非特異反応の各種抑制剤が添加されている試薬は，協和メデックス株式会社から提供を受けた。
2） 非特異反応の抑制試験非特異反応の抑制剤として，ALP非特異抑制剤，フィブリン非特異抑制剤，ヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibody; HAMA）抑制剤2種類を用いた。各抑制剤を含む試薬を用いて，非特異検体と対照検体（管理血清：血清に抗原を添加して作製され，協和メデックス株式会社において値付け（管理濃度）された試料）を測定した。対照試薬は，抑制剤の代わりに専用希釈液を同量添加した。【各抑制剤を添加した試薬の測定値／対照試薬の測定値×100（%）】の計算式より変化率を算出した。
3） 非特異検体の希釈試験改良前試薬で非特異反応を認めた検体を，専用希釈液で2倍，4倍，8倍および16倍に希釈し，改良前試薬と改良試薬で3重測定後，それぞれ希釈倍率を掛けてsIL-2R値を算出した。
4） 非特異反応抑制効果の検討改良前試薬で非特異反応を認めた検体を，改良前試薬と改良試薬を含むALP抑制剤濃度が異なる5種類の試薬で3重測定した。抑制剤濃度は，改良前試薬の5倍，10倍，15倍，30倍（改良試薬に含まれる抑制剤濃度）および60倍とした。
5） 同時再現性3濃度の管理血清と2濃度の専用コントロール（デタミナーコントロールCL IL-2R用NX：協和メデックス株式会社）を10回連続測定し，平均値，標準偏差（standard deviation; SD）と変動係数（coefficient of variation; CV）を算出した。
6） 正確性同時再現性と同様の試料を10回連続測定し，平均値を算出後，管理濃度を100%としたときの正確性（%）を求めた。
7） 希釈直線性約8,000 U/mLと約66,000 U/mLの高濃度試料を，専用希釈液で10段階希釈後3重測定した。
8） 異常免疫グロブリン検体の測定免疫グロブリンに異常のある患者血清61例を，改良前試薬と改良試薬で測定し，相関係数と回帰式を算出した。
対照検体では，いずれの非特異抑制剤を添加しても測定値に変動はみられなかった（100.1%～105.1%）。一方，非特異検体の変化率は，各抑制剤の添加によりそれぞれ，ALP抑制剤5.3%，フィブリン抑制剤106.6%，HAMA抑制剤（1）122.4%，HAMA抑制剤（2）97.3%となり，ALP非特異抑制剤で著しく低下した（Table 1）。この結果より，ALPが非特異反応に関与していることが明らかとなった為，ALP非特異抑制剤を添加した改良試薬を以後の基本性能評価に用いた。
| Control (%) | Non-specific reaction (%) | |
|---|---|---|
| ALP | 105.1 | 5.3 |
| fibrin | 100.9 | 106.6 |
| HAMA (1) | 103.1 | 122.4 |
| HAMA (2) | 100.1 | 97.3 |
ALP: alkaline phosphatase, HAMA: human anti-mouse antibody, Control: Reference serum.
改良前試薬は原液が42,946 U/mLであり，希釈倍率が上がるとsIL-2R値は低下し，8倍希釈以上で測定値は安定した。一方，改良試薬では原液を含むいずれの希釈倍率でもほぼ同じ値で，非特異反応を認めなかった（Figure 1）。
Closed circle: current reagent, open circle: improved reagent.
改良前試薬は43,636 U/mLと高値であったが，ALP非特異抑制剤の濃度が高くなると測定値は減少し，10倍の濃度からsIL-2R値はほぼ同程度となり，非特異反応が抑制された（Figure 2）。
Closed circle: current reagent, open circle: improved reagent.
改良前試薬と改良試薬のCVは，それぞれ1.7%～3.1%，1.1%～2.6%と良好であった（Table 2）。
| Current reagent (n = 10) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Reference serum | Control | ||||
| Low | Medium | High | Low | High | |
| Mean (U/mL) | 622 | 2,155 | 8,187 | 1,052 | 3,361 |
| SD (U/mL) | 19.5 | 56.4 | 185.9 | 17.6 | 93.6 |
| CV (%) | 3.1 | 2.6 | 2.3 | 1.7 | 2.8 |
| Improved reagent (n = 10) | |||||
| Reference serum | Control | ||||
| Low | Medium | High | Low | High | |
| Mean (U/mL) | 627 | 2,190 | 8,204 | 1,059 | 3,409 |
| SD (U/mL) | 6.9 | 40.0 | 111.4 | 15.3 | 87.8 |
| CV (%) | 1.1 | 1.8 | 1.4 | 1.4 | 2.6 |
改良前試薬は99.5%～107.1%，改良試薬では100.1%～108.8%と，両試薬ともに管理濃度と同等の値を示した（Table 3）。
| Current reagent (n = 10) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Reference serum | Control | ||||
| Low | Medium | High | Low | High | |
| Mean (U/mL) | 622 | 2,155 | 8,187 | 1,052 | 3,361 |
| Target (U/mL) | 596 | 2,012 | 7,707 | 1,058 | 3,285 |
| Ratio (%) | 104.4 | 107.1 | 106.2 | 99.5 | 102.3 |
| Improved reagent (n = 10) | |||||
| Reference serum | Control | ||||
| Low | Medium | High | Low | High | |
| Mean (U/mL) | 627 | 2,190 | 8,204 | 1,059 | 3,409 |
| Target (U/mL) | 596 | 2,012 | 7,707 | 1,058 | 3,285 |
| Ratio (%) | 105.2 | 108.8 | 106.5 | 100.1 | 103.8 |
改良前試薬は66,501 U/mLまで，改良試薬は66,744 U/mLまで良好な直線性が確認された（Figure 3）。
Left: current reagent, right: improved reagent, upper: sIL-2R low value, under: sIL-2R high value.
両試薬の相関係数は，r = 0.9993，回帰式はy = 1.042x − 19.76と良好な相関性を示し，非特異反応を示す乖離例を認めなかった。（Figure 4）。
現在，自動分析装置で測定可能な血中sIL-2R測定試薬は，ステイシアCLEIA IL-2R（株式会社LSIメディエンス），ナノピアIL-2R（積水メディカル株式会社）や本検討で用いたデタミナーCL IL-2R NX等がある。以前我々が，これらの試薬の基本性能評価を行ったところ，ナノピアIL-2Rで104例中2例（偽高値と偽低値），デタミナーCL IL-2R NXで102例中2例（いずれも偽高値）の非特異検体を認めた4),5)。両試薬ともに異常IgMが原因と推察されたが，詳細は明らかとなっていない。sIL-2Rは，日常検査として頻繁に悪性リンパ腫等の診断や経過観察に用いられており，非特異反応により偽高値や偽低値が起こると，診断の精度が下がる可能性がある。
今回我々は，以前の検討で得られた1例の非特異検体を用いて，デタミナーCL IL-2R NXにおける非特異反応の原因解析を行った。その結果，試薬にALP非特異抑制剤を添加すると，偽高値は消失した。本試薬は，酵素標識抗体としてALP標識抗ヒトIL-2Rモノクローナル抗体を使用している。非特異検体ではこのALP標識抗体にIgMが結合し，偽高値を呈したと考えられた。ALP標識抗体に対する非特異反応は，これまでにもいくつか報告されている6),7)。いずれも非特異抑制剤として不活化ALPを添加することにより非特異反応が抑制され，今回の結果と同様の傾向を示した。この結果から，改良前試薬の30倍高濃度のALP非特異抑制剤を添加した改良試薬が開発されたため，非特異反応の抑制効果と基本性能を評価した。その結果，改良前試薬の10倍の抑制剤濃度から非特異反応が消失したことから，改良試薬は十分な非特異抑制効果を有していると考えられた。また，同時再現性と正確性は良好で，希釈直線性も測定上限の50,000 U/mLを超える66,000 U/mLまでみられた。さらに，免疫グロブリンに異常のある患者血清61例を，改良前後の試薬で測定したが，乖離検体は認められなかった。従って，異常免疫グロブリンが必ずしもALP非特異反応を誘発するわけではなく，稀な症例であると予想された。今回の検討では，1例の非特異検体しか解析できなかった為，異なる検体でのさらなる検討が必要と考えられた。
デタミナーCL IL-2R NX改良試薬は，非特異反応が抑制されており，改良前試薬と同等で良好な基本性能を有していた。
本研究は，札幌医科大学附属病院臨床研究審査委員会の承認を得て施行した（整理番号：302-39）。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
