甲状腺腫瘍における遺伝子検査の有用性に関する検討

林 真也; 畔上 公子; 川崎 隆; 佐藤 雄一郎; 本間 慶一; 岩渕 三哉

doi:10.14932/jamt.19-47

Abstract

【はじめに】ATAガイドライン2015，ベセスダシステム第2版では，細胞診判定後の臨床的対応に分子生物学的検索が記載された。甲状腺腫瘍の診断過程において遺伝子検査を行うことは診断精度の向上や術前の診断確定に寄与するものと考える。今回，甲状腺腫瘍における遺伝子検査の有用性について検討したので報告する。【対象および方法】2013～2017年に当院にて甲状腺の手術が施行され，組織学的診断の確定した乳頭癌（通常型）：15例，濾胞癌（好酸性細胞型を除く）：15例，濾胞腺腫（好酸性細胞型を除く）：5例，腺腫様甲状腺腫：5例を対象とした。FFPE切片からDNAおよびRNAを抽出し，遺伝子異常を検索した。【結果】乳頭癌では15例中13例（86.7%）に遺伝子異常（BRAF変異：12例，RET/PTC再構成：1例）を認めた。濾胞癌では15例中10例（66.7%）に遺伝子異常（RAS変異：9例，PAX8/PPARγ再構成：1例）を認めた。濾胞腺腫，腺腫様甲状腺腫では遺伝子異常は検出されなかった。【考察】甲状腺腫瘍において，BRAF変異，RAS変異，RET再構成，PAX8/PPARγ再構成は組織型に特異性の高い遺伝子異常である。甲状腺腫瘍においてこれらの遺伝子検査を行うことは形態診断の困難な症例において有用な情報をもたらし，診断精度の向上に寄与すると考える。

Translated Abstract

Background: In the 2015 American Thyroid Association Management Guidelines and The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology (2nd edition), a molecular biological search was indicated for certain clinical responses after cytological diagnosis. Genetic testing of thyroid tumor patients is considered to improve diagnostic accuracy and confirm the preoperative diagnosis. In this study, we examined the utility of genetic testing for the diagnosis of thyroid tumors. Methods: Thyroid tumors surgically resected from 40 patients and histopathologically diagnosed in our hospital between 2013 and 2017 were examined. The tumors were obtained from 15 patients with papillary carcinoma (conventional type), 15 patients with follicular carcinoma (excluding oxyphilic cell type), five patients with follicular adenoma (excluding oxyphilic cell type), and five patients with adenomatous goiter. By using DNA and total RNA extracted from FFPE sections, we searched for BRAF mutations, RAS mutations, RET rearrangements, and PAX8/PPARg rearrangements. Results: Genetic abnormalities (BRAF mutation V600E: 12 patients; RET/PTC1 rearrangement: 1 patient) were detected in 13 out of 15 papillary carcinoma patients (86.7%). In follicular carcinoma patients, 10 out of 15 revealed genetic abnormalities (NRAS mutation Q61R: 3 patients; Q61K: 2 patients; KRAS mutation Q61R: 2 patients; HRAS mutation Q61R: 2 patients; PAX8/PPARg rearrangement: 1 patient) (66.7%). No genetic abnormality was detected in patients with follicular adenoma and adenomatous goiter. Conclusions: In thyroid tumors, BRAF mutations, RAS mutations, RET rearrangements, and PAX8/PPARg rearrangements are highly specific to the histopathological type. The genetic testing for thyroid tumors will provide useful information for morphologic diagnosis of difficult cases and contribute to the improvement in diagnostic accuracy.

I　はじめに

近年，白血病やリンパ腫，種々の固形癌の診断や治療の選択に遺伝子検査が用いられている。甲状腺腫瘍でも遺伝子変異に関する研究は数多く行われており，組織型と関連が深い遺伝子異常（BRAF変異，RAS変異，RET再構成，PAX8/PPARγ再構成など）や腫瘍のプログレッションに関係する遺伝子異常（TERT変異，p53変異など）が報告されてきた¹⁾。これらの遺伝子異常は甲状腺腫瘍の組織診断の限界ともいえる困難領域（well-differentiated tumor of uncertain malignant potential, well-differentiated carcinoma, not other specified, non-invasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features）に有用な情報をもたらし，腫瘍の良悪性を形態像とは異なる面から推定できる可能性がある。また，2015 American Thyroid Association Management Guidelines²⁾では，細胞診においてAtypia of undetermined significance/Follicular lesion of undetermined significanceと判定された場合，細胞診の再検もしくは分子生物学的検索を行う，Follicular neoplasm/Suspicious for follicular neoplasmの判定では外科的切除の代わりに分子生物学的検索を行う，Suspicious for malignancyでは外科切除の適応に影響を及ぼす可能性があるならば分子生物学的検索を行うことが臨床的対応として推奨されている。また，The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology, Second Edition³⁾においても臨床的対応に分子生物学的検索が導入された。乳頭癌における遺伝子異常の頻度はBRAF変異45～90%，RET再構成5～15%，RAS変異5～10%，濾胞癌における遺伝子異常の頻度はRAS変異30～60%，PAX8/PPARγ再構成30～60%と報告されている⁴⁾。本邦を含む東アジアでは乳頭癌におけるBRAF変異の頻度が60～90%と欧米の報告に比べ高く⁵⁾，遺伝子検査を行うことにより診断精度の向上や術前の診断確定に寄与するものと思われる。今回，甲状腺腫瘍における遺伝子検査の有用性に関して検討を行ったので報告する。

II　対象および方法

1．患者と組織検体

2013～2017年に新潟県立がんセンター新潟病院頭頸部外科にて甲状腺の手術が施行され，組織学的に診断の確定した乳頭癌（通常型）：15例，濾胞癌（好酸性細胞型を除く）：15例，濾胞腺腫（好酸性細胞型を除く）：5例，腺腫様甲状腺腫：5例を対象とした。本研究は新潟県立がんセンター新潟病院倫理審査委員会にて承認されている（研究番号：850，承認日：2018年4月18日）。

2． Deoxyribonucleic acid（DNA）・Ribonucleic acid（RNA）抽出

10%中性緩衝ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded; FFPE）ブロックから，厚さ5 μm程度に3～5枚薄切し，ヘマトキシリン・エオシン（Hematoxylin-Eosin; HE）染色標本を作製した。Manual dissection（顕微鏡にて腫瘍部分を確認し，腫瘍の密な部分のみをメス等で削り取る）を行い，組織切片をマイクロチューブに回収した。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（QIAGEN）を使用してDNAおよびTotal RNAを抽出し，Nanodrop 2000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）にてDNAとRNAの濃度を測定した。

3． BRAF変異・RAS変異の検出

BRAF変異（exon 15）とRAS変異（NRAS exon 2, NRAS exon 3, KRAS exon 2, KRAS exon 3, HRAS exon 2, HRAS exon 3）の検出は，LightCycler^® 480（Roche）を用いてReal-time polymerase chain reaction（Real-time PCR）およびHigh resolution melting analysis（HRM）により行った。

Real-time PCR・HRM反応液（全量20 μL）

・1 × high-resolution melting mater mix（Roche）

・3.5 mM MgCl₂

・0.2 μM each primer（配列はTable 1に示す）

・Template DNA 10～20 ng

Table 1 List of primers used for PCR and sequence analysis

Primer	Primer sequences (5'-3')
BRAF exon 15	Forward: ATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGA
BRAF exon 15	Reverse: ATCCAGACAACTGTTCAAACT
NRAS exon 2	Forward: ACAGGTTCTTGCTGGTGTGA
NRAS exon 2	Reverse: CACTGGGCCTCACCTCTATG
NRAS exon 3	Forward: TGGTGAAACCTGTTTGTTGG
NRAS exon 3	Reverse: CCTTTCAGAGAAAATAATGCTCCT
KRAS exon 2	Forward: AAGGCCTGCTGAAAATGACTG
KRAS exon 2	Reverse: GGTCCTGCACCAGTAATATGCA
KRAS exon 3	Forward: CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA
KRAS exon 3	Reverse: CTCATGTACTGGTCCCTCATTG
HRAS exon 2	Forward: GAGACCCTGTAGGAGGACCC
HRAS exon 2	Reverse: GGGGTCGTATTCGTCCACAA
HRAS exon 3	Forward: CTCCTGCAGGATTCCTACCG
HRAS exon 3	Reverse: TGATGGCAAACACACACAGG
RET/PTC1	Forward: GGAGACCTACAAACTGAAGTGCAA
RET/PTC1	Reverse: CCCTTCTCCTAGAGTTTTTCCAAGA
RET/PTC3	Forward: CCAGTGGTTATCAAGCTCCTTACA
RET/PTC3	Reverse: GGGAATTCCCACTTTGGATCCTC
PAX8/PPARg	Forward (PAX8 exon 7): AACCTCTCGACTCACCAGACCTA
	Forward (PAX8 exon 9): CGGACAGGGCAGCTATGC
	Reverse: GTTGGTGGGCCAGAATGG

Real-time PCRとHRMの反応条件

・Fast start DNA polymeraseの活性化95℃ 10分

・45 cycle

Denature 95℃ 10秒，Annealing 58℃ 30秒，Extension 72℃ 30秒（シグナル計測）

・95℃ 1分，40℃ 1分，65℃ 1秒

・0.02℃／秒の速度で65℃から95℃まで連続的に上昇（1℃当たり25回のシグナル計測）

・Cooling 40℃ 30秒

Real-time PCR中に得られたThreshold Cycle（Ct）が40を超えた検体は，DNAの品質に問題があると考え，解析から除くこととした。得られたデータはLightCycler^® 480 Gene-scanning software（version 1.5）を使用し，normalization，temperature shiftによる補正を加え，difference plotで図を作成した。変異のない検体と比較し，relative signal differenceが5以上の検体を変異（+）と判定した。変異（+）の検体はPCRを行い，DNA sequencingを行った。

PCR反応液（全量20μL）

・1 × Reaction buffer

・0.2 mM dNTP

・1 U Taq polymerase（Promega）

・0.5 μM each primer（real-time PCRと同じ）

・Template DNA 10～20 ng

PCR反応条件

・Preheat 95℃ 10分

・35 cycle

Denature 95℃ 45秒，Annealing 58℃ 45秒，Extension 72℃ 1分

・Last extension 72℃ 7分

PCR産物を10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（200 V 60分）を行い，目的遺伝子が増幅されていることを確認した。PCR産物をNucleoSpin^® Gel and PCR Clean-up（Macherey-Nagel）にて分離回収を行い，Cycle sequencingの鋳型DNAとした。

Cycle sequencing反応液（全量10μL）

・BigDye Terminator Ready reaction mix（Thermo Fisher Scientific）2 μL

・Sequencing buffer 1.3 μL

・Primer 3.2 pmol（BRAF exon 15，KRAS exon 3，HRAS exon 2，HRAS exon 3はForward primerを使用し，NRAS exon 2，NRAS exon 3，KRAS exon 2はReverse primerを使用）

・鋳型DNA 1 μL

Cycle sequencing反応条件

・Preheat 96℃ 1分

・25 cycle

Denature 96℃ 10秒，Annealing 50℃ 5秒，Extension 60℃ 2分

Cycle sequencing後の反応液をBigDye Xterminator^TM Kitにより精製し，Hi-Di formamideを混和した。Applied Biosystems^® 3500 Dx（Thermo Fisher Scientific）にてキャピラリー電気泳動を行い，塩基配列を決定した。

4． RET再構成・PAX8/PPARγ再構成の検出

RET再構成（RET/PTC1, RET/PTC3），PAX8/PPARγ再構成の検出は，Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）により行った。Total RNAからcomplementary DNA（cDNA）の合成は，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）を用いて行っ‍た（Primerはrandom hexamaer primerを使用）。PCRでglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）の増幅を認めた検体のみRET/PTC1，RET/PTC3，PAX8/PPARγのPCRを行った。

PCR反応液（全量20 μL）

・1 × Reaction buffer

・0.2 mM dNTP

・1 U Taq polymerase（Promega）

・0.5 μM each primer（配列はTable 1に示す）

・cDNA 1 μL

PCR反応条件

・Preheat 95℃ 10分

・35 cycle

Denature 95℃ 45秒，Annealing 60℃ 45秒，Extension 72℃ 1分

・Last extension 72℃ 7分

PCR反応液を10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（200 V 60分）を行い，PCR増幅産物の有無を確認した。PCR増幅産物（+）の検体はcDNA sequencingを行った。BRAF変異・RAS変異の検出と同様にPCR増幅産物から分離回収を行い，塩基配列を決定した。

III　結果

1．核酸品質

40例の検体から抽出したDNA濃度は32.4～1,317.4 ng/μL（平均324.68 ng/μL）であった。Real-time PCRでCtが40以上を示した検体は認められず，本検討のHRMにおいて全例で結果が得られた。RNA濃度は1.5～389.2 ng/μL（平均114.66 ng/μL）であった。RT-PCRにおけるGAPDH発現は全例で増幅が確認された。

2．遺伝子解析結果

遺伝子解析の結果をTable 2に示す。

Table 2 The prevalence rate of genetic alterations in thyroid tumors

Genetic alterations	Genetic alteration cases/total cases (%)
Genetic alterations	Papillary carcinoma*¹	Follicular carcinoma*²	Follicular adenoma*²	Adenomatous goiter
BRAF	12/15 (80.0)	0/15 (0.0)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
RAS	0/15 (0.0)	9/15 (60.0)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
NRAS	0/15 (0.0)	5/15 (33.3)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
KRAS	0/15 (0.0)	2/15 (13.3)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
HRAS	0/15 (0.0)	2/15 (13.3)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
RET/PTC	1/15 (6.7)	0/15 (0.0)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
PAX8/PPARg	0/15 (0.0)	1/15 (6.7)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)
Total	13/15 (86.7)	10/15 (66.7)	0/5 (0.0)	0/5 (0.0)

*¹: conventional type only *²: excluding oxyphilic cell type

1）乳頭癌（通常型）

HRMにて15例中12例にBRAF変異を認めた。DNA sequencingにおいて，12例ともにBRAF遺伝子の1799番目の塩基にチミンからアデニンへの点変異があり，BRAF codon 600にバリンからグルタミン酸への置換（Val600Glu, V600E）を認めた（Figure 1）。1例にRET/PTC1のPCRにおいて増幅を認めた。cDNA sequencingで，CCDC6 exon 1とRET exon 12の融合を認めた（Figure 2）。RAS変異は認めず，PAX8/PPARγ再構成は検出されなかった。乳頭癌（通常型）において，15例中13例（86.7%）に遺伝子異常を認めた。

Figure 1 Representative HRM and DNA sequencing result showed BRAF mutation in papillary carcinoma

The sample revealed the same peaks as the mutant type control in HRM (left).

BRAF V600E: T to A transition at nucleotide 1799 (c.1799T>A). The mutant site is indicated by arrow (right).

Figure 2 PCR and cDNA sequencing result of RET/PTC1 rearrangement in papillary carcinoma

10% polyacrylamide gel electrophoresis showed 135 bp PCR product of RET/PTC1 fusion gene (left).

M: Marker, S: Sample, P: Positive control, N: Negative control.

Sequence analysis revealed a fusion site of RET gene and CCDC6 gene. The fusion site is indicated by arrow (right).

2）濾胞癌（好酸性細胞型を除く）

HRMにて15例中9例にRAS変異（NRAS exon3：5例，KRAS exon3：2例，HRAS exon3：2例）を認めた。DNA sequencingにおいて，8例（NRAS exon 3：3例，KRAS exon 3：2例，HRAS exon 3：2例）は182番目の塩基にアデニンからグアニンへの点変異があり，codon 61にグルタミンからアルギニンへの置換（Gln61Arg, Q61R）を認めた。2例（NRAS exon 3：2例）は181番目の塩基にシトシンからアデニンへの点変異があり，codon 61にグルタミンからリジンへの置換（Gln61Lys, Q61K）を認めた（Figure 3）。また，PCRで1例にPAX8/PPARγの増幅を認めた。cDNA sequencingにより，PAX8 exon 7とPPARγ exon 2の融合を認めた（Figure 4）。BRAF変異は認めず，RET再構成は検出されなかった。濾胞癌（好酸性細胞型を除く）において15例中10例（66.7%）に遺伝子異常を認めた。

Figure 3 Representative HRM and DNA sequencing result of RAS mutations in follicular carcinomas

A: NRAS Q61R: A to G transition at nucleotide 182 (c.182A>G). B: NRAS Q61K: C to A transition at nucleotide 181 (c.181C>A). C: KRAS Q61R: A to G transition at nucleotide 182 (c.182A>G). D: HRAS Q61R: A to G transition at nucleotide 182 (c.182A>G). The mutant sites are indicated by arrows.

Figure 4 PCR and cDNA sequencing result of PAX8/PPARg rearrangement in follicular carcinoma

10% polyacrylamide gel electrophoresis showed 78 bp PCR product of PAX/PPARg fusion gene (left).

M: Marker, S: Sample, P: Positive control, N: Negative control.

Sequence analysis revealed a fusion site of PAX8 gene and PPARg gene. The fusion site is indicated by arrow (right).

3）濾胞腺腫（好酸性細胞型を除く）および腺腫様甲状腺腫

BRAF変異，RAS変異は認めず，RET再構成，PAX8/PPARγ再構成も検出されなかった。

IV　考察

乳頭癌では，BRAF変異の頻度には地域差がある。欧米では50%前後の報告が多いが，東アジアではこの頻度は高く，特に本邦や韓国では60～90%とする報告が多い⁶⁾。本検討では15例中12例（80.0%）にBRAF変異を認め，本邦や韓国の報告と同様の結果であった。BRAF変異（−）の1例でRET再構成が検出され，検索した乳頭癌症例の86.7%に遺伝子異常を認めた。濾胞癌，濾胞腺腫や腺腫様甲状腺腫ではBRAF変異，RET再構成が検出されなかった。形態的所見不足で乳頭癌と確定できない症例に遺伝子検査を追加することは，乳頭癌の確定診断の増加につながると考える。乳頭癌症例において細胞診検体を用いた遺伝子検査の有用性は報告されている^7),8)。実際に細胞診で乳頭癌の確定診断が得られなかったLBC標本（TACAS^TM Ruby固定，パパニコロウ（Papanicolaou; PAP）染色）を使用し，本検討と同様の方法を行ったところ，BRAF変異，RET/PTC1再構成が検出された症例があった（データ非提示）。RET再構成は乳頭癌に特異的で，低分化癌や未分化癌ではほとんど検出されないため，腫瘍の悪性度を形態像とは異なる面から推定可能である⁹⁾。

濾胞癌（好酸性細胞型を除く）では，RAS変異の頻度は30～60%と報告されている。本検討では15例中9例（60.0%）にRAS変異を認め，これまでの報告と同様の結果であった。PAX8/PPARγ再構成の頻度の報告は30～60%であるが，本邦を含む東アジアではPAX8/PPARγ再構成の頻度はこれより低いと報告されている¹⁾。本検討でもPAX8/PPARγ再構成が検出された症例は1例（6.7%）であった。検索した濾胞癌の遺伝子異常の頻度は66.7%と乳頭癌に比べると低い結果であったが，乳頭癌，濾胞腺腫，腺腫様甲状腺腫ではRAS変異，PAX8/PPARγ再構成は検出されなかったことから，これらの遺伝子異常が検出された場合，濾胞癌である可能性が高いと言える。しかし，RAS変異は濾胞型乳頭癌や濾胞腺腫に認められ，PAX8/PPARγ再構成は濾胞腺腫に頻度が少ないながらも検出されると報告^4),9)されており，RAS変異，PAX8/PPARγ再構成を濾胞癌のマーカーとするには問題がある。RAS変異を有する濾胞腺腫は濾胞癌の前駆病変や浸潤前の段階で切除された濾胞癌である可能性が高いとする報告¹⁰⁾や悪性のポテンシャルを持っており，濾胞腺腫の診断は慎重に行うべきとの報告¹¹⁾がある。PAX8/PPARγ再構成は濾胞腺腫では稀であるが，濾胞癌では変異陽性率が高くなるため，濾胞腺腫から濾胞癌への進行に関わる遺伝子異常と推測されており，PAX8/PPARγ再構成を有する濾胞腺腫は既にin situの濾胞癌である可能性が高いとの報告¹²⁾がある。これらの報告は，濾胞性腫瘍（好酸性細胞型を除く）においてRAS変異，PAX8/PPARγ再構成が腫瘍の癌化に関連することを示唆している。また，NRAS変異を有する濾胞癌は遠隔転移との相関が高いとの報告¹¹⁾がある。本検討では遺伝子異常が検出された濾胞癌10例のうち7例は広範浸潤型濾胞癌で，3例は血管侵襲を伴う微小浸潤型濾胞癌であった。遺伝子異常が検出されなかった5例は血管侵襲のない微小浸潤型濾胞癌であった。WHO第4版¹³⁾では，濾胞癌をwidely invasive，minimally invasiveの2つのグループから，悪性度（予後）の違いから，widely invasive，encapsulated angioinvasive，minimally invasive（capsular invasion only）の3つのグループに変更している。遺伝子異常が検出された10例は悪性度の高いグループ（widely invasive，encapsulated angioinvasive）に属しており，RAS変異，PAX8/PPARγ再構成と腫瘍の悪性度が関連していると考える。濾胞癌の診断確定については，RAS変異，PAX8/PPARγ再構成が検出された場合，濾胞形成を示す腫瘍性病変（多くは悪性腫瘍）と過形成性病変の区別が可能になる。また，PAX8/PPARγ再構成を有する濾胞癌は，未分化転化を起こさないとの報告¹⁴⁾があり，腫瘍の悪性度を形態像とは異なる面から推定でき，治療方針の決定に影響を及ぼす可能性がある。

Nikiforovら⁷⁾は，甲状腺穿刺吸引細胞診において遺伝子検査を組み合わせることにより診断精度が改善されると報告している。Bellevicineら⁸⁾は，遺伝子検査が甲状腺穿刺吸引細胞診にて意義不明と判定された検体において，悪性のリスク（悪性が含まれる割合）による層別化を改善できるとしている。乳頭癌と良性病変の鑑別，濾胞性腫瘍と過形成性病変との鑑別が難しい症例において，遺伝子検査を追加することにより良悪性の鑑別が可能な症例が増加し，診断精度を高めることができる。また，核所見や浸潤所見の有無の判断が病理医間のobserver variationの原因ともなっている甲状腺腫瘍において，遺伝子検査は組織型や悪性度の判定に有用な情報をもたらすことが期待される。

V　結語

甲状腺腫瘍において，BRAF変異，RAS変異，RET再構成，PAX8/PPARγ再構成は組織型に特異性の高い遺伝子異常である。甲状腺腫瘍においてこれらの遺伝子検査を行うことは形態診断の困難な症例において有用な情報をもたらし，診断精度の向上に寄与すると考える。

本遺伝子検査は「文部科学省科学研究費助成事業コホート・生体試料支援プラットフォーム」の助成を受けたものである。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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