2020 Volume 69 Issue 2 Pages 160-167
抗リン脂質抗体症候群（anti-phospholipid syndrome; APS）は，血液中に多種多様な抗リン脂質抗体が出現し，その組み合わせにより動・静脈血栓症や習慣性流産が生じる自己免疫性血栓塞栓性疾患である。APSの臨床病態を適切に鑑別診断するためには，複数種の抗リン脂質抗体を患者毎に測定する必要があるが，現在汎用されている酵素固相化免疫測定法（ELISA）では複数種の抗体を同時に測定することは難しい。我々はこれまでに自動分析装置「ACL AcuStar®」を用いたMultiplex-EIA systemにより抗リン脂質抗体を複数種・同時に測定できる検査システム（aPLs-EIA）を構築し，臨床的有用性を検討してきた。本研究ではaPLs-EIAにより，血栓症リスクが高い抗リン脂質抗体を測定することで，APSの合併症パターンや発症を予測できる検査診断法の確立を試みた。その結果，動脈血栓症の発症にはaDomain1-IgGが，静脈血栓症の発症には抗β2-グリコプロテインI抗体IgGクラス（aβ2GPI-IgG）が最も強く関連しており，患者血液中に出現する抗体の種類により発症する合併症に違いが認められる可能性が示唆された。今後は単一の抗体測定で診断するのではなく，現在のAPS分類基準案に採択されていない抗体を含めて，効率よく見逃しの少ない検査診断法の確立が重要と考える。
Anti-phospholipid syndrome (APS) is an autoimmune thrombosis that appears in association with various anti-phospholipid antibodies (aPLs) in a patient’s blood. The presence of aPLs is associated with clinical events, such as arterial and/or venous thrombosis and recurrent fetal loss. Therefore, it is important to simultaneously measure many aPLs of every patient and identify the types of aPL to determine the condition of APS patients appropriately. In the diagnosis of APS, the presence of aPLs is proved by direct detection using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, while ELISA can determine the quantity of aPLs, it is difficult to measure many samples simultaneously. We have established an analytical system that enables the simultaneous measurement of aPLs, namely, the enzyme immunoassay system (aPLs-EIA) using “ACL AcuStar®”, and examined the clinical usefulness of measuring the aPL concentration with this system. In this study, we established a diagnostic method that can predict thrombotic complications by measuring aPLs in patients with high thrombosis risk. Multivariate logistic regression analysis revealed that the presence of aDomain1-IgG was most closely associated with arterial thromboembolic complications. In contrast, the presence of aβ2GPI-IgG was most closely related to venous thromboembolic complications. Moreover, ROC analysis revealed that the accuracy of predicting thrombotic complications based on the results of the multiplex EIA system was higher than that based on the results of aCL/β2GPI-ELISA. Therefore, in the differential diagnosis of APS, it is essential to detect various aPL subclasses simultaneously, which can be done using this new automated EIA system.
抗リン脂質抗体症候群（anti-phospholipid syndrome; APS）は，血液中にリン脂質に関連する自己抗体である抗リン脂質抗体群（anti-phospholipid antibodies; aPLs）が出現することにより，重篤かつ多彩な血栓性合併症（脳梗塞・心筋梗塞・深部静脈血栓症・肺塞栓症・閉塞性動脈硬化症・習慣性流産）を繰り返し発症する自己免疫性血栓塞栓性疾患である1)～3)。APSの診断は，臨床所見と検査所見の双方で成され，臨床所見としては画像検査や病理所見で診断された動脈および静脈の血栓塞栓症，あるいは分類基準に従って診断された流死産等妊娠合併症のうち1つ以上が確認されることとしている。一方，臨床所見の確定に加えて，抗リン脂質抗体症候群分類基準案（“Sapporo Criteria” Sydney改訂版）4)に記載されている「検査所見」としては，①国際血栓止血学会のガイドラインに沿った測定法で，ループスアンチコアグラント（lupus anticoagulant; LA）が陽性，②標準化された酵素固相化免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA）でIgGまたはIgMクラスの抗カルジオリピン抗体（anti-cardiolipin antibodies; aCL）が中等度以上の力価（> 40単位，または > 健常人の99%ile），③標準化されたELISAでIgGまたはIgMクラスの抗β2-グリコプロテインI抗体（anti-β2-glycoprotein I antibodies; aβ2GPI）が陽性（> 健常人の99%ile）のいずれかを12週の間隔をあけて2度以上確認することが定められている。しかし，LA検査は，スクリーニング試験，クロスミキシング試験，確認試験など多段階の測定系により判定する必要があり，一般の検査室でルーチン検査に組み込むのは至難の業である。さらに，2009年にLA診断改訂ガイドライン5)が新たに発表されたが，測定方法の選択や血漿検体の処理方法（血小板の除去・自家製正常プール血漿の作製）など問題点が多く標準化には程遠い。一方，その測定法に関しても，本邦で保険収載されているELISAキットは，「MESACUPカルジオリピンテスト（Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan）と「抗CL・β2GPIキット（YAMASA, Tokyo, Japan）」の2種類で，aβ2GPI-ELISAキットは保険収載されていない。さらに，その2種類の測定法は用手法のため熟練を要し，かつ一定数の検体を集積しなければコストが高くつくため，日常検査法として実施するのは困難という現状がある。
抗リン脂質抗体検査で最も重要なことは，抗リン脂質抗体は1種類ではなく，認識するエピトープの違いにより幾つかのタイプが存在しているということである。すなわち，APS患者の血液中には特異性の異なる多種多様な抗リン脂質抗体が混在し，抗体の組み合わせによりAPS特有の多彩な合併症が生じることが示唆されている6)。そこで我々は自動分析装置を用いて複数種の抗リン脂質抗体を同時に測定可能な検査システム（aPLs-EIA）を確立し，臨床的有用性を検討してきた7),8)。本研究では，aPLs-EIAを用いて測定可能な複数種の抗リン脂質抗体を同時に測定し，血栓症リスクを予測するためのスクリーニング検査としての有用性を検討した。
全国の医療施設に従事する医療従事者を対象とし，一次除外基準〔①喫煙習慣（≥ 25本/日），②飲酒習慣（エタノール量 ≥ 75 g/日），③メタボリックシンドローム，④妊娠中あるいは分娩1年以内，⑤慢性疾患のため定期的に服薬中，⑥入院を要する急性疾患および手術から復帰後一週間以内〕をクリアーした2,053名の中から一般的な臨床検査値（血液検査，生化学検査，尿検査，感染症検査，腫瘍マーカー，心電図）に異常の見られなかった健常者として276名（平均年齢37.0歳〔20～61歳〕，男女比＝87:189）を基準範囲設定の対象とした。
米国リウマチ学会（1997年改訂）の診断基準9)を満たした全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus; SLE）患者138症例（平均年齢43.0歳〔8～82歳〕，男女比＝9:129）を対象に各種抗リン脂質抗体の測定を実施した。
本研究は，山口大学大学院医学系研究科保健学専攻医学系研究倫理審査委員会の承認（管理番号：363）を得て実施した。
2． 使用機器及び試薬自動分析装置「ACL AcuStar®（Instrumentation Laboratory, Bedford, MA, USA）」に，各種抗リン脂質抗体測定試薬 QUANTA® Flash（INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, CA, USA）を用いて，APS診断基準のELISAで検出されるaCLおよびaβ2GPIのIgG，IgM，IgAクラスに加え，近年発見された，新たな抗リン脂質抗体であるβ2GPIのDomain110)に特異的な抗体aDomain1-IgGを測定した。ACL AcuStar®は化学発光免疫測定法を測定原理としており，カルジオリピンとβ2GPIをコーティングさせた磁性粒子に患者由来の抗リン脂質抗体を反応させ，そこにイソルミノール標識モノクローナル抗体が結合し発光する。反応した抗体価に応じて発光量が変化し，装置に内蔵されたルミノメーターによって検出する（Figure 1）。
This assay is using chemiluminescence. As an example aPLs in patient serum are reacted with magnetic micro particles coated Bovine Cardiolipin and Human β2GPI, and combined with isoluminol-labeled monoclonal antibody (mAb) anti human IgG or mAb anti human IgM. It detect “flash” depend on antibody concentration using luminometer.
ACL AcuStar®を用いて，健常者276名とSLE患者138症例（動脈血栓症29例，静脈血栓症16例，無血栓症93例）の血清検体より各種抗リン脂質抗体を測定した。276名の抗体価の分布をべき乗変換にて正規化した後，98%ile未満を基準範囲とし，これを参考にSLE患者検体を抗体陽性と抗体陰性とに判別をした。さらに各種抗体についてその相関関係と，血栓性合併症との関係を検討した。aPLs-EIAによる抗体価測定と現在のAPS検査診断に用いられている抗リン脂質抗体測定用ELISAキット「抗CL・β2GPIキット」の測定（aCL/β2GPI-ELISA）に対して血栓症またはLA活性の有無を比較し，臨床的有用性の検討を行った。なお，統計解析にはStatFlex Ver6.0を用いた。
健常者276名の各抗体価を測定し統計解析して求めた基準範囲と，SLE患者138症例に対して基準範囲の上限値をカットオフ値として抗体陽性・陰性判定を行い，各抗体における抗体陽性患者数を示す（Table 1）。IgGクラスおよびIgAクラスの抗体で抗体陽性患者数が37.0%～42.8%と多く，IgMクラスの抗体はほとんどが抗体陰性であった。また，各種抗体について男女別で比較したところ測定値の有意差はなかった。
| aPLs | Cut off | Positive (ratio %) |
|---|---|---|
| aCL-IgG | < 20.1 U/mL | 53 (38.4%) |
| aCL-IgM | < 20.2 CU | 6 (4.4%) |
| aCL-IgA | < 3.7 CU | 59 (42.8%) |
| aβ2GPI-IgG | < 18.5 CU | 56 (40.6%) |
| aβ2GPI-IgM | < 8.9 CU | 18 (13.0%) |
| aβ2GPI-IgA | < 6.0 CU | 51 (37.0%) |
| aDomainI-IgG | < 6.3 CU | 52 (37.7%) |
aPLs-EIAにて測定したSLE患者138症例の測定値より，各2抗体間の相関関係を検討したところ，同一クラスの抗体において相関係数が0.80～0.95を示し，特に強い相関関係が得られた（Figure 2）。
A: aCL-IgG vs aβ2GPI-IgG, B: aCL-IgM vs aβ2GPI-IgM, C: aCL-IgA vs aβ2GPI-IgA, D: aCL-IgG vs aDomain1-IgG, E: aβ2GPI-IgG vs aDomain1-IgG, F: G: aCL-IgG vs aCL-IgA, G: aβ2GPI-IgG vs aβ2GPI-IgA, H: aβ2GPI-IgA vs aDomain1-IgG, I: aCL-IgA vs aDomain1-IgG. A highly significant correlation was obtained with the correlation coefficient (r) of 0.80–0.95 in the same class of antibodies.
各抗体のクラス別に抗体陽性サンプルを分けてみると，aCLでは138症例中69例で抗体陽性を示し，そのうちIgGクラスとIgAクラスのoverlapを認める症例が39例と最も多くみられた。aβ2GPI（138例中65例が陽性）でも同様にIgGとIgAのoverlapを多く認める結果となった。一方，IgGクラスに関して陽性サンプルを抗体別に分けてみると，138症例中63例で抗体陽性を示し，そのうちaCL-IgG，aβ2GPI-IgG，aDomain1-IgGの全ての抗体が陽性となる症例が44例と最も多く存在した（Figure 3）。
A: aCL, B: aβ2GPI, C: IgG class. Overlap of IgG and IgA class was recognized in aCL (positive rate, 39/69 patients) and aβ2GPI (positive rate, 28/65 patients). In the IgG class, all antibodies (aCL, aβ2GPI, aDomain1) were positive (44/63 patients).
血栓症の有無への7種類の抗体の関与を多重ロジスティック解析にて検討した結果，動脈血栓症はaDomain1-IgGがオッズ比8.28と他の抗体と比べても明らかに高く，また静脈血栓症ではaβ2GPI-IgGがオッズ比17.1と最も高かった（Table 2）。
| aPLs | Arterial Thrombosis Odds rario (95%CI) | Venous Thrombosis Odds ratio (95%CI) |
|---|---|---|
| aCL-IgG | 0.65 (0.12–3.43) | 2.23 (0.27–18.4) |
| aCL-IgM | 1.67 (0.22–12.9) | 0.71 (0.07–7.17) |
| aCL-IgA | 0.62 (0.07–5.55) | 3.98 (0.67–23.8) |
| aβ2GPI-IgG | 1.54 (0.20–11.9) | 17.1 (1.03–28.5) |
| aβ2GPI-IgM | 1.18 (0.30–5.00) | 0.68 (0.17–2.67) |
| aβ2GPI-IgA | 1.08 (0.17–6.93) | 4.69 (0.79–20.0) |
| aDomainI-IgG | 8.28 (3.20–21.4) | 0.87 (0.15–5.08) |
動脈および静脈血栓症既往の有無に対して各種抗リン脂質抗体の判別能をROC解析にて検討したところ，動脈血栓症ではaβ2GPI-IgGとaDomain1-IgGの曲線下面積（area under the curve: AUC）が0.83と高く，静脈血栓症ではaβ2GPI-IgGで0.93，aCL-IgGで0.91と明らかに高い結果となった（Figure 4）。
A: Arterial Thrombosis, B: Venous Thrombosis. The ROC analysis was calculated for each aPLs. As for arterial thrombosis, aβ2GPI-IgG and aDomain1-IgG had similar highly AUC. In venous thrombosis, AUC of aβ2GPI-IgG was the highest, followed by aCL-IgG.
SLE患者138症例を対象に血栓症既往の有無に対して，今回検討した抗リン脂質抗体を①IgGクラスのみ（3aPLs-IgG），②IgGクラスおよびIgAクラス（5aPLs），③全ての抗体（7aPLs）で組み合わせて評価した時の臨床的有用性をROC解析にて比較した。3aPLs-IgGではAUCが0.86であったのに対し，5aPLsでは0.88と7aPLsと同等の判別能があることがわかった（Table 3）。そこで我が国で現在汎用されているaCL/β2GPI-ELISA（基準範囲：< 3.5 unit/mL，抗体陽性患者数：47［34.1%］）と今回構築した5aPLs-EIAの臨床的有用性を比較するため，血栓症既往の有無及びLA活性の有無に対しての判別能を算出した。まず血栓症有無について，aCL/β2GPI-ELISAによる抗体価測定ではAUCが0.80であったのに対し，5aPLs-EIAによる抗体価測定では0.88とaCL/β2GPI-ELISAを上回る結果となった。またLA活性についても，AUCを比較するとaCL/β2GPI-ELISAでは0.88，5aPLs-EIAでは0.92と5aPLs-EIAがaCL/β2GPI-ELISAキットを上回った（Figure 5）。
| EIA-system | Thrombosis (AUC) | LA activity (AUC) |
|---|---|---|
| 3aPLs-IgG | 0.86 | 0.91 |
| 5aPLs | 0.88 | 0.92 |
| 7aPLs | 0.88 | 0.93 |
A: Thrombosis, B: LA activity. As for thrombosis and LA activity, it was suggested that 5aPLs-EIA was higher diagnostic usefulness than aCL/ β2GPI-ELISA.
今回，自動分析装置「ACL AcuStar®」を用いた抗リン脂質抗体測定システムを確立し，各種抗リン脂質抗体の基準範囲を設定すると共に，抗リン脂質抗体症候群の基礎疾患として最も代表的なSLE患者138症例（動脈血栓症29例，静脈血栓症16例，無血栓症93例）の血清検体を対象に各種抗リン脂質抗体の出現率と臨床的有用性を検討した。各種抗体とIgGクラスに関して，抗体価の分布をみてみると，aCL・aβ2GPIともにIgGクラスとIgAクラスがともに陽性であるサンプルが多いが，中には各クラス単独で陽性を示す抗体も存在する。IgGクラスのみに焦点を当てると，aCL・aβ2GPI・aDomain1全て陽性となるサンプルが多くを占めていた。以上より，抗リン脂質抗体検出に関してはIgMクラスよりIgGもしくはIgAクラスの抗体検出が重要であると示唆された。また，動脈および静脈血栓症の有無に対して7種類の抗体の関与を多重ロジスティック解析にて検討した結果において，動脈血栓症ではaDomain1-IgG，静脈血栓症ではaβ2GPI-IgGのオッズ比が最も高い結果となった。さらに動脈および静脈血栓症既往の有無に対して各種抗リン脂質抗体の判別能を検討すると，動脈血栓症ではaβ2GPI-IgGとaDomain1-IgGのAUCが高く，静脈血栓症ではaβ2GPI-IgGとaCL-IgGが明らかに高い結果となった。今回の検討では，患者血液中に様々な抗リン脂質抗体が混在しており，なかでもaDomain1-IgGが動脈血栓症の発症に，aβ2GPI-IgGが静脈血栓症の発症に関与を認め，血栓症発症の原因となる抗体に相違があることが示唆された。さらに，複数の抗リン脂質抗体が混在している中で，動脈および静脈血栓症を予測する際に有用な抗体に違いがあることが示された。しかしながら，今回測定したサンプルの中には単独陽性例もしくはクラス陽性例をいくつか認め，aDomain1-IgG単独陽性やIgAクラス陽性例では血栓症の既往を認めるサンプルが存在した。さらにIgAクラス陽性の症例は多く存在し，IgAクラス測定の必要性が示唆される（Table 4）。
| aPLs | sample No. | age | sex | aCL | aβ2GPI | aDomain1 -IgG |
aCL/β2GPI ELISA | Arterial Thrombosis | Venous Thrombosis | Fetal Loss | LA activity | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IgG | IgM | IgA | IgG | IgM | IgA | ||||||||||
| aβ2GPI-IgG | 61 | 26 | F | − | − | − | + | − | − | − | − | − | + | + | − |
| aDomain1-IgG | 32 | 47 | F | − | − | − | − | − | − | + | − | + | − | − | + |
| 65 | 28 | F | − | − | − | − | − | − | + | − | + | − | − | − | |
| aCL-IgM | 128 | 38 | F | − | + | − | − | − | − | − | − | − | − | − | − |
| aCL-IgA | 101 | 58 | F | − | − | + | − | − | − | − | − | − | − | − | − |
| 123 | 38 | F | − | − | + | − | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| aCL-IgA + aβ2GPI-IgA |
47 | 42 | M | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + |
| 66 | 54 | F | − | − | + | − | − | + | − | − | − | − | − | − | |
| 102 | 42 | F | − | − | + | − | − | + | − | − | − | − | − | − | |
| 104 | 55 | F | − | − | + | − | − | + | − | − | − | − | − | − | |
| 118 | 33 | F | − | − | + | − | − | + | − | − | − | − | − | − | |
| 135 | 35 | F | − | − | + | − | − | + | − | − | − | − | − | − | |
| aCL-IgA + aβ2GPI-IgM |
100 | 28 | F | − | − | + | − | + | − | − | − | − | − | − | − |
| aCL-IgA + aβ2GPI-IgM, A |
44 | 29 | F | − | − | + | − | + | + | − | − | + | − | − | + |
aPLs-EIAを構築する際に血栓症判別に対して最も効率的な組み合わせを検討したところIgGクラスだけでなくIgAクラスを含めた5つの抗リン脂質抗体（5aPLs-EIA）を測定することで血栓症リスクのスクリーニングに繋がることが示唆された。また5aPLs-EIAは市販のELISAキットよりも血栓性合併症を判別する能力が高く，aPLs-EIAによりIgGクラスおよびIgAクラスの抗リン脂質抗体を測定することが，現在のAPS診断に活用されている市販の抗リン脂質抗体測定ELISAキットよりも臨床的に有用で，血栓性合併症を判別する能力が高いことが示された。今後のAPS検査学的診断には，自動分析装置を用いたaPLs-EIAにより，患者の血液中に存在する抗リン脂質抗体のタイプの決定と抗体価の定量が極めて重要であると考える。
実際に，APS患者に対する多施設コホート研究でもaβ2GPI-IgAやaDomain1-IgGの存在と血栓性合併症に強い関連があることが示唆されている11)。さらに，IgAクラスに関してはAPSとの関連性は広く認識されているが，関連性を認めない報告も存在するため，未だに抗リン脂質抗体症候群分類基準案に採用されていない。市販のELISAキットを利用した検討ではIgAクラスはキット間で抗体価のバラツキが大きいことが明らかとなり，使用したELISAキットもしくはホームメイドELISAが原因で関連性評価に影響があったことが示唆されている12)。今後の抗リン脂質抗体の検出では，測定者誤差を抑えるためにもELISAから自動分析装置を使用した抗体価測定が必要である。またELISAを用いたSLE患者の抗リン脂質抗体スクリーニングでは，血栓症発症例においてaCL/β2GPIだけでなく抗ホスファチジルセリン／プロトロンビン抗体（anti-phosphatidylserine/prothrombin antibodies; aPS/PT）の存在が認められ，aCL/β2GPIとaPS/PTの両者が陽性である場合，血栓性合併症を引き起こす可能性が高い13)と報告されている。現在までに，aPS/PTの自動分析装置搭載用試薬は開発されていないが，aPS/PTに対する抗体を含めてスクリーニング検査をすることで血栓性合併症発症のリスク評価がより有意なものとなると考えられ，速やかな試薬開発が望まれる。
本研究は，我々が先駆的に提唱してきた「APS患者の血液中には多種多様な抗リン脂質抗体が混在しており，各抗体の持つ血栓形成作用が複雑に絡み合ってAPS特有の多彩な合併症が生じる」という疾患概念に基づき，臨床的有用性の高い抗リン脂質抗体を複数種・同時に測定できる検査システムを確立し，その有用性を実際の患者検体にて検証するものである。したがって，本システムの構築により，抗リン脂質抗体症候群の検査診断が大きく向上し，血栓症リスクの把握により患者の救命に貢献することが期待できる。
現在の臨床検査の現場ではELISAによる抗リン脂質抗体の検出が主である。しかし，ELISAは単一の抗リン脂質抗体のみの測定であり，測定時間も費やす。また測定者によって測定誤差が大きく，その操作法も煩雑であり，技術を要する。今回開発したMultiplex-EIA systemによるaPLs-EIAは，簡便かつ迅速に複数種の抗リン脂質抗体を同時に測定でき，大量検体の一括処理も可能であり，今後の臨床検査の現場での普及が十分に期待できる。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
