secA1遺伝子を用いたnontuberculous mycobacteria（非結核性抗酸菌）の同定

戸田 圭三; 野村 永; 染谷 香代子

doi:10.14932/jamt.19-115

Abstract

分子生物学的手法の普及によりMycobacteriumは5属に再編成され，菌種も188種以上に増加した。そのため，従来の遺伝子検査やフェノタイプ検査では，非結核性抗酸菌の同定が困難になっている。そこで，ハウスキーピング遺伝子の一つであるsecA1遺伝子を用いた，系統樹解析やBLAST解析で同定を試みた。その結果，DDH法や16S rRNA遺伝子では同定困難であったM. abscessus，M. avium，M. fortuitum，M. lentiflavum，M. mageritense，M. marseillense，M. ulceransの同定が可能であった。secA1遺伝子はM. intracellulareなどの鑑別に課題は残るが，GenBankに登録された基準・標準株が増加したことにより，非結核性抗酸菌の同定ツールとしての有用性が増した。

Translated Abstract

With the widespread use of molecular biological techniques, Mycobacterium species were reclassified into five genera, and the number of bacterial species increased to more than 188. Thus, it is difficult to identify nontuberculous mycobacteria by conventional genetic and phenotype tests. Therefore, we attempted to identify Mycobacterium species by phylogenetic tree analysis and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analysis of secA1, which is one of the housekeeping genes. As a result, it was possible to identify Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium mageritense, Mycobacterium marseillense, and Mycobacterium ulcerans, which were difficult to identify by the DDH method or 16S rRNA gene analysis. Although there are still a few problems in the identification of Mycobacterium intracellulare, the increase in the numbers of reference and standard strains registered in GenBank has expanded its usefulness as a tool for identifying nontuberculous mycobacteria.

I　はじめに

2018年，分子生物学的手法の普及に伴って，マイコバクテリウムは，新しく5属（Mycobacterium属，‍Mycobacteroides属，Mycolicibacterium属，Mycolicibacter属，Mycolicibacillus属）に再編成された。そして，菌種も188菌種以上に増加し^1),2)，非結核性抗酸菌で最も分離頻度が高いMycobacterium avium complexも，12菌種以上で構成されている³⁾。臨床検査室では，結核菌群の同定に遺伝子検査やイムノクロマト法などを取り入れ，結果報告が迅速化しているものの，菌種の細分化により非結核性抗酸菌の同定が難しくなり，従来のPCR（polymerase chain reaction）法やDNAハイブリダイゼーション同定キットでは，菌種の増加に対応できていないことが指摘されている^4),5)。この様に複雑化した非結核性抗酸菌の同定法として16S rRNA遺伝子が用いられるが，それでも同定に苦慮する場合，rpoB，gyrB，dnaJ，hsp65，recAなどのハウスキーピング遺伝子を組み合わせて同定する方法が一般的である。

ハウスキーピング遺伝子の一つであるsecA1遺伝子は，コードするタンパクが細菌の細胞質膜に存在し，タンパク質の分泌に重要な働きをするSec分泌経路を構成する一員で，ATPをエネルギーに分泌駆動モーターとして機能することが報告されている⁶⁾。これは生命の本質に関わる機能であるため，遺伝子の保存性が高く，関係の遠い菌種間でも配列の比較が可能である。以前，我々はsecA1遺伝子がGordonia sputiの同定に有用であったことを報告したが⁷⁾，その後，他のグラム陽性桿菌にも使用できる，汎用性が高いPCRプライマーに改良して検討を続けた結果，Actinomyces，Clostridium，Corynebacterium，Eggerthella，Mycobacterium，Nocardia，Rothiaなど，Gordonia以外のグラム陽性桿菌のsecA1遺伝子をPCR法で増幅し，それをダイレクトシーケンスすることにより菌種同定の一助としている。そこで，今回はマイコバクテリウムのsecA1遺伝子系統樹解析とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）解析を行い，非結核性抗酸菌同定への有用性について検討した。

II　材料および方法

1．対象菌株

1）基準･標準株

GenBank（NCBI: National Center for Biotechnology Information）から，マイコバクテリウム基準・標準株のsecA1遺伝子塩基配列（370 bp）を可能な限り抽出し，Table 1に示した109菌種（Mycobacterium属48菌種，Mycobacteroides属5菌種，Mycolicibacterium属47菌種，Mycolicibacillus属1菌種，Mycolicibacter属8菌種）を参照配列として用いた。

Table 1 secA1遺伝子解析に用いた基準・標準株109株

Mycobacterium属（Tuberculosis variant）
菌種名	基準・標準株	Accession
M. africanum	ATCC 25420	NZ_MWXF01000077
M. bovis	Tokyo172	CP014566
M. caprae	Allgaeu	NZ_MWXD01000037
M. microti	ATCC 19422	NZ_MWXC01000004
M. pinnipedii	ATCC BAA-688	NZ_MWXB01000107
M. tuberculosis	ATCC 35801	AP012340
Mycobacterium属（Avium complex）
菌種名	基準・標準株	Accession
M. avium	ATCC 25291	NZ_ACFI01000182
M. chimaera	DSM 44623	NZ_LQOO01000073
M. colombiense	CECT 3035	NZ_AFVW02000004
M. intracellulare	ATCC 13950	NC_016946
M. lepraemurium	Hawaii	NZ_CP021238
M. marseillense	FLAC 0026	CP023147
M. timonense	P-5731	NZ_OLMV01000004
M. vulneris	CCBG	CCBG010000001
M. yongonense	Asan 36527	CP015965
Mycobacterium属（Slow grower mycobacteria）
菌種名	基準・標準株	Accession
M. alsense	BF431DRS	KT168309
M. angelicum	DSM 45057	MVHE01000001
M. asiaticum	DSM 44297	MVHI01000011
M. bohemicum	DSM 44277	CTSD01000003
M. branderi	DSM 44624	MVHM01000001
M. canettii	CIPT 140070010	FO203509
M. celatum	ATCC 51130	AY724707
M. europaeum	PRJEB 8464	CTEC01000002
M. fragae	DSM 45731	LQOW01000014
M. gastri	ATCC 15754	AY724713
M. genavense	ATCC 51234	NZ_JAGZ01000002
M. gordonae	ATCC 14470	AY724714
M. haemophilum	ATCC 29548	CP011883
M. heckeshornense	CCUG 51897	FJ442837
M. interjectum	ATCC 51547T	NZ_LT546236
M. intermedium	DSM 44049	NZ_MVHT01000002
M. kansasii	ATCC12478	CP006835
M. lentiflavum	PRJEB8430	CTEE01000001
M. malmoense	ATCC 29571	AY724718
M. marinum	ATCC 927	NZ_AP018496
M. paraense	IEC 26	LQPM01000013
M. paragordonae	49061	CP025546
M. parascrofulaceum	ATCC BAA-614	FJ442855
M. pseudoshottsii	JCM 15466	NZ_AP018410
M. scrofulaceum	ATCC 19981	AY724723
M. shigaense	JCM 32072T	AP018164
M. shimoidei	ATCC 27962	AY724724
M. shinjukuense	CCUG 53584	NZ_MVIK01000015
M. simiae	ATCC 25275	AY724725
M. szulgai	ATCC 35799	AY724727
M. triplex	ATCC 700071	FJ442838
M. ulcerans	ATCC 19423	AY724733
M. xenopi	ATCC 19250	AY724734
Mycobacteroides属（Abscessus-Chelonae clade）
菌種名	基準株	Accession
M. abscessus	ATCC 19977	NZ_MLCG01000001
M. chelonae	M77	CP041150
M. franklinii	CCUG 64054	NZ_PECB01000003
M. immunogenum	CCUG 47286	CP011530
M. salmoniphilum	DSM 43276	CP011530
Mycolicibacterium属（Fortuitum-Vaaccae clade）
菌種名	基準・標準株	Accession
M. aromaticivorans	JCM 16368	JALN02000001
M. aubagnense	CCUG 50186	FJ442827
M. aurum	NCTC 10437	NZ_CVQQ01000001
M. austroafricanum	CCUG 37667	FJ442828
M. bacteremicum	DSM 45578	NZ_MVHJ01000006
M. boenickei	JCM 15653	AP022579
M. brisbanense	JCM 15654	NZ_BCSX01000051
M. brumae	CCUG 37586	FJ442832
M. canariasense	CCUG 47953	FJ442833
M. chubuense	CCUG 37670	FJ442858
M. conceptionense	CCUG 50187	FJ442835
M. cosmeticum	DSM 44829	NZ_POTP01000001
M. diernhoferi	IP141170001	PDCR01000020
M. fallax	CCUG 37584	FJ442836
M. farcinogenes	DSM 43637	NZ_HG964481
M. flavescens	ATCC 23033	AY724711
M. fortuitum	ATCC 6841	CP014258
M. gilvum	NCTC 10742	UGQM01000001
M. goodii	X7B	CP012150
M. hassiacum	CCUG 37519	FJ442840
M. holsaticum	CCUG 46266	HM363519
M. houstonense	ATCC 49403	NZ_LT546208
M. litorale	JCM 17423	AP022586
M. mageritense	CIP 104973	CCBF010000001
M. monacense	DSM 44395	NZ_MVIA01000003
M. moriokaense	CCUG 37671	FJ442845
M. mucogenicum	ATCC 49650	AY724720
M. neoaurum	HGMS2	NZ_CP031414
M. neworleansense	ATCC 49404T	NZ_CWKH01000001
M. novocastrense	JCM 18114	NZ_BCTA01000093
M. obuense	CCUG 37669	FJ442846
M. parafortuitum	CCUG 20999	NZ_MVID01000006
M. peregrinum	ATCC 14467	AY724722
M. phlei	CCUG 21000	NZ_CP014475
M. phocaicum	CCUG 50185	FJ442848
M. porcinum	CCUG 37674	VNFN01000001
M. rhodesiae	NBB3	CP003169
M. rufum	JS14	JROA01000001
M. rutilum	DSM 45405	NZ_LT629971
M. senegalense	CK2 M4421	LDPU01000001
M. septicum	CCUG 43574	FJ442850
M. setense	DSM 45070	NZ_JTJW01000005
M. smegmatis	ATCC 19420	U66081
M. thermoresistibile	CCUG 28008	FJ442852
M. tusciae	DSM 44338	MVIM01000003
M. vaccae	CCUG 21003	FJ442853
M. wolinskyi	CCUG 47168	FJ442854
Mycolicibacter属（Terrae clade）
菌種名	基準株	臨床分離株数
M. algericus	DSM 45454	NZ_MVHC01000001
M. arupensis	JAL 634	VUJZ01000001
M. heraklionensis	Davo contig 5	LDPO01000005
M. hiberniae	ATCC 49874	LQOZ01000012
M. icosiumassiliensis	8WA6	NZ_LT546166
M. kumamotonensis	DSM 45093	NZ_MVHU01000002
M. nonchromogenicum	ATCC 19530	AY724721
M. terrae	ATCC 15755	AY724728
Mycolicibacillus属（Triviale clade）
菌種名	基準株	臨床分離株数
M. trivialis	ATCC 23292	AY724729

2）臨床分離株

当院で分離･保存された53株について，370 bpのsecA1遺伝子の塩基配列を決定し，参照配列とともに系統樹解析やBLAST解析を行った。さらに，各分離株におけるDDH法（DDHマイコバクテリア極東，極東製薬工業），16S rRNA遺伝子解析，MALDI-TOF MS（MALDIバイオタイパー，ブルカージャパン株式会社），キャピリアTB-Neo（BD社），核酸クロマト法（カネカ核酸クロマト迅速発育抗酸菌同定キット，Kaneka），dnaJとrpoB遺伝子のコンビネーション解析（外部委託）の結果と比較検討した。

尚，患者分離株を遺伝子解析するにあたり，分離株は個人情報を全く含まないため，本センターの倫理委員会の対象にならなかった。

2． secA1遺伝子シーケンス

1） DNA抽出

市販のDNA抽出キット（シカジーニアスDNA抽出試薬STまたはQIAamp DNA Mini Kit）をメーカーの添付書どおりに用いてDNAを抽出し，その2 μLをPCRに用いた。

2）プライマー設計とsecA1遺伝子のPCR

グラム陽性桿菌に広く使用できるプライマーの作製を目標として，既に報告したGordonia用プライマー⁷⁾を改良し，secA1遺伝子の370 bpをシーケンス出来るようにプライマーをデザインした（secA1 GPR forward: 5'-tca cct acg gca cca aca acg a-3'，secA1 GPR reverse: 5'-cgc gga cga tgt agt cct tgt c-3'）。PCR反応液組成は，AmpliTaq Gold master mix（Life Technologies Japan）12.5 μL，GC enhancer（Life Technologies Japan）2.5 μL，プライマーミックス各10 μM，テンプレートDNA 2 μLを加え，滅菌精製水で全量を25 μLに調性した。それを95℃ 10分間のホットスタート後，95℃ 30秒，55℃ 60秒，72℃ 60秒のPCRサイクルを38回繰り返し，最後に72℃ 7分間の伸長反応を行った。

3） PCR増幅産物の精製

QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いてPCR増幅産物をカラム精製し，滅菌精製水30 μLで溶出した。

4）シーケンス反応

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies Japan）と，PCR反応用のsecA1 GPR forwardまたはsecA1 GPR reverseの2種類のプライマーを用いて，2方向からシーケンス反応を行った。その後，2種類の反応液は，X-terminator（Life Technologies Japan）を用いて余分な蛍光色素を除去した。

5）塩基の読取りと解析

Applied Biosystem 3500 Genetic Analyzerを用いて塩基の読取りを行い，GenomeNetのCLUSTALW（http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）を用いたML法（最尤法）による系統樹解析や，NCBI（National Center for Biotechnology Information）およびDDBJ（DNA Data Bank Japan）のBLAST解析を用いて菌種同定を行った。

III　結果

1． secA1遺伝子でMAC（Mycobacterium avium complex）に同定された15株

MAC基準･標準株9菌種と臨床分離株（M1～15）のsecA1遺伝子系統樹では，11株（M1～11）がM. aviumに最も近縁であった（Figure 1）。また，secA1遺伝子BLAST解析においても，M. aviumの相同率（98.4%から99.0%）はM. lepraemurimの相同率（96.2%から97.3%）と差を認め，M. aviumに同定された。更にDDH法やMALDI-TOF MSでもM. aviumであった。一方，16S rRNA遺伝子では，解析した5株（M1, 2, 4, 5, 11）中4株（M1, 2, 4, 11）がM. aviumに同定されたが，残りの1株（M5）はM. avium（99.6%），M. colombiense（99.4%），M. vulneris（99.4%），M. bouchedurhonense（99.4%）の複数菌種と高い相同率を示した。M12株はsecA1遺伝子系統樹解析でM. marseillense（100%）に同定され，MALDI-TOF MSでも同じ結果であった。しかし，16S rRNA遺伝子でM. marseillense（99.3%），M. intracellulare（99.3%），M. timonense（99.2%），M. chimaera（99.2%）の複数菌種が高い相同率を示し，DDH法ではM. intracellulareに同定された。

Figure 1 MAC基準･標準株と臨床分離株（M1～15）のsecA1遺伝子系統樹

ML法によるsecA1遺伝子系統樹解析の結果，M1～11株はM. avium，M12株がM. marseillense，M13と14株はM. intracellulare，M15株がM. yongonenseに近縁であった。

DDH法でM. intracellulareに同定された他の3株（M13～15）を解析した結果，secA1遺伝子系統樹解析においてM13，14株がM. intracellulare，M15株はM. yongonenseと近縁であった。しかし，secA1遺伝子BLAST解析では，M13とM14株はM. intracellulare（99.2%）とM. yongonense（99.2%）の相同率に差を認め無かった。一方，M13とM15の2株をMALDI-TOF MSで同定した結果，両者ともM. chimaera intracellulare groupとグループ分類レベルに止まり，16S rRNA遺伝子では，M15株がM. intracellular（98.5%），M. yongonense（98.5%），M. chimaera（98.5%），M. paraintracellulare（98.5%）の4菌種と相同率が高かった（Table 2）。

Table 2 secA1遺伝子でMACに分類された臨床分離株15株（M1～15）

no.	分類	secA1同定（塩基一致率）	16S rRNA同定（塩基一致率）	DDH同定	MALDI-TOF MS	dnaJ/rpoB
M1	MAC	M. avium（98.4%）	M. avium（99.7%）	ND	ND	ND
M2	MAC	M. avium（99.0%）	M. avium（99.2%）	M. avium	ND	ND
M3	MAC	M. avium（98.6%）	ND	M. avium	M. avium	ND
M4	MAC	M. avium（99.0%）	M. avium（99.7%）	ND	ND	ND
M5	MAC	M. avium（99.0%）	M. avium（99.6%） M. colombiense（99.4%） M. vulneris（99.4%） M. bouchedurhonense（99.4%）	M. avium	M. avium	ND
M6	MAC	M. avium（98.6%）	ND	M. avium	ND	ND
M7	MAC	M. avium（99.0%）	ND	M. avium	ND	ND
M8	MAC	M. avium（98.6%）	ND	M. avium	ND	ND
M9	MAC	M. avium（99.0%）	ND	M. avium	ND	ND
M10	MAC	M. avium（99.0%）	ND	M. avium	ND	ND
M11	MAC	M. avium（99.0%）	M. avium（99.9%）	M. avium	ND	ND
M12	MAC	M. marseillense（100%）	M. marseillense（99.3%） M. intracellulare（99.3%） M. timonense（99.2%） M. chimaera（99.2%）	M. intracellulare	M. marseillense	M. marseillense
M13	MAC	M. intracellulare（99.2%） M. yongonense（99.2%）	ND	M. intracellulare	M. chimaera intracellulare group	ND
M14	MAC	M. intracellulare（99.2%） M. yongonense（99.2%）	ND	M. intracellulare	ND	ND
M15	MAC	M. yongonense（100%） M. intracellulare（99.5%）	M. intracellulare（98.5%） M. yongonense（98.5%） M. chimaera（98.5%） M. paraintracellulare（98.5%）	M. intracellulare	M. chimaera intracellulare group	ND

ND：未実施

2． secA1遺伝子でMTBC（Mycobacterium tuberculosis complex）に分類された9株

キャピリアTB-Neoで結核菌群と同定された7株（M16, 17, 18, 20, 21, 22, 23）についてsecA1遺伝子解析を行った結果，M. tuberculosis ATCC 27294株との相同率が99.7%から100%であった。dnaJ/rpoB遺伝子でM. bovisと同定された2株（M19, 24）も，M. tuberculosis ATCC 27294株との相同率が100%を示し（Table 3），secA1遺伝子解析でM. tuberculosisやM. bovisが非結核性抗酸菌群に誤同定されることは無かった。

Table 3 secA1遺伝子でMTBCに分類された臨床分離株9株（M16～24）

no.	分類	secA1同定	dnaJ/rpoB	キャピリアTB
M16	MTBC	MTBC（100%）	ND	+
M17	MTBC	MTBC（100%）	ND	+
M18	MTBC	MTBC（100%）	ND	+
M19	MTBC	MTBC（100%）	M. tuberculosis variant bovis	ND
M20	MTBC	MTBC（100%）	ND	+
M21	MTBC	MTBC（99.7%）	ND	+
M22	MTBC	MTBC（99.7%）	ND	+
M23	MTBC	MTBC（100%）	ND	+
M24	MTBC	MTBC（100%）	M. tuberculosis variant bovis	ND

ND：未実施

3． secA1遺伝子でSGM（slow grower mycobacteria）に分類された18株

Mycobacterium属の内，前述のMACとMTBCを除外した18株（M25～42）をSGMに分類して検討した。M25株は，secA1遺伝子系統樹分析（Figure 2）でM. interjectumに同定された。しかし，16S rRNA遺伝子またはMALDI-TOF MSでは，M. interjectumとM. paraenseの2菌種が候補に挙がった。M26とM27株は，secA1遺伝子系統樹分析でM. kansasiiに同定し，DDH法の結果と一致した（Table 4）。

Figure 2 SGM基準･標準株と臨床分離株（M25～27）のsecA1遺伝子系統樹

ML法によるsecA1遺伝子系統樹解析の結果，M25株はM. interjectum，M26と27株がM. kansasiiに近縁であった。

Table 4 secA1遺伝子でSGMに分類された臨床分離株18株（M25～42）

no.	分類	secA1同定	16S rRNA同定（塩基一致率）	DDH同定	MALDI-TOF MS	dnaJ/rpoB
M25	SGM	M. interjectum（98.4%）	M. interjectum（99.9%） M. paraense（99.6%）	negative	M. paraense M. interjectum	ND
M26	SGM	M. kansasii（96.7%）	ND	M. kansasii	ND	ND
M27	SGM	M. kansasii（100%）	ND	M. kansasii	ND	ND
M28	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（100%） M. palustre（99.6%） M. simiae（99.3%）	negative	ND	M. lentiflavum
M29	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（100%） M. palustre（99.6%） M. simiae（99.3%）	negative	ND	M. lentiflavum
M30	SGM	M. lentiflavum（100%）	ND	negative	ND	ND
M31	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（100%） M. palustre（99.6%） M. simiae（99.3%）	negative	ND	ND
M32	SGM	M. lentiflavum（100%）	ND	negative	ND	ND
M33	SGM	M. lentiflavum（99.7%）	M. lentiflavum（99.8%） M. simiae（99.4%） M. triplex（99.1%） M. shigaense（99.1%） M. sherrisii（99.1%）	negative	ND	ND
M34	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（99.8%） M. simiae（99.4%） M. triplex（99.1%） M. shigaense（99.1%） M. sherrisii（99.1%）	negative	M. lentiflavum	ND
M35	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（99.8%） M. simiae（99.4%） M. triplex（99.1%） M. shigaense（99.1%） M. sherrisii（99.1%）	negative	ND	ND
M36	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（99.8%） M. simiae（99.4%） M. triplex（99.1%）	negative	ND	ND
M37	SGM	M. lentiflavum（100%）	M. lentiflavum（99.6%） M. simiae（99.2%） M. triplex（99.0%） M. shigaense（98.9%）	negative	ND	ND
M38	SGM	M. paragordonae（98.6%） M. gordonae（96.8%）	M. paragordonae（99.5%） M. gordonae（99.5%）	negative	M. paragordonae	ND
M39	SGM	M. paragordonae（98.6%） M. gordonae（96.8%）	M. paragordonae（99.8%） M. gordonae（99.8%）	negative	M. paragordonae	ND
M40	SGM	M. scrofulaceum（96.2%） M. asiaticum（95.7%）	ND	M. scrofulaceum	ND	ND
M41	SGM	M. shinjukuense（100%）	M. shinjukuense（99.9%）	negative	M. shinjukuense
M42	SGM	M. ulcerans（100%）	M. ulcerans（99.4%） M. marinum（99.3%）	M. marinum	ND	M. ulcerans

ND：未実施

M28からM37の10株はDDH法が全て陰性で，secA1遺伝子系統樹でM. lentiflavumに同定された。更にGenBankにはM. lentiflavum としてCSURP 1491株とCCUG 42559株が登録されているが，CSURP 1491株と相同率100%が6株（M28, M29, M30, M31, M36, M37），CCUG 42559株と相同率100%が3株（M32, M34, M35），その他が1株（M33）に分類された（Figure 3）。一方，16S rRNA遺伝子では同定に至らず，M. lentiflavum（99.6%～100%），M. palustre（99.6%），M. simiae（99.2%～99.4%），M. triplex（99.0%～99.1%），M. shigaense（99.1%～99.8%），M. sherrisii（99.1%）などの複数の近縁種が存在した（Table 4）。

Figure 3 secA1遺伝子で2系統のM. lentiflavumに分類された臨床分離株（M28～37）のsecA1遺伝子系統樹

secA1遺伝子でSGM 19株中10株（M28～37）がM. lentiflavumに同定された。GenBankにはCSURP 1491株とCCUG 42559株のM. lentiflavumが登録されており，今回の検討ではCSURP 1491と相同率100%が6株（M28, M29, M30, M31, M36, M37），UG 42559と相同率100%が3株（M32, M34, M35），その他が1株（M33）に分類された。

M38とM39の暗発色菌群2株は，secA1遺伝子系統樹解析およびBLAST解析でM. paragordonae（98.6%）に同定され，MALDI-TOF MSの結果と一致した。しかし，16S rRNA遺伝子ではM. paragordonaeとM. gordonaeの相同率に差が無かったため，同定に至らなかった。M40株は，secA1遺伝子系統樹解析とDDH法がM. scrofulaceumで一致したが，secA1遺伝子BLAST解析では相同率が96.2%と低値であった。M41株はsecA1遺伝子，16S rRNA遺伝子，MALDI-TOF MSともM. shinjukuenseであった。M42株はsecA1遺伝子でM. ulceransに同定され，dnaJ/rpoB遺伝子の同定結果と一致した。しかし，16S rRNA遺伝子はM. ulcerans（99.4%）とM. marinum（99.3%）の相同率が高く，DDH法ではM. marinumに同定された（Table 4）。

4． secA1遺伝子でMycobacteroides属に分類された5株

M43からM46の4株は，secA1遺伝子系統樹解析（Figure 4）でM. abscessusに同定され，相同率も98.9%から100%と高かった。そして，DDH法や核酸クロマト法ともM. abscessusで一致した。しかし，16S rRNA遺伝子では，M. abscessus（100%），M. chelonae（99.9%），M. saopaulense（99.9%），M. franklinii（99.7%）の複数菌種が高い相同率を示したため，同定に至らなかった。M47株はsecA1遺伝子系統樹解析でM. chelonae（98.9%）に同定され，DDH法や核酸クロマト法と一致した（Table 5）。

Figure 4 Mycobacteroides標準・基準株と臨床分離株（M43～47）のsecA1遺伝子系統樹

ML法によるsecA1遺伝子系統樹解析の結果，M43～46株はM. abscessus，M47株がM. chelonaeに同定された。

Table 5 secA1遺伝子でMycobacteroidesに分類された臨床分離株5株（M43～47）

no.	分類	secA1同定	16S rRNA同定（塩基一致率）	DDH同定	dnaJ/rpoB	核酸クロマト
M43	Mycobacteroides	M. abscessus（100%）	M. abscessus（100%） M. chelonae（99.9%） M. saopaulense（99.9%） M. franklinii（99.7%）	ND	M. abscessus	M. abscessus subsp. bolletii
M44	Mycobacteroides	M. abscessus（99.2%）	M. chelonae（100%） M. abscessus（100%）	M. abscessus	ND	M. abscessus subsp. massiliense
M45	Mycobacteroides	M. abscessus（98.9%）	ND	M. abscessus	ND	M. abscessus subsp. massiliense
M46	Mycobacteroides	M. abscessus（99.5%）	ND	M. abscessus	ND	M. abscessus subsp. massiliense
M47	Mycobacteroides	M. chelonae（98.9%）	ND	M. chelonae	ND	M. chelonae

ND：未実施

5． secA1遺伝子でMycolicibacterium属に分類された5株

M48からM51の4株は，secA1遺伝子系統樹解析でM. fortuitumに同定され，相同率も99.7%から100%を示した。そして，DDH法，MALDI-TOF MS，核酸クロマト法もM. fortuitumで一致した。しかし，16S rRNA遺伝子ではRunyon IV群であるM. fortuitum（98.6%～99.9%），M. peregrinum（98.4%），M. senegalense（98.4%～99.5%），M. farcinogenes（98.4%～99.5%），M. conceptionense（98.4%～99.4%），M. houstonense（99.5%）が同等の相同率であったため同定出来なかった。

Figure 5 Mycolicibacterium標準・基準株と臨床分離株（M48～52）のsecA1遺伝子系統樹

ML法によるsecA1遺伝子系統樹解析の結果，M48～51株はM. fortuitum，M52株がM. mageritenseに同定された。

M52株は，secA1遺伝子系統樹解析でM. mageritense（99.5%）に同定されたが，16S rRNA遺伝子はM. mageritense（99.9%），M. peregrinum（99.4%），M. cosmeticum（99.1%）が高い相同率を示した（Table 6）。

Table 6 secA1遺伝子でMycolicibacterium属に分類された臨床分離株5株（M48～52）

no.	分類	secA1同定	16S rRNA同定（塩基一致率）	DDH同定	MALDI-TOF MS	核酸クロマト
M48	Mycolicibacterium	M. fortuitum（99.7%）	M. fortuitum（98.6%） M. peregrinum（98.4） M. senegalense（98.4%） M. farcinogenes（98.4%） M. conceptionense（98.4%）	M. fortuitum	ND	M. fortuitum
M49	Mycolicibacterium	M. fortuitum（99.7%）	ND	M. fortuitum	ND	M. fortuitum
M50	Mycolicibacterium	M. fortuitum（99.7%）	ND	M. fortuitum	ND	M. fortuitum
M51	Mycolicibacterium	M. fortuitum（100%）	M. fortuitum（99.9%） M. senegalense（99.5%） M. farcinogenes（99.5%） M. houstonense（99.5%） M. conceptionense（99.4%）	ND	M. fortuitum	M. fortuitum
M52	Mycolicibacterium	M. mageritense（99.5%）	M. margeritense（99.9%） M. peregrinum（99.4%） M. cosmeticum（99.1%）	ND	ND	negative

ND：未実施

6． secA1遺伝子で同定出来なかった1株

M53株は，secA1遺伝子系統樹解析でM. haemophilumが疑われたものの，相同率が91.9%と非常に低く同定不可とした。一方，16S rRNA遺伝子ではM. intermedium（99.2%）に同定されたが，GenBankにM. intermediumのsecA1遺伝子データが存在しなかった。

IV　考察

2005年，Zelaznyら⁸⁾は初めてマイコバクテリウムの同定におけるsecA1遺伝子の有用性について報告した。その当時，GenBankにはマイコバクテリウムのsecA1遺伝子の参照データが5菌種しか無く，Zelaznyらは基準株のsecA1遺伝子シーケンスを行うなど多大な労力を払った。その後，secA1遺伝子を用いたマイコバクテリウムの同定に関する報告は無いが，我々が調査したところ，現在では109菌種以上のsecA1遺伝子データがGenBankに登録されていることから，改めてsecA1遺伝子の有用性について比較検討した。

従来から菌種同定に用いられているDDH法は，19菌種のDNAが固相化されたキットであるが，188菌種に細分化された非結核性抗酸菌に対して同定性能が不十分であり，誤同定にも注意が必要である。例えばM. lentiflavum，M. interjectum，M. paragordonae，M. shinjukuenseなどは19菌種に含まれないため，すべて陰性であった。また，M. ulceransは同じく皮膚病変の原因菌であるM. marinumに誤同定され，M. marseillenseはM. intracellulareに同定されたことから，近縁種の交叉反応が明らかとなった。

検査法が保険収載されたことにより，今後，普及すると思われるMALDI-TOF MSは，高価な装置を必要とするが，操作が簡便で迅速性にも優れている。今回の検討では，M. intracellulareの同定がM. chimaera intracellulare groupとグループ分類に止まったことや，M. interjectumとM. paraenseの区別ができないなど，若干の問題を認めたが，非結核性抗酸菌の参照データが充実していることから，信頼性の高い同定手法であると思われる⁹⁾。

16S rRNA遺伝子は，参照データが膨大で一般細菌の同定手法として信頼が高い。しかし，非結核性抗酸菌においては，種が違っているにも関わらず16S rRNA遺伝子の相同性が高すぎることが多く，M. marseillense，M. intracellulare，M. interjectum，M. lentiflavum，M. paragordonae，M. ulcerans，M. abscessus，M. fortuitum，M. mageritenseなどに複数の近縁種が存在するため，同定に至らないケースが多かった。

それに対して，secA1遺伝子は非結核性抗酸菌の菌種間において適度な相同性を保ち，同定ツールとして良好な結果を得られた。今回の検討においてM. intracellulareとM. yongonenseの相同率が高かったが，この2菌種は全ゲノム解析の結果においても類似していることが報告されており¹⁰⁾，今後M. yongonenseがM. intracellulare subsp. yongonenseに再編成されれば，他の方法で難渋するM. intracellulareの同定において，有用な方法に成ると思われる。

暗発色菌群2株をsecA1遺伝子でM. paragordonae（98.6%）と同定し，その時のM. gordonae（96.8%）との相同率に差を認めた。一方，2005年のZelaznyら⁸⁾の検討では，M. gordonae基準株と臨床分離株のsecA1遺伝子相同率が96.0%から99.0%と幅広かったことを報告している。しかし，その時の参照データにM. paragordonaeが含まれていなかったことを考慮すると，M. gordonaeに同定された臨床分離株中にM. paragordonaeが混じっていたと推測される。このことから，参照データの充実にともない，secA1遺伝子は非結核性抗酸菌の同定ツールとして，更に期待が高まっている。

Runyon III群に分類される臨床分離株の中に，DDH法陰性株が散見され，その多くはM. lentiflavumであった。これは，近年MALDI-TOF MSの普及によって報告数が増加し，市販PCR法でM. intracellulareに誤同定されることでも注目されている⁴⁾。これをsecA1遺伝子で解析した場合，クリアーに同定できる上，菌種内塩基配列変異を検出し，遺伝子型別分類に用いることも可能であった¹¹⁾。

この様に非結核性抗酸菌の同定ツールとして有用であるsecA1遺伝子であるが，BLAST解析で同一菌種と判定する際，相同率に一定の基準が無いことが問題である。例えば16S rRNA遺伝子では相同率98.7%以上で同一種と判断する目安があるが，secA1遺伝子の場合，菌種によって相同率にバラツキがある。Zelaznyら⁸⁾はM. kansasiiの相同率が97.3%から100%と広かったことを報告し，我々の検討でもM. kansasii標準株と臨床分離2株の相同率が100%，96.7%と差を認めた。またM. scrofulaceum（96.2%）の相同率が他の菌種より低くかったことなど，同一菌種と判定する，相同率の目安の設定が困難であった。また，系統樹やBLAST解析は，GenBankなどに登録されている参照データの質と量が重要である。以前と比べるとsecA1遺伝子の参照データが増えているが，16S rRNA遺伝子と比較すると少なく，今回の検討では，M. inermediumの参照データが無かったために54株中1株が同定できなかった。

V　結語

非結核性抗酸菌の菌種が細分化され，従来の検査方法では同定困難になっている。そこで，secA1遺伝子の系統樹解析やBLAST解析を検討した結果，GenBankなどに登録された参照配列が増加したことにより，非結核性抗酸菌の同定ツールとしての有用性が増した。更に16S rRNA遺伝子で困難であった菌種にも有効で，16S rRNA遺伝子を上回る精度で同定できた。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

1) Gupta RS et al.: “Phylogenomics and comparative genomic studies robustly support division of the genus mycobacterium into an emended genus mycobacterium and four novel genera,” Front Microbiol, 2018; 9: 67.
2) 大楠清文：「抗酸菌の検査法培養・同定検査」，Medical Technology, 2019; 47: 119–125.
3) Jakko VI et al.: “A definition of the Mycobacterium avium complex for taxonomical and clinical purposes, a review,” J Syst Evol Microbiol, 2018; 68: 3666–3677.
4) 富田元久，他：「Mycobacterium lentiflavumのコバスTaqMan MAIにおけるMycobacterium intracellulare偽陽性反応についての遺伝子学的検討」，結核，2014; 89: 703–709.
5) 鹿住祐子，他：「皮膚から分離されたMycobacterium shinshuenseの細菌学的解析」，結核，2004; 79: 437–441.
6) Prabudiansyah I et al.: “In vitro interaction of the housekeeping secA1 with the accessory secA2 protein of Mycobacterium tuberculosis,” PLoS One, 2015; 10: e0128788.
7) 戸田圭三，他：「16S rRNAおよびsecA1遺伝子解析でGordonia sputiと同定した1例」，医学検査，2019; 68: 291–295.
8) Zelazny AM et al.: “Identification of mycobacterium species by secA1 sequences,” J Clin Microbiol, 2005; 43: 1051–1058.
9) 鈴木弘倫，他：「比較的まれな非結核性抗酸菌臨床株を対象としたMALDI-TOF-MSによる同定性能の評価」，日本臨床微生物学雑誌，2016; 26: 27–33.
10) Castejon M et al.: “Whole-genome sequence analysis of the Mycobacterium avium complex and proposal of the transfer of Mycobacterium yongonense to Mycobacterium intracellulare subsp. yongonense subsp. nov.,” Int J Syst Evol Microbiol, 2018; 68: 1998–2005.
11) 岩本朋忠，他：「Mycobacterium lentiflavumの菌種内塩基配列変異に関する研究」，結核，2008; 83: 417–422.

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