Japanese Journal of Medical Technology
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Original Articles
Anti-SARS-CoV-2 spike protein S1 domain-IgA antibody may contribute to the early detection of new coronavirus infection
Ryosuke KIKUCHI, Jeong Hui KIM, Atsuo SUZUKI, Rika WATARAI, Satoru YOKOYAMA, Shoji SAITO, Tetsuya YAGI, Tadashi MATSUSHITA
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Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, spike protein S1 domain, nucleocapsid protein, serological diagnostic method
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2020 Volume 69 Issue 4 Pages 546-553

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Abstract

新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）感染症（COVID-19）の補助診断法として血清学的診断法が期待されている。抗SARS-CoV-2抗体試薬は，SARS-CoV-2のspike protein S1 domain（S）とnucleocapsid protein（N）に対する抗体を検出する2種類に大別される。今回我々は，COVID-19と診断された症例の経時的試料を用いて，SとN抗原を用いた抗SARS-CoV-2抗体試薬の検証を行った。S抗原を用いた抗SARS-CoV-2抗体試薬は，EUROIMMUN S-IgA，IgG試薬とVITROS S-total，IgG試薬を使用した。N抗原を用いた抗SARS-CoV-2抗体試薬は，ARCHITECT N-試薬とcobas N-試薬を使用した。その結果，来院時点（第X病日）からEUROIMMUN S-IgA試薬によるIgA抗体は陽性であった。第X + 5病日よりVITROS S-total試薬による抗SARS-CoV-2抗体は陽性となり，第X + 8病日よりARCHITECT N-試薬によるIgG抗体は陽性であった。本症例において，S抗原を用いた抗SARS-CoV-2抗体試薬は早期より抗SARS-CoV-2抗体が陽転化した。特に，抗SARS-CoV-2 S-IgA抗体はCOVID-19の早期補助診断に有用な可能性が示唆された。

Translated Abstract

Serological diagnosis of novel coronavirus (SARS-CoV-2) infection (COVID-19) is expected to be used as an adjunct diagnostic method. There are two main types of anti-SARS-CoV-2 antibody reagents that detect antibodies to the spike protein S1 domain (S) and nucleocapsid protein (N) of SARS-CoV-2. In this study, we tested anti-SARS-CoV-2 antibody reagents using S and N antigens in longitudinal samples from patients diagnosed as having COVID-19. EUROIMMUN S-IgA and IgG reagents and VITROS S-total and IgG reagents were used as anti-SARS-CoV-2 antibody reagents tested using the S antigen. ARCHITECT N-reagent and cobas N-reagent were used as anti-SARS-CoV-2 antibody reagents using N antigen. The results showed that IgA antibodies to EUROIMMUN S-IgA reagent were positive from the time of hospitalization (day X). Anti-SARS-CoV-2 antibodies to VITROS S-total reagent were positive from the X + 5th day of hospitalization. IgG antibodies to ARCHITECT N-reagent were positive from the X + 8th day. In this case, the anti-SARS-CoV-2 antibody reagent tested using the S antigen showed positive results from early in the course of the disease. In particular, the anti-SARS-CoV-2 S-IgA antibody was suggested to be potentially useful as an adjunct for the early diagnosis of COVID-19.

I　 序

2019年12月に中国武漢市で発生したとされる新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）感染症（COVID-19）の確定診断には，鼻咽頭ぬぐい液や喀痰等を試料とした遺伝子検査によりSARS-CoV-2の存在を直接証明することが必要である。しかし，これら試料の採取には高い感染リスクが伴ううえ，遺伝子検査を実施する上での環境整備や熟練度の高い人材の確保など，検査体制を構築するためにいくつかのハードルが存在する1)。さらに，検体搬送等の検査前プロセスが遺伝子検査の結果に影響を及ぼすことが指摘されている2)。そのため，簡便な，かつ精度の高いスクリーニング検査の結果を踏まえた遺伝子検査による確定診断の流れが必要である。

現在，スクリーニング検査の一つとして，血液中の抗SARS-CoV-2抗体を検出する血清学的診断法（抗体検査）が注目されている。抗体検査の中で，イムノクロマト法による簡易的な抗SARS-CoV-2抗体検出法は，特別な装置を必要とせず，外来やベットサイドで迅速かつ簡便に検査することが可能であり，診療所をはじめ医療機関への導入が期待されている。しかし，イムノクロマト法による抗SARS-CoV-2抗体検査の臨床における使途や結果の解釈について見解は定まっていない。一方で，酵素免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA）や化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA），化学発光免疫測定法（chemiluminescent immunoassay; CLIA）あるいは電気化学発光免疫測定法（electro chemiluminescence immunoassay; ECLIA）による抗SARS-CoV-2抗体試薬が開発された。これらの試薬の抗原にはspike protein S1 domain（S）あるいはnucleocapsid protein（N）のいずれかが使用されている。従って，検出できる抗SARS-CoV-2抗体はその免疫グロブリン（immunoglobulin; Ig）のクラス（IgG, IgA, IgM）に加え，SARS-CoV-2のSもしくはNどちらの抗原に対するIgであるかを考慮する必要がある。今回我々は，COVID-19と診断された患者の経時的血清サンプルによる6種類の抗SARS-CoV-2抗体試薬の検証を行った。

II　 対象，症例および方法

1． 対象

2020年4月7日～2020年6月10日までに当院にてSARS-CoV-2に感染もしくは感染の疑いありと診断された患者5例中，定量reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-qPCR）法3)でCOVID-19と確定診断された感染早期1例の検査後残血清を使用した。当院での入院日を第X病日とし，第X + 32病日までに採取された19ポイントの経時的血清サンプルを用い後方視的検討を行った。なお，本研究は名古屋大学医学部生命倫理委員会の承認を得て施行した（承認番号：2020-0095）。

2． 対象症例の背景

患者：70代，男性。

海外渡航歴：なし。

主訴：発熱，呼吸困難。

既往歴：CKD5D（末期腎不全）で週3回の維持透析，胃がん，心筋梗塞，前立腺がん，Ex-smoker（20本/day）。

現病歴：X − 3日，透析開始後悪寒があり37.1℃の発熱を認めた。X − 1日，胸部単純コンピュータ断層撮影法（computed tomography; CT）検査で左右肺に末梢性の間質影を認め近医入院となった。Ceftazidime + Levofloxacin投与，SARS-CoV-2 RT-qPCR検査を施行した。X日，SARS-CoV-2 RT-qPCR陽性確定。同日酸素化悪化のため，透析終了後に当院へ転院となった。

入院時現症：意識清明。身長156 cm，体重43.6 kg，体温38.3℃，血圧110/54 mmHg，脈拍68回／分，SpO2 98%（FiO2 0.32）。CT検査にて両側，肺野末梢胸膜直下に散在するガラス影，下葉には線状網状影が認められた。

入院後経過：第X病日より当院EMICU入室となり，Favipiravir（1日目3,600 mg，2日目以降1,600 mg）+ Tazobactam/Piperacillin + Azithromycinによる治療開始。週3回で維持透析を継続。治療開始後もC-reactive protein（CRP）は微増傾向であり，酸素投与も継続して必要とした。第X + 4病日にはCRP 14.11 mg/dLまで上昇したが，この日を境に改善傾向となり，解熱もみられた。抗菌薬は第X + 6病日に投与中止とし，Favipiravirは第X + 13病日までで投与終了とした。第X + 15病日には酸素投与も終了。経過中に肝機能障害などの副作用は認められなかった。定期的に喀痰SARS-CoV-2 RT-qPCR検査が施行されたが，第X + 25病日までは陽性判定が継続した。第X + 30病日にようやく喀痰SARS-CoV-2 RT-qPCR陰性となった。

3． 測定試薬と専用分析機器

測定試薬は，ELISA法キットと4種類の自動分析専用機器用試薬を用いた。ELISA法の測定試薬は，EUROIMMUN Japan社のAnti-SARS-CoV-2 ELISA（IgA）（以下：EURO S-IgA試薬，Lot：E200324BP）およびAnti-SARS-CoV-2 ELISA（IgG）（以下：EURO S-IgG試薬，Lot：E200323AY）を用いた。CLEIA法の測定試薬としてオーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社のVITROS Immunodiagnostic Products Anti-SARS-CoV-2 Total Reagent Pack（以下：VITROS S-total試薬，Lot：0024）およびVITROS Immunodiagnostic Products Anti-SARS-CoV-2 IgG Reagent Pack（以下：VITROS S-IgG試薬，Lot：0160）を使用した。CLIA法の測定試薬にはアボットジャパン株式会社のARCHITECT SARS-CoV-2 antibody detection kit（以下：ARCHITECT N-IgG試薬，Lot：16253FN00）を使用し，ECLIA法による測定試薬にはロシュ・ダイアグノスティックス株式会社のElecsys Anti-SARS-CoV-2（以下：cobas N試薬，Lot：496298）を使用した。それぞれ専用の自動分析装置として，全自動免疫生化学統合システムVITROS 5600II（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社，CLEIA法），全自動化学発光免疫測定装ARCHITECT i2000SR（アボットジャパン株式会社，CLIA法）と全自動電気化学発光免疫測定装置cobas8000（e602）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社，ECLIA法）を用いた。ELISA法における吸光度測定にはMultiskan FC（Thermo Fisher Scientific株式会社）を使用した。なお，それぞれの測定系の特徴ならびに使用されている抗原と標的とする抗SARS-CoV-2抗体をTable 1に示した。

Table 1  Performance specification of analytical instruments and Anti SARS-CoV-2 reagents
Manual Method Auto analyser
VITROS 5600II ARCHITECT i2000SR cobas8000 (e602)
Vender EUROIMMUN Japan Ortho Clinical Diagnostics Inc. Abbot Inc. Roche Diagnostics K.K.
Product Name Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgA) VITROS Immunodiagnostic Products Anti-SARS-CoV-2 Total Reagent Pack ARCHITECT SARS-CoV-2 antibody
detection kit		 Elecsys Anti-SARS-CoV-2
Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) VITROS Immunodiagnostic Products Anti-SARS-CoV-2 IgG Reagent Pack
Principle ELISA CLEIA CLIA ECLIA
Target Antigen S S N N
Detect Antibody IgA IgA, IgM, IgG IgG Matured antibody
(IgM, IgG)
IgG IgG
Measurement Time (min) 120~180 48 29 18

ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; CLEIA, chemiluminescent enzyme immunoassay; CLIA, chemiluminescent immunoassay; ECLIA, electro chemiluminescence immunoassay; S, spike protein S1 domain; N, nucleocapsid protein.

4． 判定基準

判定は試薬添付文書に記載の判定基準に従った。各試薬の陽性判定基準はEURO S-IgA試薬およびS-IgG試薬で1.1 ratio of absorbance（患者試料の吸光度／キャリブレーターの吸光度）以上，VITROS S-total試薬およびS-IgG試薬で1.0 S/C以上，ARCHITECT N-IgG試薬で1.4 index以上，cobas N試薬では1.0 C.O.I以上であった。

III　 結果

抗SARS-CoV-2抗体が陽転化に至るまでの日数の比較

各試薬による測定結果をTable 2に示した。測定値と判定基準に基づく陽性（POS）あるいは陰性（NEG）判定を評価した。

Table 2  Seroconversion of anti-SARS-CoV-2 antibody in various reagents during follow up periods
Days RT-qPCR Anti-SARS-CoV-2 ELISA VITROS Immunodiagnostic
Products Reagent Pack		 ARCHITECT SARS-CoV-2
antibody detection kit		 Elecsys Anti-SARS-CoV-2
S S N N
IgA IgG Total IgG IgG Total
ratio Result ratio Result S/C Result S/C Result Index Result C.O.I Result
X POS 1.16 POS 0.19 NEG 0.09 NEG 0.01 NEG 0.05 NEG 0.15 NEG
X + 1 N/A 1.44 POS 0.22 NEG 0.10 NEG 0.01 NEG 0.05 NEG 0.17 NEG
X + 2 N/A 2.03 POS 0.23 NEG 0.12 NEG 0.02 NEG 0.13 NEG 0.43 NEG
X + 3 N/A 2.24 POS 0.24 NEG 0.33 NEG 0.08 NEG 0.18 NEG 0.51 NEG
X + 5 N/A 1.77 POS 0.32 NEG 1.23 POS 0.27 NEG 0.69 NEG 0.93 NEG
X + 6 N/A 2.44 POS 0.33 NEG 2.04 POS 0.41 NEG 0.93 NEG 0.98 NEG
X + 8 N/A 4.92 POS 0.44 NEG 4.43 POS 0.59 NEG 1.40 POS 0.96 NEG
X + 9 POS 10.4 POS 0.72 NEG 5.03 POS 0.63 NEG 1.47 POS 0.98 NEG
X + 12 N/A 11.8 POS 1.50 POS 8.94 POS 1.54 POS 1.92 POS 0.95 NEG
X + 13 POS 9.61 POS 1.41 POS 8.53 POS 1.45 POS 1.92 POS 0.86 NEG
X + 16 N/A 10.3 POS 1.98 POS 8.07 POS 2.36 POS 2.11 POS 0.87 NEG
X + 17 POS 11.8 POS 2.94 POS 7.54 POS 3.96 POS 2.16 POS 0.79 NEG
X + 19 N/A 12.4 POS 3.27 POS 7.77 POS 4.83 POS 2.19 POS 0.87 NEG
X + 20 POS 13.6 POS 3.33 POS 7.76 POS 5.26 POS 2.25 POS 0.77 NEG
X + 21 N/A 14.3 POS 4.28 POS 7.42 POS 7.42 POS 2.22 POS 0.59 NEG
X + 25 POS 11.4 POS 4.05 POS 7.91 POS 7.01 POS 2.31 POS 0.34 NEG
X + 27 N/A 12.1 POS 5.28 POS 6.80 POS 7.70 POS 2.17 POS 0.33 NEG
X + 30 NEG 11 POS 5.67 POS 7.54 POS 7.50 POS 2.16 POS 0.30 NEG
X + 32 N/A 10.9 POS 6.42 POS 6.26 POS 7.71 POS 2.59 POS 0.30 NEG

RT-qPCR, reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction; S, spike protein S1 domain; N, nucleocapsid protein; NEG, negative; POS, positive; N/A, not assessment; ratio, ratio of absorbance; S/C, Signal for test sample/Signal at Cutoff; C.O.I, cutoff index.

1． EURO S-IgGおよびS-IgA試薬

EURO S-IgA試薬による抗SARS-CoV-2 S-IgA抗体は第X病日より陽性であり一方でEURO S-IgG試薬による抗SARS- CoV-2 S-IgG抗体は第X + 12病日から陽性であった。

2． VITROS S-total試薬とS-IgG試薬

VITROS S-total試薬による抗SARS-CoV-2 S-total抗体は第X + 5病日より陽性であり，VITROS S-IgG試薬による抗SARS-CoV-2 S-IgGは第X + 12病日より陽性であった。

3． ARCHITECT N-IgG試薬

ARCHITECT N-IgG試薬による抗SARS-CoV-2 N-IgG抗体は第X + 8病日より陽性であった。

4． cobas N試薬の陽転化

cobas N試薬は観察期間中のサンプルですべて陰性であった。

また，それぞれの測定値をプロットしたものをFigure 1に示した。EURO S-IgA試薬の測定値は第X病日より経時的に上昇し，第X + 21病日に頭打ちとなった。また，VITROS S-Total試薬では，陽性判定はEURO S-IgA試薬よりもやや遅れたものの測定値は第X病日から経時的に上昇しEURO S-IgA試薬と同様の推移を示した。ARCHITECT N-IgG試薬は第X + 8日から，VITROS S-IgG試薬とEURO S-IgG試薬は第X + 12日から陽性となった。cobas N試薬は観察期間中のサンプルですべて陰性であった。

Figure 1 Seroconversion of anti-SARS-CoV-2 antibody in various reagents

A straight line indicated cutoff value for Artchitect reagent (cutoff = 1.4). A dotted line indicated cutoff value for without Artchitec reagents (cutoff = 1.0).

IV　 考察

2020年5月以降，数多くの抗原検査や抗体検査試薬が上市している。抗原検査はPCR検査と同様，鼻咽頭ぬぐい液を検体とすることから，検体採取には十分な感染対策を行う必要がある。最近，唾液によるPCR検査や抗原検査の有用性について検討されはじめたが，現時点での臨床における使途は不明である。一方，患者血液の特異抗体を検出する抗体検査は，PCR検査や抗原検査と比較すると，検体採取時の感染リスクが低いと考えられる。しかし，抗体試薬はワクチンや治療法が確立できていない状況下において感度試験が極めて重要である。そのため，抗体試薬の感度試験には，セロコンバージョンパネルを用いることが不可欠であるが，現時点においてセロコンバージョンパネルは市販されていない。

今回我々は，COVID-19と診断された症例の経時的血清サンプル19ポイントによる感度試験を6種類の抗SARS-CoV-2抗体試薬について検証した。

本症例は，来院時の血清中抗SARS-CoV-2抗体はS-IgA抗体のみ陽性であった。第X + 5病日にはVITROS S-total試薬による陽性結果が得られ，第X + 8病日からはARCHITECT N-IgG試薬で陽性が得られた。その後，第X + 12病日からはEURO S-IgG試薬とVITROS S-IgG試薬で陽性が得られた。本症例において，EURO S-IgA試薬は今回検証した測定試薬のうちもっとも早期に抗SARS-CoV-2抗体を検出できることが明らかとなった。一方，本症例ではcobas N試薬による抗SARS-CoV-2抗体を検出することができなかった。cobas N試薬はN抗原に対する免疫グロブリンのうち，回復期に出現する成熟化IgMとIgGを標的とした試薬とされている。そのため，感染初期や急性期における抗SARS-CoV-2抗体の検出感度が低いと推察されるが，抗体特性の詳細については非公表であり今後更なる検証が必要と考える。しかし，cobas N試薬は健常人を対象としたサーベイランスとして，無症候性感染患者の把握と感染の既往の疫学調査を行う場合に有用かもしれない。

中国のSARS-CoV-2陽性患者173人を対象とした研究では，IgMとIgG抗体が陽性となる期間は発症後中央値で12日から14日であると報告されている4)。最初の1週間までの抗体出現率はIgMで28.7%，IgGで19.1%であったが，その後急速に増加し，15日目以降ではIgMで94.3%，IgGで79.8%と報告されている4)。今回の症例でも発症後8～12日でIgGが陽性となった。一方で，興味深いことに，IgAについては発症初期から陽性となっていた。

IgAは，哺乳類および鳥類に存在する免疫グロブリンの一種であり，粘膜免疫の主役として消化管や呼吸器における免疫機構の最前線で機能している。ヒト血清中のにおけるIgA産生量は各種免疫グロブリンの中でもIgGに次いで2番目に多く，形質細胞から産生される。形質細胞はリンパ球の一種であるB細胞から分化した抗体産生能を持つ細胞であるが，通常IgMを産生するとされており，形質細胞がIgA産生能を獲得するためにはサイトカインの刺激が必要である。そのメカニズムとして，B細胞がトランスフォーミング増殖因子-βやインターロイキン(IL)-4の作用を受けることにより免疫グロブリンのクラススイッチが誘導され，クラススイッチを終えた細胞はさらにIL-5およびIL-6の刺激を受けてIgA産生能を持つ形質細胞に分化すると考えられている5)。SARS-CoV-2感染においては，感染にともなう炎症反応の誘導にangiotensin-converting enzyme 2（ACE2）が関連していることが報告されている6)。SARS-CoV-2が細胞に感染すると細胞膜上のACE2発現が減少し，そのリガンドであるアンジオテンシン2（AngII）が増加し，アンジオテンシン受容体タイプ1（AT1R）との結合を介して炎症反応の増強が起こると考えられている。AngII-AT1R経路は血圧上昇作用がある一方で，細胞膜上の蛋白質分解酵素であるADAM17（a disintegrin and metalloproteinase domain 17）を活性化し，細胞表面状の膜型TNFα（tumor necrosis factor-alpha）やIL-6受容体α（IL-6Rα）を切断し，可溶性TNFαや可溶性IL-6Rα（sIL-6Rα）を放出させる。TNFαは転写因子NF-κBを活性化し，IL-6などの標的分子を誘導することが報告されている7)。つまり，今回S-IgA抗体が発症初期に検出されたのは，SARS-CoV-2感染の一つの特徴である可能性が示唆される。しかし，今後更なる解明が求められる。

抗SARS-CoV-2抗体測定試薬には，spike protein S1 domain（S）あるいはnucleocapsid protein（N）の2種類のいずれかが抗原として使用されている。SARS-CoV-2のNは，ウイルスribonucleic acid（RNA）ゲノムに結合し，RNAゲノムを長い螺旋状のヌクレオカプシドへ包み込むか，リボ核タンパク質を形成し，ウイルス増殖時のRNAゲノムの合成およびRNAゲノムの転写，さらに感染細胞の代謝を調節するウイルスに必須のタンパク質である。Nは保存性が高く免疫原性が高いためウイルス感染時に多量に発現し，感染細胞の免疫応答を誘導する可能性が査読前論文で示唆されている（https://doi.org/10.1101/2020.03.06.977876）。そのため，先行試薬の多くでSARS-CoV-2のNを抗原とした抗SARS-CoV-2抗体試薬の開発が進んだと推察される。

一方，SはS1とS2で構成され，このうちヒト細胞への侵入のきっかけとなるACE2と結合能を有するのはS1部分とされている。これまでに，オンラインで掲載されたアメリカの国立研究機関であるロスアラモス国立研究所からの査読前論文では（https://doi.org/10.1101/2020.04.29.069054），ウイルスの構造に重要なSタンパクに現時点で14箇所の変異が報告されている。そのため，今後SARS-CoV-2 S抗原の変異によりSを抗原とした抗SARS-CoV-2抗体試薬で検出ができない症例が出てくる可能性があることは留意すべきかもしれない。

SとN抗原に対する抗SARS-CoV-2抗体の産生能について，S抗原による抗体産生の方がN抗原による抗体産生より早い可能性が指摘されている8)。本症例においてもS抗原を用いた抗体試薬が早い段階で陽性となっていた。つまり，S抗原を用いた抗体検査は感染初期から，N抗原を用いた抗体検査は活動期，慢性期において検出されるため，感染早期，活動期，慢性期を判別できる可能性がある。今後更なる検証が必要ではあるが，抗SARS-CoV-2 S or N抗体によるSARS-CoV-2感染の早期，活動期，慢性期が判別可能となることを期待したい（Figure 2）。

Figure 2 Schematic diagram of SARS-CoV-2 S and N-antibody detection timing

Anti-SARS-CoV-2 S antibody may detect acute phase in COVID-19. Anti-SARS-CoV-2 S and N-antibody may detect active and/or chronic phase in COVID-19.

今回我々は，同一患者における抗SARS-CoV-2抗体の推移をおよそ1ヶ月間に渡って検証した。本症例を通して，抗体検査試薬の感度試験に不可欠なセロコンバージョンパネル様検証を行うことが出来たことは本研究の特徴と言える。その結果本症例において，S抗原を用いた抗SARS-CoV-2抗体試薬の中でS-IgA抗体がSARS-CoV-2の感染早期を判定する上で有用となる可能性が示唆された。しかし，1症例であること，また，感染から発症までの期間を正確に追跡できていないことから，当院入院以前の抗SARS-CoV-2抗体の推移を検証できていない点は本研究の欠点である。また，今回使用した抗SARS-CoV-2抗体試薬に使用されている抗原についての情報は非公表であり，各抗体試薬による反応性の違いについて明らかにすることができなかったことも本研究の欠点である。今後，正確に追跡できている感染早期症例を対象とした検証が必要である。

V　 結語

COVID-19の早期検出に適した抗SARS-CoV-2特異的抗体検査として，抗SARS-CoV-2 spike protein S1 domain-IgA抗体が補助診断に使用できる可能性が示唆された。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

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