2021 Volume 70 Issue 3 Pages 489-496
〈目的〉目視法による乳癌HER2-FISH検査は，癌細胞20個以上のHER2およびCEP17シグナルを計測し，平均HER2 copy数およびHER2/CEP17比を算出して判定を行う。しかし目視法では観察者によって判定結果に差が出る可能性がある。今回，同一検体に対して複数の観察者が目視法と自動カウント法を行い，自動カウント法の有用性を検討した。〈方法〉免疫染色でHER2タンパク2+を示した乳癌8例を対象とした。自動カウント法では画像解析装置Metaferシステムを用いた。観察者は4名で，目視法，自動カウント法の順でシグナルカウントを行い，結果を比較した。〈結果・考察〉自動カウント法では1症例平均212個の癌細胞を測定した。目視法では，8例中4例で判定に不一致が認められた。これらの4例は，平均HER2 copy数の値に顕著な観察者間のバラツキを認めた。目視法で判定不一致となった4例中3例は，自動カウント法ではNegative判定で一致した。〈結語〉目視法に比して，自動カウント法はHER2-FISH検査の高い一致性を示した。自動カウント法は多数の細胞を測定可能で，客観性および再現性の高い結果が期待できる。自動カウント法は精度管理の手段としても有用であり，HER2-FISH検査の精度向上に貢献できると思われる。
In the manual HER2-FISH test for breast cancer, the observer measures the HER2 and CEP17 signals of more than 20 cancer cells and calculates the mean number of HER2 copies and the HER2/CEP17 ratio. However, the results obtained manually may differ depending on the observer. The purpose of this study is to examine the usefulness of the automatic counting method by having multiple observers perform manual and automatic counting on the same sample. Eight breast cancer cases determined to be HER2 protein 2+ by immunohistochemical staining were included. The average number of cells measured by the automatic counting method was 222. The manual method showed discrepancies in four of the eight cases. In these four cases, the average HER2 copy number between observers was significantly different. Three of the four cases that did not match in the manual method were negative in the automatic counting method. Compared with the visual method, the automatic counting method showed a high degree of consistency in the HER2-FISH test. The automatic counting method can measure a large number of cells, and highly objective and reproducible results can be obtained. The automatic counting method is also useful as a means of quality control and may contribute to improving the accuracy of the HER2-FISH test.
Human epidermal growth factor receptor type2（以下HER2）は，乳がん患者における予後因子として臨床的に重要視されている。また治療的側面として，浸潤性乳癌の15～25%にHER2の遺伝子増幅およびタンパクの過剰発現が認められ，これらの症例には抗HER2治療薬が奏功を示す1)～3)。HER2タンパクの過剰発現の検索には免疫組織化学染色（以下IHC）を用いる。HER2遺伝子増幅の検索には様々な方法が存在するが，fluorescence in situ hybridization（以下FISH）法が最も普及している。
近年，抗HER2治療薬の相次ぐ開発による治癒率の向上がもたらされる一方で，プレシジョンメディシンの観点から，より適正な対象への使用が求められている。また，2013年にAmerican Society of Clinical Oncology（以下ASCO）／College of American Pathologists（以下CAP）はガイドラインを改訂4)し，IHCおよびFISHによる検査の判定基準に変更が加えられた。改定後のガイドラインでは，FISHの基準に平均HER2 copy数による検討項目が追加され，より厳密にシグナルのカウントを行う必要がある5)。
現在，FISH法のシグナルカウントは目視法が一般的である。目視による乳癌HER2-FISH検査は，癌細胞20個以上のHER2およびCEP17シグナルを計測し，平均HER2 copy数およびHER2/CEP17比を算出して判定を行う。しかし，目視法では，観察者や施設により結果に相違が生じることが報告されている6),7)。特に，HER2遺伝子増幅様式にheterogeneityを示す症例では結果判定の不一致が起こりやすい。また，IHCにより2+と判定された症例では，染色性に不均一を示すことが少なくない。このようなheterogeneityを示す症例に対してより正確にFISH検査を評価していくためには，再現性が高く，施設間差のない客観的な判定方法による精度管理が必要である。当院では，HER2-FISH検査が行われる全乳癌検体に対し，自動でシグナルをカウントするアプリケーションMetaCyteを搭載した蛍光顕微鏡画像解析装置Metaferシステム（Carl Zeiss社）を用いて結果判定を行っている8)。この自動カウント法による判定結果は，目視で算出された値とよく相関し，再現性に優れることが報告されている9)。しかし，同一検体に対して，複数の観察者が目視法と自動カウント法の2つの方法を用いた判定結果を比較検討した報告はない。
今回我々は，HER2-FISH検査の精度向上を目的として，IHCでHER2タンパクが2+でかつ不均一な染色性を示す症例を対象とし，4人の観察者が目視法および自動カウント法による判定を行い，自動カウント法の有用性を検討したので報告する。
当院にて2016年4月から2017年3月の間にHER2-FISH検査が行われた浸潤性乳癌症例を対象とした。全ての検体は10%中性緩衝ホルマリンで6～72時間固定した。IHCによりHER2タンパク2+と判定され，かつ染色性が不均一性を示す8例（手術材料4例，生検材料4例）を対象とした（Figure 1）。
The case represents HER2 protein (2+).
材料はホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから4～5 μmに薄切した組織切片を使用した。プローブはPathVysion HER2 DNAプローブキット（Abbott社）を用いて行った。FISH法の前処理は自動前処理機VP2000（Abbott社）を用い，添付文書10)に従って実施した。
3． FISH法の判定方法観察者は細胞同定能力を有する病理担当技師4名で，それぞれがこの8症例に対し，目視法と自動カウント法により判定を行った。観察者は，年に1回以上の頻度で，HER2-FISH判定結果既知の検体を用いて，観察者間での目合わせを行っている。自動カウント法によるシグナル計測は，画像解析装置Metafer（Carl Zeiss社）を用いて行った。まず，IHCにてHER2タンパクの染色分布と強度を確認後，HER2タンパク発現の強い部位を選択し，同部位に対してHER2-FISHの評価を行った。最初に目視法により20個以上の癌細胞のシグナルカウントを行い，次に自動カウント法によりシグナルカウントを行って，それぞれの結果を比較した。
4． FISH標本の適正評価FISH標本は，時間の経過とともに発色強度が減弱することが知られている。今回の検討では，標本作製当日中に，全ての観察者が目視法および自動カウント法によりシグナルカウントを実施した。各観察者はシグナルカウント前に，FISH標本のシグナルの発色強度を検証し，「極めて明るく，明確に区別できるシグナルが，ハイブリダイゼーションエリア内の少なくとも90%以上の核に存在する10)」ことを確認した。
5． 自動カウント法による評価方法観察者はFISH標本から対物40倍で10視野を選択し，自動カウントを行った。1視野の面積は0.035 μm2であった。読み取りを開始後，4'6-diamidino・2-phenylindole（DAPI）染色による蛍光強度から測定する個々の細胞を識別した8)。選択した視野内のシグナル認識可能な細胞が32個未満の場合は，Food and Drug Administration（以下FDA）の規定により自動カウント困難と判定され，評価から除外した。識別された細胞の，HER2とCEP17のシグナルをそれぞれ自動でカウントし，HER2/CEPI7の比を自動で算出した。計測に際しては，Z軸方向での重なりも加味して評価された。HER2シグナルが境界不明瞭なクラスターを形成する（高度HER2遺伝子増幅領域）場合は，HER2シグナルの総面積から割り出しHER2 copy数を算出する11)。
6． IHC材料は3～4 μmの厚さに薄切したホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを使用し，ベンタナXTシステムベンチマーク（Roche Diagnostics社）を用い，ベンタナI-VIEWパスウェーHER2（4B5）のキットを用いて実施した。判定は，日本病理学会認定病理専門医が行った。
7． 検討項目4人の観察者が，目視法，自動カウント法それぞれにより判定した結果を比較した。また，平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比の数値の差異を，標準偏差を用いて比較した。Case 7を対象として，視野数と自動カウント法による結果の再現性について追加検討した。自動カウントする視野数を1視野，3視野，6視野，10視野と変更し，それぞれ3回ずつ計測した。このFISH判定結果と，平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比の数値の差異を，標準偏差を用いて比較した。
目視法による判定は，8例中4例（Case 1, 4, 5, 6）で結果に不一致が認められた（Table 1）。これらの症例では観察者間で平均HER2 copy数やHER2/CEP17比の値に顕著な差が認められた。不一致となった4症例の判定結果の内訳は，3例（Case 1, 5, 6）ではそれぞれNegative，Equivocal，Positiveの3つの判定に，1例（Case 4）はNegativeとPositiveの2つの判定に判定結果が分かれた。これら4症例では，ほとんどの癌細胞はHER2 copy数が2～4個であったが，HER2 copy数の多い癌細胞がごく少数の割合で存在していた（Figure 2）。
| Case 1 | Case 2 | Case 3 | Case 4 | Case 5 | Case 6 | Case 7 | Case 8 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | HER2 | 3.2 | 4.9 | 3.9 | 2.1 | 4.5 | 4.5 | 3.9 | 4.4 |
| CEP17 | 2.1 | 2.1 | 2.4 | 2.0 | 2.0 | 2.1 | 2.9 | 4.1 | |
| Ratio | 1.5 | 2.3 | 1.6 | 1.0 | 2.2 | 2.3 | 1.3 | 1.1 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Negative | Positive | Positive | Negative | Equivocal | |
| B | HER2 | 4.6 | 5.5 | 3.9 | 2.3 | 4.0 | 2.7 | 3.5 | 4.0 |
| CEP17 | 2.6 | 2.0 | 2.8 | 2.1 | 2.1 | 2.2 | 2.8 | 3.8 | |
| Ratio | 1.8 | 2.8 | 1.4 | 1.1 | 1.9 | 1.3 | 1.2 | 1.1 | |
| HER2 status | Equivocal | Positive | Negative | Negative | Equivocal | Negative | Negative | Equivocal | |
| C | HER2 | 3.8 | 5.2 | 2.2 | 4.0 | 3.6 | 2.4 | 3.0 | 4.0 |
| CEP17 | 2.8 | 2.1 | 2.1 | 2.0 | 2.6 | 2.1 | 2.3 | 4.4 | |
| Ratio | 1.4 | 2.5 | 1.0 | 2.0 | 1.4 | 1.4 | 1.4 | 0.9 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Positive | Negative | Negative | Negative | Equivocal | |
| D | HER2 | 7.5 | 6.0 | 3.5 | 4.2 | 4.6 | 5.3 | 3.5 | 5.6 |
| CEP17 | 3.0 | 1.9 | 1.9 | 1.7 | 2.5 | 3.6 | 2.5 | 5.1 | |
| Ratio | 2.5 | 3.1 | 1.8 | 2.5 | 1.8 | 1.5 | 1.4 | 1.1 | |
| HER2 status | Positive | Positive | Negative | Positive | Equivocal | Equivocal | Negative | Equivocal |
HER2: Average HER2 gene copy number
CEP17: Average CEP17 gene copy number
Ratio: HER2/CEP17 ratio
Few cells demonstrated high HER2 in the same cancer.
A) HER2 signals: 2, CEP17 signals: 2
B) HER2 signals: 4, CEP17 signals: 3
C) HER2 signals: 7, CEP17 signals: 4
今回，自動カウント法では1症例平均212個（最大571個，最小56個）の癌細胞を測定した。自動カウント法による判定は，8例中2例（Case 4, 7）で結果に不一致が認められた（Table 2）。Case 4のHER2/CEP17比は，2.1，2.0，1.8，2.0で，判定はPositive 3名とNegative 1名に分かれたが，測定値に大きな差はなかった。Case 7の判定結果は，Negative 3名とEquivocal 1名に分かれた。Negativeと判定した3名の測定細胞数はそれぞれ571個，532個，474個であったのに対し，Equivocalと判定した1名の測定細胞数は150個と少なかった。
| Case 1 | Case 2 | Case 3 | Case 4 | Case 5 | Case 6 | Case 7 | Case 8 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | Count Number | 301 | 188 | 429 | 95 | 238 | 135 | 571 | 145 |
| HER2 | 2.9 | 6.0 | 2.5 | 2.9 | 3.7 | 2.9 | 3.4 | 5.2 | |
| CEP17 | 2.1 | 1.9 | 2.3 | 1.4 | 1.8 | 2.4 | 3.0 | 5.2 | |
| Ratio | 1.4 | 3.1 | 1.1 | 2.1 | 1.9 | 1.2 | 1.1 | 1.0 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Positive | Negative | Negative | Negative | Equivocal | |
| B | Count Number | 178 | 56 | 313 | 78 | 140 | 341 | 150 | 83 |
| HER2 | 2.9 | 5.5 | 2.9 | 2.8 | 3.9 | 3.7 | 4.2 | 5.2 | |
| CEP17 | 2.0 | 1.9 | 2.7 | 1.4 | 2.0 | 3.1 | 3.5 | 5.0 | |
| Ratio | 1.4 | 2.9 | 1.1 | 2.0 | 1.9 | 1.2 | 1.2 | 1.0 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Positive | Negative | Negative | Equivocal | Equivocal | |
| C | Count Number | 305 | 75 | 112 | 57 | 259 | 165 | 532 | 140 |
| HER2 | 2.8 | 5.6 | 3.0 | 2.9 | 3.1 | 3.5 | 3.5 | 5.1 | |
| CEP17 | 2.1 | 2.1 | 2.7 | 1.6 | 1.9 | 3.2 | 3.1 | 5.2 | |
| Ratio | 1.4 | 2.7 | 1.1 | 1.8 | 1.6 | 1.1 | 1.1 | 1.0 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Negative | Negative | Negative | Negative | Equivocal | |
| D | Count Number | 112 | 58 | 332 | 90 | 213 | 312 | 474 | 81 |
| HER2 | 3.0 | 5.3 | 3.0 | 3.0 | 3.2 | 3.9 | 3.6 | 5.1 | |
| CEP17 | 2.3 | 2.0 | 2.7 | 1.5 | 1.8 | 3.4 | 3.2 | 5.6 | |
| Ratio | 1.3 | 2.7 | 1.1 | 2.0 | 1.8 | 1.2 | 1.1 | 0.9 | |
| HER2 status | Negative | Positive | Negative | Positive | Negative | Negative | Negative | Equivocal |
HER2: Average HER2 gene copy number
CEP17: Average CEP17 gene copy number
Ratio: HER2/CEP17 ratio
目視法で判定結果が不一致となった4症例のうち，3例（Case 1, 5, 6）は自動カウント法ではNegative判定で一致した。目視法と自動カウント法による平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比の値の相違は，全症例で目視法よりも自動カウント法の方が小さかった（Figure 3）。一方で，特定の観察者に，シグナル計測数の多寡の偏りは認められなかった。
(X axis: cases, Y axis: standard deviation)
自動カウントする視野数とFISH判定結果の再現性の関係をTable 3とFigure 4に示す。視野数が多いほど測定細胞数は増加した。選択した視野が1視野と3視野の場合は判定結果がNegative，Equivocalに分かれたのに対し，6視野と10視野の場合はNegative判定で全て一致した。また，視野数が多いほど，平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比の数値の差異は小さい傾向がみられた。
| Counted number of field | First | Second | Third | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Count number | 68 | 52 | 48 |
| HER2 | 3.7 | 4.0 | 4.2 | |
| CEP17 | 3.4 | 3.3 | 3.1 | |
| Ratio | 1.1 | 1.3 | 1.4 | |
| HER2 status | Negative | Equivocal | Equivocal | |
| 3 | Count number | 147 | 187 | 158 |
| HER2 | 4.1 | 3.6 | 3.7 | |
| CEP17 | 3.2 | 3.3 | 3.1 | |
| Ratio | 1.3 | 1.1 | 1.2 | |
| HER2 status | Equivocal | Negative | Negative | |
| 6 | Count number | 316 | 257 | 253 |
| HER2 | 3.6 | 3.5 | 3.3 | |
| CEP17 | 3.0 | 2.8 | 2.9 | |
| Ratio | 1.2 | 1.2 | 1.1 | |
| HER2 status | Negative | Negative | Negative | |
| 10 | Count number | 565 | 723 | 595 |
| HER2 | 3.5 | 3.7 | 3.5 | |
| CEP17 | 3.2 | 3.2 | 3.1 | |
| Ratio | 1.1 | 1.2 | 1.1 | |
| HER2 status | Negative | Negative | Negative |
HER2: Average HER2 gene copy number
CEP17: Average CEP17 gene copy number
Ratio: HER2/CEP17 ratio
(Y axis: standard deviation)
HER2: Average HER2 gene copy number
CEP17: Average CEP17 gene copy number
Ratio: HER2/CEP17 ratio
自動カウント法による判定は，目視法よりも多くの細胞を測定することが可能となり，より客観的な判定結果が算出できると期待されている。今回の検討でも，自動カウント法により1症例平均212個と多数の癌細胞の測定が可能であった。今回我々は，IHCによりHER2タンパクが2+でかつ不均一な染色性を示す8症例に対し，4人の観察者が目視法と自動カウント法の2法によりシグナル算出を行い比較検討し，自動カウント法の有用性を検討した。
目視法による判定では，8例中4例で判定結果に不一致が認められた。これらの症例ではHER2 copy数の多い癌細胞がごく少数の割合で混在しており，観察者の選択した視野および細胞によって，判定結果の相違が生じたと考えられる。目視法で不一致であった4例のうち3例は，自動カウント法によりNegativeの判定で一致した。このことは自動カウント法では多数の細胞を測定することで値が平均化されたためと思われる。また，今回検討した全症例の平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比において，目視法よりも自動カウント法の方が値のバラツキが小さかった。このことから，目視法ではHER2 copy数の多い細胞がごく少数存在する症例では，観察者の主観に判定が左右される可能性がある一方で，自動カウント法では客観性の高い判定結果を得られる可能性が高いことが示唆された。
一方で，自動カウント法により判定が不一致となった症例（Case 4, 7）も認められた。Case 4では，3名がPositive，1名がNegative判定であった。4名のHER2/CEP17比は，各々2.1，2.0，1.8，2.0で，非常に近い値を示した。この症例では，標本中に測定対象となる癌細胞が少量であったため，4名全員の測定細胞数が100個に満たなかった。このように，測定細胞が少量でかつ2.0付近のHER2/CEP17比を示す場合は，自動カウント法でも測定者によって判定が異なる可能性が示唆された。このような症例においては，病理医を含む複数の観察者により，目視法でもシグナル計測を行い，判定結果に問題がないかを十分に協議する必要があると考えられる。
Case 7では，3名がNegative，1名がEquivocal判定であった。その原因として測定細胞数が挙げられる。Negativeと判定した3名の測定細胞数は500個前後であったのに対し，Equivocalと判定した1名の測定細胞数は150個と少なかった。視野数を変えて測定した検討では，測定視野が多いほど測定細胞数が増え，判定の一致率や平均HER2 copy数，平均CEP17 copy数，HER2/CEP17比に再現性の高い結果が得られることが証明された。
今回，目視法および自動カウント法で判定が不一致となった原因は，観察者それぞれが選択する視野や細胞が異なることであったと推測される。今回の検討において，目視法および自動カウント法ともにHER2-FISH検査で計測対象とする視野および細胞は，IHCでHER2蛋白発現がなるべく強い癌細胞領域を選択し，シグナルを計測するというルールのみであった。より判定結果を一致させるためには，目視法だけでなく，自動カウント法による計測を行う上でも，どのような視野や癌細胞を自動カウントする際に選択するのか，観察者間での目合わせや詳細なルール設定を含む内部精度管理体制の構築が重要であると考えられる。
目視法による他の問題点として，測定した細胞の後の検証が困難であることが挙げられる。一方で自動カウント法では，測定した細胞は自動的に画像保存され，後に検証することが容易である。また，以前に我々は，組織型や固定条件など，種々の条件の異なる乳癌検体においても自動カウント法は可能であることを報告した8)。以上のことから，自動カウント法による判定は，精度管理の手段としても有用であり，HER2-FISH検査の精度向上に貢献できると思われる。
多くの乳癌症例では，同一の腫瘍内におけるHER2遺伝子増幅の形態は一致しているとの報告がある一方12)，一部の乳癌では同一の腫瘍内でもHER2遺伝子増幅形態に不均一性を示す症例も報告されている13)。今回の検討から，HER2遺伝子増幅形態に不均一性を示す症例，つまりHER2 copy数の多い癌細胞がごく少数の割合で混在してみられる症例に対しては，目視法では判定結果に不一致が生じやすく，自動カウントではNegativeと判定される傾向にあることが示唆された。HER2 copy数の多い癌細胞がごく少数でも存在していれば，それらの癌細胞のみを対象細胞とし，Positiveと判定すべきとの意見も存在する。現在，HER2 copy数の多い癌細胞がごく少数の割合で混在している症例に対する抗HER2治療薬の有効性に関しての一定の見解は得られておらず14)，今後これらの症例に対する抗HER2治療薬の有効性に関する詳細な研究が望まれる。現状ではHER2-FISH検査の精度管理上，客観性や再現性の高い結果を得るためには目視法では限界があり，自動カウント法による判定が有用であるといえる。しかし，患者の治療方針は，最終的には臨床医と患者の間で決められる。その観点から，HER2 copy数の多い癌細胞がごく少数の割合で混在していることも，HER2-FISH検査から得られる重要な所見である。HER2-FISH検査の判定結果としては第一に，再現性および客観性の高い自動カウント法による判定結果を優先するが，IHCによりHER2タンパク2+と判定され，かつ染色性が不均一性を示す症例においては，自動カウント法だけではなく，目視法も併用してHER2-FISH検査は実施する必要がある。目視法で平均HER2 copy数が6.0以上あるいはHER2/CEP17比が2.0以上となる腫瘍細胞が少数存在することが確認できた症例では，自動カウント法によりNegativeと判定された場合でも，判定結果に問題がないかを病理医を含む複数の観察者で十分に協議することは不可欠である。さらに，協議の上Negativeと判定する際も，通常のNegativeと同じ報告ではなく，「平均HER2 copy数が6.0以上あるいはHER2/CEP17比が2.0以上となる腫瘍細胞が少数存在する」ことを報告書に記載し，臨床医や患者に，HER2-FISH検査結果を正確に伝えることが重要であると考える。
HER2-FISH検査における自動カウント法は，多数の視野および細胞を測定することが可能で，目視法と比較すると客観性および再現性の高い結果が得られた。自動カウント法は精度管理の手段としても有用であり，HER2-FISH検査の精度向上に貢献できると思われる。
本研究は，名古屋第二赤十字病院治験・臨床研究審査委員会の承認（整理番号：1252）を得て行った。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
