2021 Volume 70 Issue 3 Pages 423-432
抗酸菌症診療において，結核菌群と非結核性抗酸菌群の迅速かつ正確な鑑別の方法として，遺伝子検査が利用されている。簡便で迅速化を図る目的に，ミュータスワコーg1（和光純薬工業，PCR-CE法），TRCReady-80（東ソー，TRC法），GENECUBE（東洋紡，Qprobe法）と，当院で実施しているコバスTaqMan48（ロシュ・ダイアグノスティックス，TaqMan法）および培養法で比較検討を行った。前処理後の臨床検体94検体での一致率の算出，Mycobacterium aviumおよびM. intracelullareの菌株を用いて希釈系列を作製し，検出感度を算出した。TaqMan法との陽性／陰性一致率は，PCR-CE法70.8%/98.6%，TRC法95.8%/95.7%，Qprobe法87.5%/100.0%であった。培養法との陽性／陰性一致率は，PCR-CE法61.5%/98.5%，TRC法88.5%/97.1%，Qprobe法76.9%/100.0%であった。最小検出感度は，PCR-CE法2.0 × 10～1.1 × 103 CFU/mL，TRC法およびQprobe法2.0 × 10～1.1 × 102 CFU/mLであった。以上より，PCR-CE法，TRC法およびQprobe法は，簡便かつ短時間で結果が得られるため，肺MAC症の迅速診断に有用であり，各施設の需要やスタイルに合った遺伝子検出装置を選択することが重要であると考えられた。
In the treatment of Mycobacterium infection, gene analyses are carried out to distinguish Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria rapidly and accurately. To further investigate the simplicity and rapidity of mycobacterial testing, we compared three detection methods using fully automated genetic analyzers, namely, μTAS Wako g1 (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation; polymerase chain reaction-capillary electrophoresis [PCR-CE]), TRCReady-80 (Tosoh Corporation; transcription reverse-transcription concerted reaction [TRC]), and GENECUBE (Toyobo; quenching probe [Qprobe]), with our routine methods using the COBAS TaqMan 48 analyzer (Roche Diagnostics; TaqMan) and culture. We calculated the positive/negative agreement rates in 94 pretreated samples. We also calculated the detection sensitivity values using the dilution series of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. The positive/negative agreement rates of the three detection methods using TaqMan were as follows: PCR-CE, 70.8%/98.6%; TRC, 95.8%/95.7%; and Qprobe, 87.5%/100.0%. The positive/negative agreement rates of the three detection methods with culture were as follows: PCR-CE, 61.5%/98.5%; TRC, 88.5%/97.1%; and Qprobe, 76.9%/100.0%. The minimum detection sensitivity values were as follows: PCR-CE, 2.0 × 10 to 1.1 × 103 CFU/mL; and TRC and Qprobe, 2.0 × 10 to 1.1 × 102 CFU/mL for both. In conclusion, three detection methods using fully automated genetic analyzers are useful for the simple and rapid detection of Mycobacterium avium complex. Choosing analyzers suitable for each facility is important.
非結核性抗酸菌（nontuberculous mycobacteria; NTM）のうち，Mycobacterium avium（MAV）および，M. intracellulare（MIN）から構成されるMycobacterium avium complex（MAC）が肺NTM症の起因菌の80%以上を占めている1)。肺MAC症はクラリスロマイシン，リファンピシン，エタンブトールの3剤による多剤併用の化学療法が治療の基本であるが，近年クラリスロマイシン耐性のMACが出現し，治療抵抗性に進行する肺MAC症への対処が問題となっている2)～4)。
抗酸菌の検出に対して最も感度が高いとされる培養検査は，結果確定までに数週間かかるため，迅速性に欠けてしまう5)。また塗抹検査は安価で，迅速性，簡便性に優れており排菌量を把握できる反面，培養検査よりも感度に劣り，結核菌とNTMの鑑別ができない6)。そのため，現在では比較的短時間でこれらの菌を検出できる核酸検出検査が有用とされている。当院においてもリアルタイムPCR法を測定原理としたコバスTaqMan48（ロシュ・ダイアグノスティックス，TaqMan法）を採用しているが，操作性が煩雑であり，核酸検出までに時間を要するなどの課題があった。
今回我々はTaqMan法と培養法を標準とし，ミュータスワコーg1（和光純薬工業，PCR-CE法），TRCReady-80（東ソー，TRC法），およびGENECUBE（東洋紡，Qprobe法）を用いて検出性能および測定時間の比較検討を行ったので報告する。
今回使用する4機種での測定は，試薬添付文書に従い下記の検討を行った。
1． 対象当院において，2019年8月から10月の間に提出されたMAC核酸検出検査依頼があった臨床検体85検体およびTaqMan法にてMAVまたはMIN陽性となり，−40℃で凍結保存していた臨床検体9検体の計94検体を検討対象とした。検体の内訳は，喀痰61件，気管内分泌物1件，気管支肺胞洗浄液10件，胸水8件，組織8件，骨髄2件，胃液2件，尿1件，透析液1件である。なお，本検討は倉敷中央病院倫理委員会の承認（承認番号：3532号）を得て実施した。
2． 方法 1） 検体の前処理喀痰，気管内分泌物は，タンパク分解酵素セミアルカリプロテアーゼの喀痰溶解酵素スプタザイム（極東製薬工業）を用いて均質化した後，3,000 rpmで15分遠心した。液状検体は，3,000 rpmで15分遠心した。また血液が大量に混入した検体は，核酸増幅反応の阻害を防ぐために，滅菌精製水を用いて溶血処理を実施し，3,000 rpmで15分遠心した。遠心後に上清を除去した沈渣をN-Acetyl-L-Cysteine（NALC）-NaOH処理用の検体とした。抗酸菌核酸検出検査およびMGIT法は，NALC-NaOH処理した検体を使用した。NALC-NaOH法はBD MycoPrep（日本BD）を用い，MGIT法はPANTA（日本BD）を添加したミジット分離培養剤（日本BD）を用いて処理をした。
2） 抗酸菌核酸検出検査 ① TaqMan法NALC-NaOH処理済み検体100 μLを，タックマンマイコ用検体前処理試薬添加剤セット「SOL-M」（島津製作所），アンプリコアマイコバクテリウム検体前処理試薬セットII（ロシュ・ダイアグノスティックス）にて核酸抽出を実施した。核酸抽出液は，コバスTaqMan MAI（ロシュ・ダイアグノスティックス）を使用し，コバスTaqMan48を用いて核酸増幅および検出を行った。
② PCR-CE法NALC-NaOH処理済み検体200 μLを，抗酸菌前処理液（和光純薬工業）にて溶菌処理を実施した。溶菌処理済み液は，チップ核酸精製キット（和光純薬工業），ミュータスワコーMAC 試薬カートリッジ（和光純薬工業）を使用し，ミュータスワコーg1を用いて核酸抽出，核酸精製，核酸増幅および検出を行った。
③ TRC法NALC-NaOH処理済み検体200 μLを，EXTRAGEN ZR（東ソー）を用いて溶菌処理，核酸抽出を実施した。核酸抽出液は，TRCR核酸精製キット（東ソー），TRCReady MAC（東ソー）を使用し，TRCReady-80を用いて核酸精製，核酸増幅および検出を行った。
④ Qprobe法NALC-NaOH処理済み検体300 μLを，ジーンキューブ専用イージー・ビーズ（東洋紡），ジーンキューブ専用溶解液（東洋紡）にて核酸抽出を実施した。核酸抽出液は，ジーンキューブMAI（東洋紡）を使用し，GENECUBEを用いて核酸増幅および検出を行った。
3） 抗酸菌塗抹検査抗酸菌塗抹検査は，NALC-NaOH処理を施す前の沈渣をスライドガラスに10 μL塗布し，Ziehl-Neelsen染色を実施した。
4） 抗酸菌培養検査抗酸菌培養検査は液体培養MGIT法で行った。NALC-NaOH処理済検体の液体培地への接種量は500 μLとした。BACTEC MGIT960（日本BD）にて最長6週間培養し，陽性シグナルの出た検体については，培養液で塗抹標本を作製し，Ziehl-Neelsen染色で抗酸菌を確認したのち，2%小川培地（極東製薬）に培養液を接種し，36.5℃で培養した。
5） 同定検査MGIT法で検出し，2%小川培地に増菌させた菌株に対し，質量分析装置MALDI Biotyper（ブルカージャパン，Mycobacteria Library 3.1）を用いて同定検査を実施した。
6） 検出感度試験最小検出感度は，2%小川培地に発育したMAV 1株（No. 14）およびMIN 2株（No. 78, 80）の新鮮な菌株を使用し，PBSでMcFarland No. 0.5となるよう調整した菌液を測定原液とした。測定原液をPBSで10倍希釈し，希釈系列を作製した。希釈液中の菌量測定は7H11-C寒天培地（極東工業）を使用し，ミスラ法を用いて行った。
従来法であるTaqMan法とPCR-CE法，TRC法，およびQprobe法の陽性一致率（MAV一致率，MIN一致率，MAV + MIN一致率），陰性一致率および全一致率をそれぞれ求めた。
PCR-CE法は，陽性一致率70.8%（17/24）［MAV一致率91.7%（11/12），MIN一致率45.5%（5/11），MAV + MIN一致率100%（1/1）］，陰性一致率98.6%（69/70），全体一致率91.5%（86/94）であった（Table 1）。乖離が認められた検体は8件で，TaqMan法陽性／PCR-CE法陰性が6件，TaqMan法陰性／PCR-CE法陽性が1件，TaqMan法MIN陽性／PCR-CE法MAV + MIN陽性が1件であった（Table 2）。
| MAC | TaqMan法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| PCR-CE法 | MAV | 11 | 0 | 0 | 1 | 12 |
| MIN | 0 | 5 | 0 | 0 | 5 | |
| MAV + MIN | 0 | 1 | 1 | 0 | 2 | |
| 陰性 | 1 | 5 | 0 | 69 | 75 | |
| 計 | 12 | 11 | 1 | 70 | 94 | |
| 陽性一致率 | 70.8%（17/24） | |||||
| MAV一致率 | 91.7%（11/12） | |||||
| MIN一致率 | 45.5%（5/11） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 100.0%（1/1） | |||||
| 陰性一致率 | 98.6%（69/70） | |||||
| 全一致率 | 91.5%（86/94） | |||||
| MAC | TaqMan法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| TRC法 | MAV | 12 | 0 | 0 | 2 | 14 |
| MIN | 0 | 10 | 0 | 0 | 10 | |
| MAV + MIN | 0 | 1 | 1 | 1 | 3 | |
| 陰性 | 0 | 0 | 0 | 67 | 67 | |
| 計 | 12 | 11 | 1 | 70 | 94 | |
| 陽性一致率 | 95.8%（23/24） | |||||
| MAV一致率 | 100.0%（12/12） | |||||
| MIN一致率 | 90.9%（10/11） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 100.0%（1/1） | |||||
| 陰性一致率 | 95.7%（67/70） | |||||
| 全一致率 | 95.7%（90/94） | |||||
| MAC | TaqMan法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | |||
| Qprobe法 | MAV | 11 | 0 | 0 | 0 | 11 |
| MIN | 0 | 9 | 0 | 0 | 9 | |
| MAV + MIN | 0 | 1 | 1 | 0 | 2 | |
| 陰性 | 1 | 1 | 0 | 70 | 72 | |
| 計 | 12 | 11 | 1 | 70 | 94 | |
| 陽性一致率 | 87.5%（21/24） | |||||
| MAV一致率 | 91.7%（11/12） | |||||
| MIN一致率 | 81.8%（9/11） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 100.0%（1/1） | |||||
| 陰性一致率 | 100.0%（70/70） | |||||
| 全一致率 | 96.8%（91/94） | |||||
MAV：M. avium MIN：M. intracellulare
| MAC乖離検体 | 検体 | 塗抹 | TaqMan法 | PCR-CE法 | TRC法 | Qprobe法 | 培養 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 喀痰 | − | ― | ― | MAV + MIN | ― | ― |
| 2 | 胃液 | − | MIN | MAV + MIN | MAV + MIN | MAV + MIN | MIN（6日目MGIT） |
| 3 | 喀痰 | − | ― | ― | MAV | ― | ― |
| 4*1 | 喀痰 | − | ― | MAV | ― | ― | ― |
| 5 | 喀痰 | − | ― | ― | MAV | ― | MAV（12日目MGIT） |
| 6 | 喀痰 | − | ― | ― | ― | ― | MIN（16日目MGIT） |
| 7 | 喀痰 | − | MIN | ― | MIN | MIN | MIN（6日目MGIT） |
| 8 | 喀痰 | − | MIN | ― | MIN | MIN | MIN（5日目MGIT） |
| 9 | 胃液 | − | MIN | ― | MIN | ― | MIN（6日目MGIT） |
| 10 | 喀痰 | − | MIN | ― | MIN | MIN | MIN（10日目MGIT） |
| 11 | 気管支洗浄液 | ± | MAV | MAV | MAV | ― | MAV（9日目MGIT） |
| 12 | 喀痰 | ± | MAV + MIN | MAV + MIN | MAV + MIN | MAV + MIN | MAV（5日目MGIT） |
| 13 | 喀痰 | 1+ | MIN | ― | MIN | MIN | MIN（14日目MGIT） |
| 14 | 気管支洗浄液 | 2+ | MAV | ― | MAV | MAV | MAV（8日目MGIT） |
MAV：M. avium MIN：M. intracellulare
*1 MAC治療症例
TRC法は，陽性一致率95.8%（23/24）［MAV一致率100.0%（12/12），MIN一致率90.9%（10/11），MAV + MIN一致率100.0（1/1）］，陰性一致率95.7%（67/70），全体一致率95.7%（90/94）であった（Table 1）。乖離が認められた検体は4件で，TaqMan法陰性／TRC法陽性は3件，TaqMan法MIN陽性／TRC法MAV + MIN陽性が1件であった（Table 2）。
Qprobe法は，陽性一致率87.5%（21/24）［MAV一致率：91.7%（11/12），MIN一致率：81.8%（9/11），MAV + MIN一致率：100%（1/1）］，陰性一致率100.0%（70/70），全体一致率96.8%（91/94）であった（Table 1）。乖離が認められた検体は3件で，TaqMan法陽性／Qprobe法陰性が2件，TaqMan法MIN陽性／Qprobe法MAV + MIN陽性が1件であった（Table 2）。
2． 培養法との比較培養結果を標準とし，TaqMan法，PCR-CE法，TRC法およびQprobe法の陽性一致率（MAV一致率，MIN一致率），陰性一致率および全一致率をそれぞれ求めた。また各種全自動遺伝子検出法と培養法で乖離を認めた検体のうち，培養法が陰性であった検体全例に対して，6週間の培養が終了したMGITチューブ内の培養液をTaqMan法にて測定を行ったが全て陰性であった。
TaqMan法は陽性一致率88.5%（23/26）［MAV一致率85.7%（12/14），MIN一致率91.7（11/12）］，陰性一致率100.0%（68/68），全体一致率96.8%（91/94）であった（Table 3）。乖離が認められた検体は3件で，TaqMan法陰性／培養法陽性が2件，TaqMan法MAV + MIN陽性／培養法MAV陽性が1件であった（Table 2）。
| MAC | 培養法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| TaqMan法 | MAV | 12 | 0 | 0 | 0 | 12 |
| MIN | 0 | 11 | 0 | 0 | 11 | |
| MAV + MIN | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| 陰性 | 1 | 1 | 0 | 68 | 70 | |
| 計 | 14 | 12 | 0 | 68 | 94 | |
| 陽性一致率 | 88.5%（23/26） | |||||
| MAV一致率 | 85.7%（12/14） | |||||
| MIN一致率 | 91.7%（11/12） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 0.0%（0/0） | |||||
| 陰性一致率 | 100.0%（68/68） | |||||
| 全一致率 | 96.8%（91/94） | |||||
| MAC | 培養法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| PCR-CE法 | MAV | 11 | 0 | 0 | 1 | 12 |
| MIV | 0 | 5 | 0 | 0 | 5 | |
| MAV + MIN | 1 | 1 | 0 | 0 | 2 | |
| 陰性 | 2 | 6 | 0 | 67 | 75 | |
| 計 | 14 | 12 | 0 | 68 | 94 | |
| 陽性一致率 | 61.5%（16/26） | |||||
| MAV一致率 | 78.6%（11/14） | |||||
| MIN一致率 | 41.7%（5/12） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 0.0%（0/0） | |||||
| 陰性一致率 | 98.5%（67/68） | |||||
| 全一致率 | 88.3%（83/94） | |||||
| MAC | 培養法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| TRC法 | MAV | 13 | 0 | 0 | 1 | 14 |
| MIN | 0 | 10 | 0 | 0 | 10 | |
| MAV + MIN | 1 | 1 | 0 | 1 | 3 | |
| 陰性 | 0 | 1 | 0 | 66 | 67 | |
| 計 | 14 | 12 | 0 | 68 | 94 | |
| 陽性一致率 | 88.5%（23/26） | |||||
| MAV一致率 | 92.9%（13/14） | |||||
| MIN一致率 | 83.3%（10/12） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 0.0%（0/0） | |||||
| 陰性一致率 | 97.1%（66/68） | |||||
| 全一致率 | 94.7%（89/94） | |||||
| MAC | 培養法 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | MAV + MIN | 陰性 | 計 | ||
| Qprobe法 | MAV | 11 | 0 | 0 | 0 | 11 |
| MIN | 0 | 9 | 0 | 0 | 9 | |
| MAV + MIN | 1 | 1 | 0 | 0 | 2 | |
| 陰性 | 2 | 2 | 0 | 68 | 72 | |
| 計 | 14 | 12 | 0 | 68 | 94 | |
| 陽性一致率 | 76.9%（20/26） | |||||
| MAV一致率 | 78.6%（11/14） | |||||
| MIN一致率 | 75.0%（9/12） | |||||
| MAV + MIN一致率 | 0.0%（0/0） | |||||
| 陰性一致率 | 100.0%（68/68） | |||||
| 全一致率 | 93.6%（88/94） | |||||
MAV：M. avium MIN：M. intracellulare
PCR-CE法は陽性一致率61.5%（16/26）［MAV一致率78.6%（11/14），MIN一致率41.7（5/12）］，陰性一致率98.5%（67/68），全体一致率88.3%（83/94）であった（Table 3）。乖離が認められた検体は11件で，培養法陽性／PCR-CE法陰性が8件，培養法陰性／PCR-CE法陽性が1件，PCR-CE法MAV + MIN陽性／培養法MAVもしくはMINが陽性を示したものがそれぞれ1件ずつであった（Table 2）。
TRC法は陽性一致率88.5%（23/26）［MAV一致率92.9%（13/14），MIN一致率83.3%（10/12）］，陰性一致率97.1%（66/68），全体一致率94.7%（89/94）であった（Table 3）。乖離が認められた検体は5件で，培養法陽性／TRC法陰性が1件，培養法陰性／TRC法陽性が2件，TRC法MAV + MIN陽性／培養法MAVもしくはMINが陽性を示したものがそれぞれ1件ずつであった（Table 2）。
Qprobe法は陽性一致率76.9%（20/26）［MAV一致率78.6%（11/14），MIN一致率75.0%（9/12）］，陰性一致率100.0%（68/68），全体一致率93.6%（88/94）であった（Table 3）。乖離が認められた検体は6件で，培養法陽性／Qprobe法陰性が4件，Qprobe法MAV + MIN陽性／培養法MAVもしくはMINが陽性を示したものがそれぞれ1件ずつであった（Table 2）。
また，培養法MAVもしくはMINが陽性となった26検体を塗抹陽性，陰性に区分した場合の陽性一致率（MAV一致率，MIN一致率）を求めた。塗抹陽性検体は12件（MAV 7件，MIN 5件）で，TaqMan法およびTRC法は12件全て陽性となり，陽性一致率は100%（12/12）［MAV一致率100.0%（7/7），MIN一致率100.0%（5/5）］であった（Table 4）。PCR-CE法は10件陽性となり，陽性一致率は83.3%（10/12）［MAV一致率85.7%（6/7），MIN一致率80.0%（4/5）］（Table 4），Qprobe法は11件陽性となり，陽性一致率は91.7%（11/12）［MAV一致率85.7%（6/7），MIN一致率100.0%（5/5）］であった（Table 4）。
| 塗抹陽性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| TaqMan法 | MAV | 7 | 0 | 0 | 7 |
| MIN | 0 | 5 | 0 | 5 | |
| 陰性 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 計 | 7 | 5 | 0 | 12 | |
| 陽性一致率 | 100.0%（12/12） | ||||
| MAV一致率 | 100.0%（7/7） | ||||
| MIN一致率 | 100.0%（5/5） | ||||
| 塗抹陽性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| PCR-CE法 | MAV | 6 | 0 | 0 | 6 |
| MIN | 0 | 4 | 0 | 4 | |
| 陰性 | 1 | 1 | 0 | 2 | |
| 計 | 7 | 5 | 0 | 12 | |
| 陽性一致率 | 83.3%（10/12） | ||||
| MAV一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| MIN一致率 | 80.0%（4/5） | ||||
| 塗抹陽性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| TRC法 | MAV | 7 | 0 | 0 | 7 |
| MIN | 0 | 5 | 0 | 5 | |
| 陰性 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 計 | 7 | 5 | 0 | 12 | |
| 陽性一致率 | 100.0%（12/12） | ||||
| MAV一致率 | 100.0%（7/7） | ||||
| MIN一致率 | 100.0%（5/5） | ||||
| 塗抹陽性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| Qprobe法 | MAV | 6 | 0 | 0 | 6 |
| MIN | 0 | 5 | 0 | 5 | |
| 陰性 | 1 | 0 | 0 | 1 | |
| 計 | 7 | 5 | 0 | 12 | |
| 陽性一致率 | 91.7%（11/12） | ||||
| MAV一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| MIN一致率 | 100.0%（5/5） | ||||
MAV：M. avium MIN：M. intracellulare
一方，塗抹陰性検体は14件（MAV 7件，MIN 7件）で，TaqMan法は12件陽性となり，陽性一致率は85.7%（12/14）［MAV一致率85.7%（6/7），MIN一致率85.7%（6/7）］であった（Table 5）。PCR-CE法は8件陽性となり，陽性一致率は57.1%（8/14）［MAV一致率85.7%（6/7），MIN一致率28.6%（2/7）］であった（Table 5）。TRC法は13件陽性となり，陽性一致率は92.9%（13/14）［MAV一致率100.0%（7/7），MIN一致率85.7%（6/7）］であった（Table 5）。Qprobe法は11件陽性となり，陽性一致率は78.6%（11/14）［MAV一致率85.7%（6/7），MIN一致率71.4%（5/7）］であった（Table 5）。
| 塗抹陰性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| TaqMan法 | MAV | 6 | 0 | 0 | 6 |
| MIN | 0 | 6 | 0 | 6 | |
| 陰性 | 1 | 1 | 0 | 2 | |
| 計 | 7 | 7 | 0 | 14 | |
| 陽性一致率 | 85.7%（12/14） | ||||
| MAV一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| MIN一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| 塗抹陰性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| PCR-CE法 | MAV | 6 | 0 | 0 | 6 |
| MIN | 0 | 2 | 0 | 2 | |
| 陰性 | 1 | 5 | 0 | 6 | |
| 計 | 7 | 7 | 0 | 14 | |
| 陽性一致率 | 57.1%（8/14） | ||||
| MAV一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| MIN一致率 | 28.6%（2/7） | ||||
| 塗抹陰性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| TRC法 | MAV | 7 | 0 | 0 | 7 |
| MIN | 0 | 6 | 0 | 6 | |
| 陰性 | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 計 | 7 | 7 | 0 | 14 | |
| 陽性一致率 | 92.9%（13/14） | ||||
| MAV一致率 | 100.0%（7/7） | ||||
| MIN一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| 塗抹陰性 | 培養法 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| MAV | MIN | 陰性 | 計 | ||
| Qprobe法 | MAV | 6 | 0 | 0 | 6 |
| MIN | 0 | 5 | 0 | 5 | |
| 陰性 | 1 | 2 | 0 | 3 | |
| 計 | 7 | 7 | 0 | 14 | |
| 陽性一致率 | 78.6%（11/14） | ||||
| MAV一致率 | 85.7%（6/7） | ||||
| MIN一致率 | 71.4%（5/7） | ||||
MAV：M. avium MIN：M. intracellulare
同一患者より採取された検体で，結果の乖離が生じたNo. 1～3（Table 2）のTRC法の増幅曲線（蛍光強度のピーク値，増幅曲線の立ち上がり時間）に注目した（Figure 1）。
No. 1はMAVがMINより優位となったが，No. 2はMINがMAVより優位となった。No. 3はMAVのみ陽性となり，MINは閾値を超えず陰性であった。培養法では，No. 1とNo. 3は陰性，No. 2はMINの発育を認めた。
B：MIN G：MAV
No. 1は，MAV（約13 × 1,000，5分15秒），MIN（約9 × 1,000，7分57秒）となり，蛍光強度のピーク値，増幅曲線の立ち上がり時間の早さともにMAVが優位であった。
No. 2は，MAV（約7.5 × 1,000，11分07秒），MIN（約20 × 1,000，2分58秒）となり，蛍光強度のピーク値，増幅曲線の立ち上がり時間の早さともにMINが優位であった。
No. 3は，MAV（約8 × 1,000，11分18秒）とわずかにMAVの閾値を超えたが，MINは陰性であった。
4． 検出感度の比較最小検出感度試験の結果は，TaqMan法が1.1 × 102～1.0 × 103 CFU/mL，PCR-CE法が2.0 × 10～1.1 × 103 CFU/mL，TRC法とQprobe法が，2.0 × 10～1.1 × 102 CFU/mLであった（Table 6）。
| 生菌数 | M. avium 1.1 × 108（CFU/mL） |
M. intracellulare 2.0 × 107（CFU/mL） |
M. intracellulare 1.0 × 108（CFU/mL） |
|||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 希釈倍数 | TaqMan 法 |
PCR-CE 法 |
TRC 法 |
Qprobe 法 |
TaqMan 法 |
PCR-CE 法 |
TRC 法 |
Qprobe 法 |
TaqMan 法 |
PCR-CE 法 |
TRC 法 |
Qprobe 法 |
| 1.0 × 104 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 1.0 × 105 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 1.0 × 106 | + | − | + | + | − | + | + | + | − | + | + | + |
| 1.0 × 107 | − | − | − | − | − | − | − | − | − | − | − | − |
| 検出感度（CFU/mL） | 1.1 × 102 | 1.1 × 103 | 1.1 × 102 | 1.1 × 102 | 2.0 × 102 | 2.0 × 10 | 2.0 × 10 | 2.0 × 10 | 1.0 × 103 | 1.0 × 102 | 1.0 × 102 | 1.0 × 102 |
NALC-NaOH処理後の検体から測定結果が出るまでに要する時間は，TaqMan法が約210分（溶菌・核酸抽出60分，核酸増幅・検出150分）であったのに対し，PCR-CE法が約50分（溶菌約5分，核酸抽出・精製・増幅・検出45分），TRC法が約50分（溶菌・核酸抽出10分，核酸精製・増幅・検出40分），Qprobe法が約45分（溶菌・核酸抽出15分，核酸増幅・検出30分）であった（Figure 2）。
NALC-NaOH処理済みの検体を溶菌処理から核酸検出までに要する時間を模式図にした。
臨床検体を用いたMAC検出性能比較検討のうち，TaqMan法との比較において，MAV，MIN共にほぼ同等の検出性能を有していたのはTRC法であり，PCR-CE法およびQprobe法はやや劣る結果となった。培養法との比較では，いずれの機器も培養法に対しては検出性能が劣るものの，TRC法およびQprobe法は80%以上の一致率を認めた。培養法を標準としたTaqMan法とTRC法の検出感度比較を行った小野原ら7)や，TaqMan法とQprobe法の検出感度比較を行った寺岡ら8)の報告と比較すると，検体数の違いはあるものの，わずかに一致率が低い結果となった。PCR-CE法とTaqMan法の検出感度を比較した寺嶌ら9)の報告ではMAV一致率96.9%，MIN一致率98.1%に対し，本検討ではMAV一致率91.7%，MIN一致率45.5%とMIN陽性一致率が大幅に下回った。
PCR-CE法とTRC法およびQprobe法に検出性能の差が生じた原因として，検出感度の差，プライマーおよびプローブの違い，溶菌処理方法の違いなどが考えられた。しかしながら，MAV，MIN両菌種の最小検出感度の比較では，遺伝子検出装置間における差異は認められなかった。臨床検体を用いた評価にてMINの検出感度が低かったPCR-CE法も，最小検出感度はTaqMan法と同等であった。寺嶌ら9)もPCR-CE法の検出感度は750コピー/mLで，MACの低排菌量の検体にも対応可能であると報告している。一方で，溶菌処理は3法ともビーズを用いた菌体破砕方法を採用しており，加えてTRC法とQprobe法は菌の不活化のために熱処理（TRC法：75℃，5分，Qprobe法：80℃，10分）も施している。熱処理を施すことによって，細菌の細胞壁や細胞膜が熱損傷をおこし，核酸抽出の精度が向上した可能性が考えられた。
また，結果の乖離を認めた14検体全てにおいて，PCR-CE法，TRC法の内部コントロールは陽性となり，増幅反応阻害は認められなかった。Qprobe法は内部コントロール（IC）の測定がないため，増幅阻害の有無を確認することはできなかった。
乖離が認められた検体のうち，No. 1～10（Table 2）は塗抹陰性であったことから検体中の菌量が少ない検体であったと考えられた。そのうちNo. 4（Table 2）はMAC症の治療中である患者から採取された喀痰であり，検体中に少量の死菌が偏在的に存在しており，そのためPCR-CE法のみで陽性を示したものと考えられた。No. 11（Table 2）は塗抹陽性（±）であったが，4機種全てにおいて二重測定を実施したところ，TRC法のみが2回とも陽性，TaqMan法，PCR-CE法は1回のみ陽性，Qprobe法は2回とも陰性を示した。原因としては，塗抹で陽性となったが，検体中に存在する菌量は少量であったため，各種全自動遺伝子検出法の検出感度の差が生じた可能性が考えられた。
3機種のいずれかにMAV + MIN陽性を示したNo. 1, 2, 12（Table 2）のうち，同一患者から採取されたNo. 1, 2は，No. 2のみ培養法にてMINの発育が認められた。後日採取された検体（No. 3）ではTRC法でのみMAV陽性となり培養法は陰性であった。No. 1～3のTRC法の増幅曲線に注目したところNo. 2, 3のMAVの増幅曲線はいずれもMAVの閾値をわずかに超える程度であった（Figure 2）。No. 2のPCR-CE法およびQprobe法も同様に，MAVの増幅曲線は閾値をわずかに超える程度であり，PCR-CE法，TRC法およびQprobe法の3法においてMAVの偽陽性反応が起きた可能性が考えられた。しかしながら，No. 1のMAVの蛍光強度のピーク値は約13 × 1,000であり，同程度のピーク値を認めた検体が7検体存在し，平均培養日数は7.7 ± 3.6日と早期に培養陽性反応を認めていた。そのため培養法で発育の認められなかったNo. 1は，MAVの死菌あるいは偽陽性反応の可能性も考えられた。
肺非結核性抗酸菌症診断基準の中の細菌学的基準に，「2回以上の異なった喀痰検体での培養陽性」が項目として定められており，胃液等の消化管液に常在している可能性の高い非結核性抗酸菌は診断における有用性の確証はされておらず，2回以上の異なった検体における培養陽性を満たすべきであると記載されている10)。そのためNo. 1～3の患者はNTM症の診断基準には該当しない。さらにこの患者は後日T-SPOT陽性となり結核性胸膜炎と診断され，MACを標的とした治療は行われなかった。肺非結核性抗酸菌症診断に関する指針では，検体からの直接核酸検出法陽性は有用であるが，培養陽性の代わりにはならないとされている10)。そのため肺MAC症の既往がなく，培養で発育のみられなかった核酸検出検査陽性検体は，検体の再提出を臨床側に依頼し，再評価を行うなど慎重に判断していく必要がある。
今回，当院で採用しているTaqMan法および培養法との比較検討において，同等の同定性能を示したのはTRC法とQprobe法であった。また，検査の所要時間や手技の面に関しては，TaqMan法に比べPCR-CE法，TRC法およびQprobe法は，溶菌処理から核酸検出までの時間がいずれも最短で60分を切り，さらに操作工程の減少，単純化により業務量の減少や人為的なミス，核酸の劣化，損失などを軽減することが期待される。1回あたりの最大の検体処理数は，PCR-CE法が4検体，TRC法とQprobe法が8検体といずれもTaqMan法の48検体には及ばないものの，迅速性で検体処理数を賄うことが可能である。いずれの機器においてもMAC検出に有用であり，さらに機器の選定に際しては，各施設での需要とスタイルに合ったものを選択することが重要であると考えられた。
PCR-CE法，TRC法およびQprobe法はいずれも簡便で迅速にMAC 核酸検出検査を実施することができ，機器の1回あたりの最大検体処理数や，施設の需要やスタイルを考慮した上で，機器の選定を行うことが重要である。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
