2022 Volume 71 Issue 1 Pages 10-19
病理標本の適正保管は，がんゲノム医療や臨床治験など継続的な患者治療において重要な課題である。通常，薄切後のパラフィンブロックは薄切面に薄くパラフィンを塗布し，組織を損傷・酸化から保護している（以下：ブロックカバー）。しかし，組織の再利用は，切削による標本の浪費が必至である。今回，新たに水溶性パラフィンを利用した，荒削り不要なブロックカバー法を検討した。材料は扁桃や肺，マルチプルコントロールのパラフィン包埋ブロックを用い，水溶性パラフィン（新法：以下HPC法）と従来のパラフィンカバーと未処理で比較した。室温暗所保管後1，3，6か月，3年後に薄切とカバーを行った。HPC法のパラフィン除去は流水水洗と氷上静置，従来法はミクロトームで荒削り後に切片を作製しHE染色と免疫組織化学染色で影響を評価した。ブロックカバーの有無は，免疫組織化学染色に影響を与える重要な因子であることが明らかとなった。水溶性パラフィンは傷，酸化等から組織を保護した。水溶性パラフィンの除去は流水5～10分あるいは氷上30分で可能，染色性は6か月後まで安定であるが，3年後にMIB-1染色減弱とDIN値漸減が生じた。水溶性パラフィンの繰り返し利用は，吸水により効果を失うと推測され，常に新調した試薬の使用が重要である。HPC法は簡便で，表面切削が来す組織損失が少なく，針生検の様な微小検体で特に有用である。従って，新たな組織保護方法として，保管条件などの検討を重ね日常業務に展開したい。
The appropriate storage of histopathological specimens is important for continuous patient care in various fields such as carcinoma genomic medicine. Usually, block surfaces after sectioning are thinly coated with paraffin for protection against damage and oxidation. However, some tissues are lost during cutting with repeated use of stored tissue blocks. In this study, we attempted to overcome this problem by using hydrosoluble paraffin. The specimens used were multiple control tissues and tissues from the tonsil and lung. In this investigation, we compared among specimens with hydrosoluble paraffin and conventional paraffin coating and without coating. Hydrosoluble paraffin was removed by washing with running water or immersion on an ice bath. The hydrosoluble paraffin protected tissues from cracking and oxidation. The time required to remove hydrosoluble paraffin was 5 min in running water and 30 min on an ice bath. HE-stained and immunostained specimens remained stable for six months. However, the attenuation of MIB-1 staining and decrease in DIN value occurred in tissue blocks stored for three years. The repeated use of tissue blocks induced tissue degeneration or water absorption, indicating the loss of the protective effect of hydrosoluble paraffin. Therefore, the use of a fresh reagent is important. Our novel method of covering tissue blocks using hydrosoluble paraffin is easy, and there is little tissue loss after a rapid surface cutting and repeated use of tissue blocks. In conclusion, the new tissue protection method is useful especially for very small specimens such as needle biopsy specimens.
近年，がんゲノム医療の展開には，病理組織標本の利用が不可欠であり，品質管理が重要視される。ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded; FFPE）ブロックは，作製後5年で遺伝子パネル解析の成功率が半減することが示されている1)。従来，薄切後のFFPEブロックの保管は，ブロック表面の傷などを考慮して，薄切表面に薄くパラフィンを塗布するブロックカバーを行うことが通例である2)～4)。ブロックカバーを施した標本は，再薄切時にカバー部分のパラフィンを切削し面出しを行うため，組織浪費が必至である。追加検索や外注検査などのために再薄切を行う場面があり，また，最近では，臨床治験や，がん遺伝子パネル検査などにより，未染標本の提出を求められる機会が増えている。そのため，薄切によるパラフィンブロックの浪費を最小限に抑制することは重要な課題である。そこで，我々は水溶性パラフィン（hydro soluble paraffin; HySoP：型番SCP-400S，株式会社システムクリエイト，大阪）を利用した荒削り不要なブロックカバー法（hydrosoluble paraffin cover；HPC法）を考案した。水溶性パラフィンカバーの有効性評価として，①荒削りが不要（作業効率の向上）となるか，②再薄切時の切削量が微減で，組織浪費の防止効果となるか，③ブロックカバーによる品質保持効果があるか，3点に着目し，有用性の検討を行ったので報告する。
材料は，病理組織診断終了後の残余検体で日常業務の精度管理目的で使用しているコントロール組織ブロックより，同一症例の作り置きがある扁桃組織3個，肺組織3個，肝組織6個，マルチプルコントロールブロックを1個使用した。方法は，扁桃組織3個，肺組織3個の組織ブロックについては，各組織ブロックを薄切後，HPC（新法），硬パラフィン（従来法），ブロックカバー無し（未処理）の3通りのブロックを作製し，室温，暗所で保管した。作製された各ブロックは，1，3，6か月後，3年後に面出しと薄切，ブロックカバーを繰り返し行った。50種の組織（舌，食道，唾液腺，扁桃，胃（胃噴門部，胃体部，胃幽門部），小腸（十二指腸，回腸），虫垂，大腸，皮膚，甲状腺，肺，心臓，脾臓，肝臓，胆のう，膵臓，腎臓，副腎，前立腺，精巣，子宮，卵巣，胎盤，臍帯，リンパ節，大脳，小脳，肺腺癌，肺扁平上皮癌，肺大細胞神経内分泌癌，食道癌，胃癌，大腸癌，皮膚扁平上皮癌，子宮内膜腺癌，子宮がん肉腫，卵巣漿液性腺癌，卵巣明細胞癌，腎癌，GIST，肝細胞癌，肝血管腫，膵癌，胸腺腫，乳癌，MFH，カルチノイド）を含むマルチプルコントロールは，同一条件で作製保管されたブロックを3つ揃えることが困難であることから，始めに従来法を行い，次にマルチプルコントロールブロックを再利用してHPC法で検討を行った。それぞれの保管期間は1か月とした。作業効率の検討方法として，各ブロックカバーごとに異なる面出し方法を行った。HPC法は，流水水洗10分と氷上静置30分，従来法は，ミクロトームで荒削り，未処理は，直接面合わせを行った。面合わせの完了したブロックはそれぞれ，整面後に薄切し4 μm切片を得た。組織浪費の防止効果の検討は，肝組織6個の包埋直後の厚さをノギスで測定し，平均値をstart pointとした。次に，荒削りして面出しを行い，3 μm，10枚を薄切した。2個ごとにブロックを従来のパラフィン，HySoPのカバーと未カバーで保管した。翌日，面出しを行い3 μm 10枚薄切し，ノギスでそれぞれのブロックの厚さを測定し，各保管方法で保存した。これを9回繰り返した。1，3，6か月，3年後に薄切された標本は，薄切後直ちにHE染色ならびに免疫組織化学染色を行い，染色所見の評価を実施した。免疫組織化学染色に使用した抗体と条件をTable 1に示す。検出試薬はi-viewを用いてBench Mark XT（Roche）により施行した。保管後3年経過した扁桃組織は，HPC法，従来法，未処理の4 μm薄切切片各1枚から，Qiagen FFPE preparation kitを用いて核酸抽出とDIN（DNA Integrity Number）測定を行った。
| Material | 1st antibody | antigen retrival | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| antibody (Clone name) | Dilution | Incubate time | Supplyer | Solution | Templature | Incubate time | |
| Tonsil | CD20 (L26) | RTU† | 16 min. | RD§ | CC1§ | 98°C | 40 min |
| Ki-67(MIB1) | ×200 | 16 min. | AT‡ | CC1§ | 98°C | 60 min | |
| Lung | TTF1 (SP141) | RTU | 16 min. | RD | CC1§ | 98°C | 60 min |
| NapsinA (MRQ-60) | RTU | 16 min. | RD | CC1§ | 98°C | 60 min | |
| Multiple control | Cytokeratin (AE1/AE3) | RTU | 16 min. | AT | Protease 1§ | 25°C | 16 min |
| α-SMA(1A4) | RTU | 12 min. | AT | CC1§ | 98°C | 60 min | |
| p63 (4A4) | RTU | 16 min. | RD | CC1§ | 98°C | 60 min | |
| Desmin (D33) | RTU | 16 min. | AT | No treatment | |||
†Redy to use; §Roche Diagnostics; ‡Agilent Technology
※DIN値：DIN（DNA Integrity Number）とはFFPE検体の核酸品質確認のために，ゲノムDNAの分解度を客観的に評価する指標で1～10のDIN値で表示するものである（1～10；1＝完全に分解された状態，10＝ほとんど分解していない状態）。
HySoPの特徴をTable 2に示した。溶融温度は，従来の硬パラフィンと同様，65℃前後で使用した。溶融した液化状態は無色透明で，水飴のような粘り気と硬さがある（Figure 1）。硬パラフィンと比較して，水への溶解性を持ち有機溶剤に溶けない。吸水性があり，吸湿したHPCでは，融点が低くなる傾向が認められ，過度の吸湿は粘り気のある軟性物質に変化し，形状変化が容易である。ブロックカバー後から固化するまで，常温で約5分を要した。また，カバー後（Figure 2）は硬パラフィンで包埋したパラフィンブロックと馴染み，カバーしたHySoPが外れることはない。
A melting point is 56°C and a melt product is a hyaline (A). The surface of a block is protected by swabbing of a paraffin (B). A paraffin cover is removed by running water (C) and on-ice placement (D) in 5 minutes and 30 minutes, respectively.
As compared with a conventional method (A), a block superficial observation is easy for a HPC method (C). The thickness of the paraffin 9 times after sectioning has little expenditure at a HPC method (D) more thickly than a conventional method (B).
HPCは，流水水洗と氷上静置いずれにおいても除去が可能であった。組織表面が完全に露出するまでに要した時間は，流水水洗では5分から10分，氷上静置では30分であった（Figure 1）。HPC法はブロックカバー部分を水で融解除去可能で，薄切の荒削り作業が不要で，面合わせから薄切が開始された。
2） 組織浪費防止9回薄切した肝組織パラフィンブロックのそれぞれの厚みの平均値について，start pointでは12,800 μmであり，9回目は，従来法8,200 μm，HPC 9,075 μm，未カバー8,875 μmであった。（Figure 2, 3）。HPC法は最も残存厚が多く切削量が軽微であった。
The difference of a conventional method and hydrosoluble paraffin is 875 micrometers after the 9th specimen treatment.
保存方法別によるブロック表面の肉眼的変化について，6か月までは時間経過による変化はどのカバー方法でも特に認められなかった。しかし，3年経過後のHPC法では，ブロック表面の水溶性パラフィンブロックに軟化が見られた。保管方法と経過時間におけるHE標本と免疫組織化学染色結果を（Table 3, 4, Figure 4, 5）に示す。染色性の評価は6か月まではHE染色標本，免疫組織化学染色標本ともに顕著な変化は認められなかった。しかし，3年経過した扁桃のKi-67抗体による免疫組織化学染色では，新法，未処理で陽性細胞数と発色色調の減弱が認められた。また，3年経過した扁桃の従来法，HPC法，未処理におけるDIN値はそれぞれ2.0，1.8，1.0であった（Figure 6）。
| Storage method | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Tonsil | Lung | ||||||
| A | B | C | A | B | C | ||
| Anti body | CD20 | + | + | + | ND† | ND | ND |
| TTF1 | ND | ND | ND | + | + | + | |
| Napsin A | ND | ND | ND | + | + | + | |
A: conventional paraffin; B: hydrosoluble paraffin; C: non-covered.
There is no change in the each methods. †ND: Not done
| antibody | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Cytokeratin (AE1/AE3) |
α-SMA | p63 | Desmin | ||||||
| A | B | A | B | A | B | A | B | ||
| tisuue | Tongue | − | − | − | − | − | − | − | − |
| Esophgus | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Salivary gland | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Tonsil | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Gastric pylorus | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Gastric body | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Gastric cardia | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Duodenum | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Ileum | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Appendix | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Colon | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Skin | + | + | + | + | + | + | − | − | |
| Thyroid | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Lung | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Heart | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Spleen | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Liver | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Gall bkadder | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Pancreas | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Adrenal gland | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Prostate | + | + | + | + | + | + | − | − | |
| Testes | − | − | + | + | − | − | − | − | |
| Uterus | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Ovary | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Placenta | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Umbilical cord | + | + | + | + | − | − | + | + | |
| Lymph node | + | + | + | + | − | − | − | − | |
| Cerebrum | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Cerebellum | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Lung adenocarcinoma | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Lung squamous cell carcinoma | + | + | − | − | + | + | − | − | |
| LCNEC | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Esophgus cancer | + | + | − | − | + | + | − | − | |
| Gastric cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Colon cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Skin scc | + | + | − | − | + | + | − | − | |
| Endometrial cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Uterus cancer sarcoma | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Serous adenocarcinoma | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Clear cell cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| RCC | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| GIST | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| HCC | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Hepatic angiosarcoma | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Panceatic cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Thymoma | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| Breast cancer | + | + | − | − | − | − | − | − | |
| MFH | − | − | − | − | − | − | − | − | |
| Carcinoid | + | + | − | − | − | − | − | − | |
A: conventional paraffin; B: hydrosoluble paraffin.
There is no change in the each methods.
The ingredient of a hydrosoluble paraffin does not observe an effect in the stained specimen of 3 years after.
The attenuation of MIB-1 staining 3 years after. The repeatedly utilize deteriorated or absorbed water the hydrosoluble paraffin, and lost the effect.
There is little difference by paraffin type. On the other hand, an non-covered DIN value is a half.
がんゲノム医療や臨床治験など，継続的な患者治療に利用される病理標本の適正保管と浪費軽減は，考慮すべき重要な課題である1)。標本作製後のパラフィンブロック表面の保護2)～4)は，標本管理の一つであるが，再利用の際に再度の面出し，すなわち，切削が必須であり，標本の浪費となる。免疫組織化学染色，臨床治験やがんゲノム医療など，繰り返し多くの未染標本の提供が求められる場合，標本の消失を経験する。この問題解決には，簡便で組織浪費が少なく，組織保存性に影響を与えない方法が望まれる。そこで，我々は水溶性パラフィンを利用した荒削り不要なブロックカバー法（HPC法）を考案し，有用性を検討した。水溶性パラフィンの検討報告は皆無で，全く未知の検討である。文字通り水に溶解性を示す点が大きな特徴である。従来使用してきた硬パラフィンと熱溶解性，粘度などは同等で作業上における不便は無い素材であることが明らかとなった。特に，水溶性の利点を生かし，流水あるいは氷上静置のみでブロックカバーを除去することが検証された。これにより，ブロックカバー後の検体を再薄切する際に，ブロック冷却中にブロックカバーが除去され，荒削り作業が全く不要となる。面合わせから薄切が開始され作業効率が向上し時間短縮に貢献するとともに，荒削りによる検体組織の損失を軽減することができる。特に，今回用いた生検大にした肺は，薄切による組織損失を最小限に抑えることができた。検討では従来法とHPC法による9回目の薄切後の差は875 μm単位の僅差であり，有効な数値であるか判定が難しいが，fine needle aspiration biopsyなど採取物が極小な検体をパネル検査や治験など，解析に十分な組織量を提供する必要がある検体で効果が期待される。一方，冷却器具を使用した場合の性能評価は不明である。
65℃程度の十分加温されたHPCを行うことで，塗布接触層の解離や境界面の気泡発生2)は認められず，パラフィン同士は十分親和しており，十分な機能を果たしていた。また，カバー融解後も肉眼的にブロック表面や組織への影響は認められない。FFPE切片は，薄切後の放置で免疫組織化学染色陽性細胞が低下することが知られている5)～8)。切り置いた切片で露出したリン脂質やタンパク，核酸が，フリーラジカルにより酸化変質し染色性が低下するとされており6)，HPCの実施は，フリーラジカルを回避する保存手段に有用であると考える。保存切片における免疫組織化学染色の検出率低下がKi-67，ER，CD4で報告されている5)～7)。抗体の種別によって結果が異なるWesterら7)の報告も同様である。
今回，品質保持効果として，一定の保管期間を経たブロックから薄切切片を作製し，HE染色，免疫組織化学染色による染色性の評価を行った。その結果，HE染色の色調とコントラスト，免疫組織化学染色の陽性強度，色調などの影響は認められなかった。しかし，3年経過後した扁桃の免疫組織化学染色Ki-67では，従来法の発現率は変化しなかったが，HPC法と未処理では色調低減と陽性細胞数低下が認められた。未処理は酸化などが原因と考えられる。HPC法は，長期間溶融放置したHySoPを使用していた。保管中に極度な蒸発が観察されHySoP成分の変化が原因として挙がり，毎回新調する点は大きな改善点である。また，HySoP成分の影響や保存期間中に空気中の水分を吸収し，検体が水分に曝露した可能性も示唆されるが，究明は今後の課題である。保存されたブロックを検討した報告は少ないが，Combsら8)の報告ではKi-67発現の検出は，4.5年で10%低下するが，ERおよびHER2の場合，平均10%の低下が直近の組織と比較して，それぞれ9.9年，8.5年後で比較的安定と報告している。Ehingerら9)は40年安定としている。Haragan10)らのPD-L1の検討においては，湿度と温度の上昇は，免疫反応性損失の有意な加速をもたらし，これは乾燥剤による貯蔵によって軽減されたと温度に加え湿度も重要な用件として報告されている。
核酸については，RNAに対する保存ブロックの悪影響が報告されており11)～13)，同様にNext Generation Sequencingに使用するDNAについても，バックグランド変異率が強く増加することやライブラリ収量が減少することが知られ14)，核酸の保護については保存温度の検討など別の検討が必要である15)。今回の検討では，それぞれの方法でカバーし，3年経過した扁桃のDIN値のみを測定した。従来法とHPC法のDIN値はそれぞれ2.0，1.8で大差はない。使用した組織はおよそ3か月程度中性緩衝ホルマリンに浸漬した残臓器でブロック作製後3年以上経過している標本であることでDIN値が低いものの，HySoPによる影響は顕著では無い。未処理はDIN値が1.0と半減し，酸化や乾燥による影響が示唆され，薄切後は表面にパラフィンを塗布するブロックカバーが重要である。HPCの長期保管においては，保管状況によってパラフィン自身が吸水する可能性があり，注意が必要である。なお，使用したHySoPは，工業材料のためsafty data sheetは入手できないが，廃棄方法はメーカーによると水を蒸発させてHySoPを再利用するかまたは，布などに溶けたHySoPを吸わせてからゴミとして廃棄することであった。今回は化学排水系の下水で多量の水道水を流し廃棄した。
ブロックカバーの有無は，免疫組織化学染色に影響を与える重要な因子であることが明らかとなった。HySoPを用いたHPC法は，作業時間の短縮と荒削りによる組織損失が生じない点が大きな利点である。肺や前立腺の針生検など，微小な検体には特に有用性が高い。また，本法は常に新しいHySoPを使用すること，湿度に注意して保管することを厳守することで保管性，染色性，DIN値への影響が少ない可能性がある。吸湿性の欠点克服が検討課題であるものの，新たな組織保護方法として日常業務への展開が期待される。
本論文の要旨は，第67回日本医学検査学会（2018年5月12，13日，浜松）で発表を行った。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
