2022 Volume 71 Issue 1 Pages 73-80
尿沈渣検査では，小型で球状を呈する尿細管上皮細胞（丸細胞）の検出数は少なく，尿沈渣検査法2010に記載が無いため現在の報告対象には含まれていない。既報によると丸細胞は末期腎不全患者に多く認められ，尿細管腔の修復に関与していることが示唆されている。また，丸細胞を多数認める症例では，血清クレアチニン値が上昇し透析導入に移行する症例が多く，そのため，丸細胞は血清クレアチニン値と同様に腎機能評価の新規指標となるバイオマーカーであることが示唆されている。しかし，健常者尿における丸細胞の出現に関する報告はない。そこで本研究では，尿沈渣検査における健常者尿中の丸細胞の出現の有無と形態および性状について明らかにすることを目的とした。対象は78検体とし，現病歴あるいは既往歴に腎疾患および高血圧症がある者は除外した。尿定性検査は，随時尿を使用し採取後直ちに実施した。丸細胞の出現の有無および算定は，無染色の標本を作製し尿沈渣検査法2010に準じて鏡検を行った。丸細胞はWF（whole field）で算定し，確認された丸細胞は顕微鏡写真を撮り記録した。記録した写真はImage Jを用いて画像測定を行った。本研究により，健常者尿において丸細胞の出現を認め，形態学的に均質状と顆粒状に大別することができた。形態により生存率が異なり，細胞質が均質状の丸細胞は生細胞である可能性が示唆された。
Round cells are a new type of renal tubular epithelial cell. The current Japanese “Examination of Urinary Sediment 2010” does not mention round cells, which were observed in this study. In our previous study, we found round cells in urinary samples collected from patients with end-stage renal disease, and their number was found to correlate with the severity of chronic kidney disease. However, their existence in samples from healthy donors has not been reported. The purpose of this study is to examine urinary samples for round cells in urinary sediment. Urinary samples were collected from 78 healthy donors. Urinary sediment was examined by a standard method in accordance with the 2010 GP1-P4 guideline. Round cells were counted in whole fields (WFs) under 100× magnification, and microscopy images were captured. Cell size was determined using Image J. In this study, we detected round cells in samples from healthy donors.The cytoplasm was of the homogeneous or granular-vacuum type. The average size of round cells was 15.38 ± 1.84 μm. The viability rate of cells with the homogeneous-type cytoplasm was higher than that of cells with the granular-vacuum-type cytoplasm. This study confirmed that living round cells can be detected in samples from healthy donors.
現在，尿沈渣検査において報告されている上皮細胞類には，扁平上皮細胞，尿路上皮細胞，尿細管上皮細胞，円柱上皮細胞がある。これらの上皮細胞の中でも尿細管上皮細胞は，様々な形態を示し，形態により出現意義が異なる1)。また，尿細管上皮細胞には基本的な形態の他に再生過程において出現することが報告されている反応性尿細管上皮細胞がある2)。しかし，本研究の対象細胞である丸細胞は，上記の尿細管上皮細胞の形態分類に含まれていない。
丸細胞は，明らかな球状を呈し赤血球や白血球より大型の尿細管上皮細胞である。しかし，尿中への出現数がわずかであるため，日常検査においては軽視されていた。Shukuyaら3)の報告によると，丸細胞は末期腎不全患者に多く認められ，免疫細胞化学染色で近位尿細管マーカーであるGGT-1，CD13に陽性を示し，未分化マーカーであるPAX2にも陽性を示すことから，障害された尿細管上皮細胞の再生に関連していることが示唆されている。また，丸細胞陽性検体を細胞培養すると陰性検体と比較して尿細管上皮細胞が良好に培養できることが確認されている3)。さらに，丸細胞が多く認められる症例では陰性群と比較して，1年以内に血清クレアチニン値が上昇し透析導入になる例が多く認められ，ROC曲線においても血清クレアチニン値と類似した予測指標となることが報告されている3)。このことから，丸細胞は腎機能を評価するための指標となる新規バイオマーカーであることが示唆されている3)。
しかし，丸細胞の形態学的特徴やその性状については明らかになっていない。また，健常者尿における丸細胞の出現に関する報告もないことから，尿沈渣検査において丸細胞の評価基準は定まっていないのが現状である。そこで本研究では，健常者尿における丸細胞の出現の有無を確認するとともに，形態学的特徴から丸細胞の形態を分類し，その性状を明らかにすることを目的とした。
対象者はインフォームドコンセントを行い，検体提供の承諾が得られた健常者103名（男性64名，女性39名，年齢20–65歳，平均22.3歳）とした。尿定性検査を実施後，腎疾患，高血圧，糖尿病などの疑いがある者は除外した。
2． 検討項目すべての検討における尿沈渣標本は，尿沈渣検査法2010に準じて作製し鏡検を行った4)。
1） 不適切検体の除去 ①尿定性検査・尿定量検査各項目で異常値のある検体を対象から除外するために尿定性検査を実施した。検体は随時尿を使用し，採取後直ちに尿定性検査を実施した。尿試験紙は栄研化学株式会社のウロペーパーIIIを用い，ウロビリノーゲン，蛋白質，ブドウ糖，pH，潜血，比重の6項目を測定した。また，尿試験紙で蛋白が1+以上となった検体については，富士フイルム和光純薬株式会社のマイクロTP-テスト（ピロガロールレッド法）を用いて定量を行った。
②月経周期月経周期後半（分泌期）にあたる女性検体では，採尿時に膣上皮細胞が脱落し，コンタミネーションを起こす可能性が高いことから除外対象とした5)。
2） 丸細胞の出現の有無の確認および算定丸細胞をWF（whole field）で算定し，確認された丸細胞は顕微鏡画像を撮影した。通常，上皮細胞類の算定はHPF（high power field）を用いるが，丸細胞は出現数が少数なことからWFで算定した。顕微鏡下で確認したすべての丸細胞は撮影後，複数の検者と撮影画像が丸細胞か否かの判定を行った後，3）および4）の検討を行った。丸細胞の判定基準は「細胞質辺縁は明瞭で厚みがあり球状を呈した20 μm以下の尿細管上皮細胞」とした。
3） 丸細胞の平均直径計測全検者が丸細胞と判定した画像を用いて各丸細胞の直径（μm）の測定し，平均直径を算出した。直径の計測には，アメリカ国立衛生研究所（NIH）が開発しインターネットで公開している画像処理フリーソフトImage Jを用いた。
4） 丸細胞の形態学的特徴観察各検体の無染色標本において，顕微鏡下で細胞質の形態学的特徴を均質状と顆粒状（封入体・空胞状）の2タイプに分類した。また，Sternheimer染色より細胞の染色性を観察した。さらに，無染色において丸細胞と鑑別が困難な場合がある深層型の扁平上皮細胞を鑑別する方法としてLugol染色を用いた。加えて，固定液による丸細胞の形態的変化を確認するため液体化検体細胞診（LBC法）であるThinPrep法を用いて標本を作製後，Papanicolaou染色を行った。
5） 丸細胞の生存性確認Trypan Blue染色を用いて丸細胞を染め分けることで，生細胞と死細胞の鑑別を行った。また，細胞質の性状の2タイプにおいて丸細胞の生存率を比較した。統計学的解析にはt検定を用いてp値が0.05未満の群間に有意差があるものとした。
検体提供時の尿定性検査において異常値となった検体は13検体であり，すべて尿蛋白のみが異常値であった。異常値としての判定基準は，尿試験紙法で1+以上かつピロガロールレッド法で30 mg/dL以上とした。また，採尿時のコンタミネーションが考えられる月経周期後半の検体は12検体であった。また，除外となった女性検体の中で両方の条件に当てはまった検体は無かった。
したがって，103名からこれら25名の検体を除いた78名の検体を対象として丸細胞に関する検討を実施した。
2） 丸細胞の出現の有無の確認および算定健常者尿において丸細胞は，78検体中66検体（85%）で認められた（Figure 1）。また，出現が認められた66検体の平均出現個数は1.7個 ± 0.7個（Mean ± 2SD）であった。
78検体中66検体（85%）で認められた。
画像解析可能であった丸細胞60個の画像を，Image Jを用いて測定した。その結果，丸細胞の平均直径は15.38 ± 1.84 μm（Mean ± 2SD）であった。
4） 丸細胞の形態学的特徴観察 ①無染色丸細胞の細胞質辺縁は明瞭で厚みがあり，細胞質色調は灰色調を呈した。細胞質の構造から均質状と顆粒状（封入体・空胞状）の2タイプに大別することができた（Figure 2）。均質状の丸細胞は細胞質表面構造が均質であり（Figure 2A–C），顆粒状の丸細胞は，細胞質表面に微細な顆粒や封入体（Figure 2D–F），空胞（Figure 2G–I）が認められた。解析可能であった丸細胞60個のうち，均質状は6個（10%），顆粒状は54個（90%）出現が認められた。顆粒状のなかでも封入体・空胞状の割合は25.9%であった。また，集塊状に出現する形態や硝子円柱内に封入されている丸細胞も確認された（Figure 3）。
A–C：均質状；D–F：顆粒状；G–I：空胞状
A：集塊状に出現する丸細胞；B：硝子円柱内に封入されている丸細胞
丸細胞をSternheimer染色後に観察した結果，染色陰性の細胞と染色陽性の細胞が確認された（Figure 4）。染色陽性となった丸細胞は，核が青色調，細胞質が桃～赤紫色調に染色され，上皮細胞類と同等の染色性を示した（Figure 4B, C）。
A：染色陰性の丸細胞；B，C：染色陽性の丸細胞
無染色標本において観察時に，丸細胞と深層型の扁平上皮細胞は鑑別が困難な場合があった（Figure 5A, B）。そこで，これらの細胞の鑑別確認を行うためLugol染色を行った。染色結果をFigure 5C, Dに示す。丸細胞は淡黄色に染色され，深層型の扁平上皮細胞は茶褐色に染色された。また，丸細胞は鋸歯状の尿細管上皮細胞と同等の染色結果を示した（Figure 5C–E）。
A，B：無染色；C–E：Lugol染色
A：丸細胞；B：深層型の扁平上皮細胞；C：丸細胞；D：深層型の扁平上皮細胞；E：鋸歯状の尿細管上皮細胞
丸細胞のPapanicolaou染色結果をFigure 6に示す。丸細胞は鋸歯状の尿細管上皮細胞と同等の染色態度を示した。
左：鋸歯状の尿細管上皮細胞；右：丸細胞
Trypan Blue染色を用いて丸細胞を生細胞（陰性）と死細胞（陽性）に分類した結果，両細胞の存在が確認可能であった（Figure 7）。
A：生細胞；B：死細胞
また，均質状（n = 25）および顆粒状（n = 102）の丸細胞の2タイプで生細胞と死細胞の分類を行った。その結果，丸細胞の生存率は均質状で72%，顆粒状で37.2%であった（Figure 8）。さらに，均質状の丸細胞は顆粒状の丸細胞と比較して有意に生存率が高いことが認められた。
丸細胞の生存率は均質状で72%，顆粒状で37.2%であった。
本研究で対象とした丸細胞は末期腎不全患者に多く認められ，丸細胞を多数認める症例では透析導入へ移行する例が多く認められたことが報告されている3)。このことから丸細胞は腎機能を評価するための指標となる新規バイオマーカーであることが示唆されている3)。
しかし，健常者尿における丸細胞の出現の有無や形態学的特徴やその性状については明らかになっておらず，丸細胞の評価基準は定まっていないことから，尿沈渣検査への応用にはまだ多くの時間を要することが推測される。今回，健常者尿を対象として，丸細胞の出現の有無を確認し，その性状について検討を行うことで，鑑別ポイントをまとめることとした。丸細胞の細胞質辺縁は明瞭で厚みがあり球状を呈した約15 μmの尿細管上皮細胞である。類似する成分には，白血球と深層型の扁平上皮細胞が挙げられる。丸細胞は白血球（好中球）に比べやや大きく細胞に厚みがあり上皮細胞系であることがわかる。また，細胞質内にブラウン運動は認められないことから白血球（好中球）と鑑別することが可能である。丸細胞は約15 μmで球状，無染色では灰白色を呈することに対し，深層型の扁平上皮細胞は多くが20 μm以上で円形，類円形，無染色では光沢のある灰色や緑色を呈する。以上のことから丸細胞の類似成分と鑑別を行うことが可能である。
検討では健常者尿のみを対象とすることから，尿定性検査を実施後，腎疾患，高血圧，糖尿病などの疑いがある者は除外した。加えて，月経周期により不適切な検体は除外することとした。尿定性検査・尿定量検査を行ったことで，より厳しい条件で健常者尿を対象とすることができた。また，女性検体では月経周期の前半は，エストロゲンが優位となり膣上皮細胞層が増殖および成熟し，月経周期の後半は，プロゲステロンが優位となり膣上皮細胞の脱落を促すことが報告されている5)。したがって，女性検体において丸細胞を検出する際には月経周期を考慮する必要があり，正しい採尿法と中間尿を用い膣からのコンタミネーションを減らすことが大切であると考える。
丸細胞に関する検討については，不適切検体を除いた78検体で行った。まず，健常者尿に丸細胞の出現の確認を行った結果，78検体中66検体，全体の85%で出現が認められた。また，平均1.7個/WFの出現が認められた。Shukuyaら3)の報告では丸細胞が5個/WF以上の出現を陽性としていたが，今回の検討においても5個/WF以上認められた検体は無かった。健常者において少数出現が認められることから，疾患が無くても，尿細管上皮細胞が生理的に剥離した再生過程に出現し，尿細管の再生過程に関与していることが推測された。
次に，丸細胞の直径について尿沈渣検査の分野でも使用されている画像処理フリーソフトのImage Jを用いて画像解析を行った6)。丸細胞が類円形型の尿細管上皮細胞に変化していく可能性を考慮し，顕微鏡下による算出時に各丸細胞を撮影した画像を用いた。その結果，丸細胞の平均直径は15.38 ± 1.84 μmであった。したがって，直径が20 μm以下であることが丸細胞を鑑別するうえでのひとつのポイントとなると考える。
無染色において丸細胞と類似する尿沈渣成分として白血球と深層型の扁平上皮細胞が挙げられる。鑑別ポイントとしては，白血球は分葉した核や細胞質内のブラウン運動の確認により判断可能である。深層型の扁平上皮細胞は楕円形で厚みがあり，一方，丸細胞は明らかな球状を呈する。また，今回の形態学的特徴の観察から丸細胞の細胞質は均質状と顆粒状の2タイプに分類することが可能であった。したがって，鑑別には細胞の大きさだけでなく，細胞質の構造も重要な鑑別ポイントになると考える。
しかし，無染色では核などの所見が分かりにくいことから，丸細胞を検出するには相当な鑑別スキルを要すると思われる。そこで，日常検査で行われるSternheimer染色における染色性を確認した。その結果，染色陽性の細胞と陰性の細胞が認められた。染色陽性の細胞は，我々が通常よく目にする尿細管上皮細胞と同様の染色性を示した。一方で，陰性を示した細胞は時間を置くことで，陽性を示した細胞と同等の染色性を示した。陰性を示した細胞は，生細胞であり染まりにくいことが考えられる。また，無染色において確認が困難であった核がSternheimer染色を行うことで確認が容易になるため，核の分葉や位置関係を十分に見極めることで，白血球や深層型の扁平上皮細胞との鑑別に有用であると考える。
また，Lugol染色により丸細胞と深層型の扁平上皮細胞との鑑別を行った。その結果，Figure 5に示す通り丸細胞は尿細管上皮細胞と同等の染色性を示し，深層型の扁平上皮細胞とは異なる染色性を示した。染色することにより鑑別が容易になるため，Lugol染色は鑑別に有用な染色法であり，丸細胞の検出の一助となると考える。したがって，丸細胞と深層型の扁平上皮細胞の鑑別が困難な場合はLugol染色を行い染色性の違いによって鑑別を行うことが重要である。
さらに，固定液による検体保存の影響についても検討した。LBC標本作製後にPapanicolaou染色を行った結果，丸細胞は尿細管上皮細胞と同等の染色結果を示した。細胞は，固定されるためやや小さくなるが，丸細胞の形態的に大きな変化は認められなかった。したがって，固定後であっても丸細胞の検出は可能である。
次に丸細胞の生存性について確認を行った。Trypan Blue染色は，膜障害性を見るバイオアッセイとして一般的に用いられている染色法である7)。この色素は細胞の物質透過膜の破壊によって細胞内に入り組み青色に染色する7)。細胞の生死判定は，細胞の生存率を評価するうえでも重要なパラメーターとなる8)。坂牛ら9)は，すべての丸細胞はTrypan Blueに染色されず生細胞であることを報告しているが，丸細胞の形態と生存率についての詳細な報告はされていない。一方で本研究のTrypan Blue染色の結果では，丸細胞には生細胞と死細胞が混在していた。さらに，丸細胞の生存率が，均質状と顆粒状の形態により異なることが明らかとなった。顆粒状と比較して均質状は生存率が高く，均質状は顆粒状よりも細胞活性が高い細胞であると示唆される。本研究では健常者を対象にしているが，坂牛らの検討では患者を対象にしている。病態の有無により出現する丸細胞の形態や生存率に影響がある可能性も否定できないため，今後検討していく必要がある。これを踏まえると，Shukuyaら3)の細胞培養成績には，均質状の未分化な丸細胞が関与していることが推測される。
現在までに，尿細管腔の再生を担う主要な細胞の起源は明らかになっていない10)。尿細管腔の再生には正常な尿細管上皮細胞が増殖・遊走・分化し，新たな尿細管腔が再構築されると考えられており，その過程に出現する細胞として反応性尿細管上皮細胞が存在することが報告されている2)。この細胞は形態学的に丸細胞と非常に類似する。このことから丸細胞も尿細管腔の再生，修復に関与していることが示唆され，反応性尿細管上皮細胞と丸細胞の関連性についてさらなる検討が必要である。
今日の尿沈渣検査は自動分析機による測定が主体になっている。しかし，自動分析機の基礎研究の報告によると尿細管上皮細胞は完全一致率が低値であり，尿細管上皮細胞を白血球として誤判定する場合や，扁平上皮細胞と誤算定する場合がある11)。また，丸細胞などの少数の尿沈渣成分は自動分析機では判定することが不可能であり，目視で鏡検することが必須である。通常，尿沈渣検査における上皮細胞類の報告単位にはHPFを用いるが，丸細胞は出現数少ないため，WFでの算定が必要である。
健常者尿において丸細胞の出現を確認し，丸細胞の鑑別ポイントを挙げた。また，丸細胞の形態学的特徴として，細胞質の性状により均質状と顆粒状の2タイプに大別することができ，細胞質が均質状の丸細胞は生細胞である可能性が示唆された。
本研究は，国際医療福祉大学倫理委員会の承認を得て遂行した（承認番号：19-Ifn-010，19-Ifn-036）。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本論文の執筆にあたり，ご指導とご助言をいただいた国際医療福祉大学大学院教授，医療法人社団高邦会高木病院高血圧・心不全センターセンター長 廣岡良隆教授に深謝いたします。
