奈良県におけるSARS-CoV-2核酸増幅検査の外部品質評価

李 相太; 野口 延由; 龍見 重信; 潮崎 裕也; 中村 彰宏

doi:10.14932/jamt.22-17

Abstract

新型コロナウイルス感染症のパンデミックにより，核酸増幅検査（NAAT）は多くの施設に普及した。NAATの結果は社会全体に大きな影響を与えるため，高い正確性および精確性が求められる。このため奈良県臨床検査技師会は，2021年7月にSARS-CoV-2 RNAのNAATの外部品質評価（EQA）を行った。EQA試料は，3つの陽性試料と1つの陰性試料で構成した。陽性試料は患者検体を用いて作成した低コピー試料（Sample 1）と高コピー試料（Sample 3）および市販の陽性コントロール（Sample 4）を，陰性試料は核酸分解酵素を含まない精製水（Sample 2）を用いた．評価は定性結果に基づいて行い，一部の試薬は，販売メーカーに依頼した測定結果を参考データとした。本EQAには，26施設が参加し，12種類の試薬，40テスト数が含まれた。各試料の正解率は，Sample 1が62.5%（25/40），Sample 2が100%（40/40），Sample 3が95.0%（38/40），Sample 4が67.5%（27/40）であった．不正解例は販売メーカーの参考データと一致していたため，試薬の検出感度や試料との相性などが要因と考えられた。参加施設の結果は試料や試薬の特性を反映しており，本事業の妥当性が示された。本EQAは，参加施設における継続的な検査品質の維持管理に貢献できるものと考える。

Translated Abstract

The coronavirus disease 2019 pandemic has led to the widespread use of molecular diagnostics in many clinical laboratories in Nara Prefecture. Since the results of molecular diagnosis have a significant impact on society as a whole, high accuracy and precision are required. Therefore, the Nara Association of Medical Technologists conducted an external quality assessment (EQA) of the molecular diagnosis of SARS-CoV-2 RNA in July 2021. The EQA samples consisted of three SARS-CoV-2-positive samples and one SARS-CoV-2-negative sample. Two samples with high (sample 1) and low (sample 3) Ct values prepared from patient specimens and commercial SARS-CoV-2-positive control (sample 4) were used as SARS-CoV-2-positive samples, and nuclease-free water (sample 2) was used as a SARS-CoV-2-negative sample. The evaluation was conducted on the basis of qualitative results, and for some reagents, we asked the manufacturer to measure EQA samples and evaluated the results as reference data. Forty tests with 12 different reagents from 26 laboratories were included in this EQA. The correct answers for each sample were as follows: “Sample 1” 62.5% (25/40); “Sample 2” 100% (40/40); “Sample 3” 95.0% (38/40); and “Sample 4” 67.5% (27/40). Since the incorrect results for some reagents were consistent with the manufacturer’s reference data, the detection sensitivity of the reagents and their compatibility with the samples were considered to be the factors. The results of the participating facilities reflected the characteristics of the samples and reagents, indicating the validity of this project. We believe that this EQA will contribute to the continuous maintenance and management of the quality of molecular diagnostics at the participating facilities.

I　目的

新型コロナウイルス感染症（coronavirus disease 2019; COVID-19）の世界的パンデミックにより，核酸増幅検査（nucleic acid amplification test; NAAT）は社会的に重要な検査法として認知され，日本においても「PCR検査」という言葉が一般化するに至った。COVID-19の病原体ウイルスであるSARS-CoV-2をとらえるNAATは，本感染症の診断や無症候性キャリアのスクリーニングやフォローアップに用いられており，多くの医療施設で広く普及している。SARS-CoV-2のNAATは，その結果が患者だけでなくその周囲の人々や社会全体に大きな影響を与えるため，高い正確性および精確性が求められる。臨床検査室では，検査実施者の技術や使用機器および試薬の性能など検査全工程の管理を目的とした内部精度管理（internal quality assessment; IQA）および外部精度管理（external quality assessment; EQA）が日常的に実施されており，これらを通して検査結果の品質が保証されている。コロナ禍以前より，B型肝炎ウイルスや結核菌群などの病原体の検出を目的としたNAATが保険収載されており，EQAも日本臨床衛生検査技師会サーベイランス事業などが恒例として実施されている。前述した通り，近年広く導入されたSARS-CoV-2のNAATは，2020年10月に厚生労働省による「新型コロナウイルス感染症のPCR検査等にかかる精度管理調査業務」¹⁾が単発的に実施され，その他のサーベイランス事業として米国病理学会（College of American Pathologists; CAP）によるEQAであるCAPサーベイが2020年4月より開始されているのみであり²⁾，容易に参加できる安価なEQAが存在しない点が問題として挙げられる。奈良県臨床衛生検査技師会ではこのような背景の中，奈良県内医療施設におけるSARS-CoV-2のNAATのEQAと検査体制の実態把握を目的とし，臨時事業として，本事業を2021年度に遂行したので報告する。

II　方法

1．対象施設および試薬

対象施設は奈良県臨床検査技師会会員施設54施設及びその他企業メーカー2施設とし，募集は2021年度奈良県臨床検査技師会精度管理調査事業の一環として，2021年4月22日から5月21日に行った。対象試薬はNAAT用のものとし，本EQAの試料で評価できないNAAT機器・試薬は対象外とした。

2． EQA試料の準備

EQA試料は，3つのSARS-CoV-2陽性試料と1つの陰性試料とし，低コピー数の自作陽性試料（Sample 1），核酸分解酵素を含まない精製水（Sample 2），高コピー数の自作陽性試料（Sample 3）および市販陽性コントロールAcroMetrix SARS-CoV-2 Control（Thermo Fisher Scientific）（Sample 4）を用いた。EQA試料の配布量は，参加施設に事前アンケートを行い使用機器・試薬の構成から一回測定分の量を算出した。

自作陽性試料（Sample 1および3）は，奈良県立医科大学附属病院において当該検査実施目的により採取したSARS-CoV-2 RNA陽性検体の残余を用いて作成した。患者検体の利用は，奈良県立医科大学医の倫理審査委員会の承認を得て行った（研究番号：477）。検体は，感染症専門医によってポリエステル繊維スワブを用いて採取された鼻咽頭ぬぐい液を0.9%塩化ナトリウム溶液3 mLが添加された15 mLコニカルチューブに浸した状態で中央臨床検査部に提出され，検査後に−80℃で保存されていた。Sample 1はCOVID-19発症から20日以上経過した患者検体5検体，Sample 3はCOVID-19発症から3日以内の患者入院時検体4検体をプールして作成した。自作陽性試料の作成は，バイオセーフティー・レベル3適応検査室で行った。Figure 1に自作陽性試料の作成方法を示す。まず該当する患者検体を50 mLコニカルチューブに約8 mL収集し，ボルテックスミキサーで混和しプール検体を作成した。次に，プール検体から，Maxwell RSC InstrumentとMaxwell RSC Virus Total Nucleic Acid Purification Kit（いずれもプロメガ株式会社）を用いて核酸抽出を行った。Maxwell RSC Virus Total Nucleic Acid Purification Kitは，1キット当たり300 μLの検体から50 μLの核酸抽出液を作成するプロトコルで行った。24キット使用し，合計で1.2 mLの核酸抽出液を作成した。最後に，核酸分解酵素を含まない精製水18.8 mLと核酸抽出液をボルテックスミキサーで1分間混和し，これを自作陽性試料とした。自作陽性試料は，自立式マイクロチューブに各施設の必要量を分注して，−80℃で凍結保存した。

Figure 1 Preparation of positive EQA samples from COVID-19 patient specimens

SARS-CoV-2 positive patient specimens were collected in conical tubes to create 8 mL of pooled specimens. Pool specimens were nucleic acid extracted using the Maxwell RSC Instrument and Maxwell RSC Virus Total Nucleic Acid Purification Kit to prepare 1.2 mL of nucleic acid extract. Nucleic acid extracts were prepared for 24 kits, using 300 μL of pooled samples per kit. The nucleic acid extracts were mixed with 18.8 mL of purified nuclease-free water with a vortex mixer for 1 minute to prepare 20 mL of positive EQA samples. The positive EQA samples were aliquoted into microtubes in the required volume for each participant and stored at −80°C.

自作陽性試料は，Loopamp新型コロナウイルス2019（SARS-CoV-2）検出試薬キット（栄研化学株式会社）とXpert Xpress SARS-CoV-2「セフィエド」（ベックマン・コールター株式会社）を用いて事前に核酸増幅を行い，閾値を確認した。Loopamp新型コロナウイルス2019（SARS-CoV-2）検出試薬キットにおけるSample 1とSample 3のTt値は，22:24と11:48，Xpert Xpress SARS-CoV-2「セフィエド」のCt値はE geneが34.4と18.2，N2 geneが36.1と19.8であった。Sample 2は，いずれにおいてもSARS-CoV-2が検出されなかった。

Sample 4は，配送日前日にAcroMetrix SARS-CoV-2 Controlを凍結から融解し，自立式マイクロチューブに参加施設の必要量を分注して冷蔵で保存した。

3．参加施設への試料の配布

参加施設へのEQA試料の配送は，2021年7月4日に行った。Sample 1～3の配送は，奈良県立医科大学附属病院から行った。試料は発泡スチロール容器にドライアイスと共に梱包し，翌日に到着するように配送専門業者に依頼した。Sample 4は，天理よろづ相談所病院から冷蔵で配送した。

4．測定，報告および評価方法

Sample 1から3は各測定機器および試薬の添付文書に従い，核酸抽出なしでそのまま測定した。Sample 4は，自動機器や核酸抽出が不要な試薬ではそのまま使用し，核酸増幅のみの測定では核酸抽出の工程を加えるようにした。報告は定性値として，それに基づき評価を行った。Ct値等の判定値は，任意で募った。事前アンケートで導入が確認された一部の全自動分析装置は，販売メーカーに本EQA試料の測定を依頼し，その結果を参考データとして評価に用いた。

III　結果

1．参加施設および試薬（Table 1）

Table 1 Participant’s molecular diagnostic reagents

参加申し込みは26施設（医療機関は24施設），テスト数は複数の試薬での参加施設があったため40テストであった。試薬は12種類あり，国立感染症研究所の病原体検出マニュアルに基づく方法はなかった。試薬の内訳は，Loopamp新型コロナウイルス2019（SARS-CoV-2）検出試薬キットとミュータスワコーCOVID-19（富士フイルム和純薬株式会社）が7施設，Xpert Xpress SARS-CoV-2「セフィエド」が6施設，スマートジーンSARS-CoV-2（株式会社ミズホメディー）が5施設，Ampdirect 2019-nCoV（株式会社島津製作所）が4施設，TRC Ready SARS CoV-2（東ソー株式会社）が3施設，Takara SARS-CoV-2ダイレクトPCR検出キット（タカラバイオ株式会社）が2施設，LeaDEA VIASURE SARS-CoV-2 PCR Kit（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社），LightMix Modular SARS-CoV (COVID19) N-gene（TIB Molbiol），SmartAmp 2019新型コロナウイルス検出試薬（株式会社ダナフォーム），ジーンキューブHQ SARS-CoV-2（東洋紡株式会社），アイデンシーパックSARS-CoV-2（株式会社アークレイファクトリー）が1施設であった。各施設の参加試薬は1～4種類（中央値1）で，複数の試薬での参加は8施設であった。

2． EQA試料の正解率（Table 2）

Table 2 EQA sample results and correct answer rate (n = 40)

EQA sample	Result			Correct
EQA sample	Positive	Negative	Error	Correct
Sample 1 (Low Positive)	25	15	0	62.5%
Sample 2 (Negative)	0	40	0	100%
Sample 3 (High Positive)	38	0	2	95.0%
Sample 4 (Positive control)	27	13	0	67.5%

Sample 1: Nucleic acid extraction was performed from SARS-CoV-2 positive specimens collected after 20 days of COVID-19 onset (High Ct value)

Sample 2: Nuclease Free Water

Sample 3: Nucleic acid extraction was performed from SARS-CoV-2 positive specimens collected within 3 days of COVID-19 onset (Low Ct value)

Sample 4: AcroMetrix™ SARS-CoV-2 Control

各EQA試料の正解率は，Sample 1が62.5%（25/40），Sample 2が100%（40/40），Sample 3が95.0%（38/40），Sample 4が67.5%（27/40）であった。

3．試薬の正解率（Table 3）

Table 3 Number of correct by molecular diagnostic reagents

Reagents	Number of participants	Sample 1 (Low Positive)	Sample 2 (Negative)	Sample 3 (High Positive)	Sample 4 (Positive control)
Loopamp Novel Coronavirus 2019 (SARS-CoV-2) Detection Kit	7	4 (57.1%)	7 (100%)	7 (100%)	5 (71.4%)
μTASWako SARS-CoV-2	7	2 (28.6%)	7 (100%)	7 (100%)	1 (14.3%)
Xpert Xpress SARS-CoV-2 ‘Cepheid’	6	6 (100%)	6 (100%)	4 (66.7%)	6 (100%)
Smart Gene nCoV Detection test cartridge	6	0 (0%)	6 (100%)	6 (100%)	5 (83.3%)
Ampdirect 2019-nCoV Detection Kit	4	4 (100%)	4 (100%)	4 (100%)	4 (100%)
TRCReady SARS CoV-2	3	2 (66.7%)	3 (100%)	3 (100%)	0 (0%)
Takara SARS-CoV-2 Direct PCR detection kit	2	2 (100%)	2 (100%)	2 (100%)	2 (100%)
LeaDEA VIASURE SARS-CoV-2 PCR Kit	1	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)
LightMix Modular SARS-CoV (COVID19) N-gene	1	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)
SmartAmp SARS-CoV-2	1	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)
GENECUBE SARS-CoV-2	1	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)	0 (0%)
i-densy Pack SARS-CoV-2	1	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)	1 (100%)

Sample 1: Nucleic acid extraction was performed from SARS-CoV-2 positive specimens collected after 20 days of COVID-19 onset (High Ct value)

Sample 2: Nuclease Free Water

Sample 3: Nucleic acid extraction was performed from SARS-CoV-2 positive specimens collected within 3 days of COVID-19 onset (Low Ct value)

Sample 4: AcroMetrix™ SARS-CoV-2 Control

6つの試薬（Ampdirect 2019-nCoV，Takara SARS-CoV-2ダイレクトPCR検出キット，LeaDEA VIASURE SARS-CoV-2 PCR Kit，LightMix Modular SARS-CoV (COVID19) N-gene，SmartAmp 2019新型コロナウイルス検出試薬，アイデンシーパックSARS-CoV-2）は，全てのEQA試料で正解率が100%であった。その内，Ampdirect 2019-nCoVとTakara SARS-CoV-2ダイレクトPCR検出キットはRNA精製が不要な試薬であった。不正解は，Sample 1は4種類，Sample 3は1種類，Sample 4は5種類の試薬で認めた。スマートジーンSARS-CoV-2のSample 1とTRCReady SARS CoV-2のSample 4は，全ての施設で検出されなかった。ミュータスワコーCOVID-19は，Sample 1とSample 4の正解数が2施設と1施設であった。Sample 3は，Xpert Xpress SARS-CoV-2「セフィエド」のみ測定時のエラーにより結果が報告されなかった。

4．参加施設における陽性試料（Sample 1および3，4）の判定値（閾値，カットオフ値など）と協力メーカーの結果（Table 4）

Table 4 Values for positive EQA samples for each participant (Ct value of the target gene or other data value)

Reagents	participants	Sample 1			Sample 3			Sample 4
Reagents	participants	Result	Values		Result	Values		Result	Values
Loopamp Novel Coronavirus 2019 (SARS-CoV-2) Detection Kit			N, RdRp			N, RdRp			N, RdRp
	d	Positive	30:36		Positive	13:30		Negative	0
	g	Positive	21:12		Positive	10:54		Positive	26:18
	i	Positive	19:54		Positive	10:36		Positive	14:54
	o	Negative	0		Positive	11:30		Negative	0
	u	Negative	0		Positive	10:00		Positive	28:48
	w	Positive	22:24		Positive	11:48		Positive	17:36
	z	Negative	0		Positive	10:54		Positive	17:00
μTASWako SARS-CoV-2			ORF1a	S		ORF1a	S		ORF1a	S
	FUJIFILM Wako	Negative	0	0	Positive	26.4	24.8	Negative	0	0
	a	Negative	0	0	Positive	26.3	24.5	Negative	0	0
	j	Negative	0	0	Positive	29.1	27.1	Negative	0	0
	p	Negative	0	0	Positive	27.4	26.3	Negative	0	0
	q	Negative	0	0	Positive	28.5	26.7	Negative	0	0
	r	Negative	0	0	Positive	27.1	25.3	Negative	0	0
	t	Positive	0	40.9	Positive	27.4	25.2	Negative	0	0
	w	Positive	0	40.7	Positive	24.8	26.6	Positive	0	40.6
Xpert Xpress SARS-CoV-2 ‘Cepheid’			E	N2		E	N2		E	N2
	Beckman Coulter	Positive	34.6	36.7	Positive	17.7	19.3	Positive	31.9	34.9
	a	Positive	36.9	36.6	Positive	18.4	19.8	Positive	31.9	34.9
	d	Positive	34.8	35.8	ERROR	—		Positive	32.1	34.7
	f	Positive	34.6	36.0	ERROR	—		Positive	31.7	34.7
	g	Positive	34.3	35.6	Positive	17.2	18.6	Positive	32.7	36.1
	h	Positive	36.0*		Positive	19.7*		Positive	34.4*
	w	Positive	34.4	36.1	Positive	18.2	19.8	Positive	31.7	34.8
Smart Gene nCoV Detection test cartridge			Number of cycles			Number of cycles			Number of cycles
	b	Negative	No report		Positive	No report		Positive	No report
	c	Negative	0		Positive	29/45		Negative	0
	i	Negative	0		Positive	32/45		Positive	40/45
	r-1	Negative	0		Positive	28/45		Positive	40/45
	r-2	Negative	0		Positive	30/45		Positive	41/45
	y	Negative	0		Positive	28/45		Positive	43/45
Ampdirect 2019-nCoV Detection Kit			N1	N2		N1	N2		N1	N2
	f	Positive	36.72	36.04	Positive	19.51	19.07	Positive	34.94	35.51
	k	Positive	33	36	Positive	24	33	Positive	34	0
	v	Positive	35.104	34.585	Positive	18.932	17.537	Positive	33.711	33.802
	x	Positive	35.56	34.63	Positive	19.69	18.90	Positive	35.02	34.81
TRCReady SARS CoV-2			Detection time			Detection time			Detection time
	TOSOH	Positive	5 min. 45 sec.		Positive	1 min. 26 sec.		Negative	0
	m	Negative	No report		Positive	No report		Negative	No report
	n	Positive	No report		Positive	No report		Negative	No report
	s	Positive	11 min. 22 sec.		Positive	1 min. 52 sec.		Negative	0
Takara SARS-CoV-2 Direct PCR detection kit			N1	N2		N1	N2		N1	N2
	d	Positive	36.637	35.301	Positive	19.176	17.879	Positive	34.770	34.574
	g	Positive	36.301**		Positive	19.152**		Positive	34.457**
LeaDEA VIASURE SARS-CoV-2 PCR Kit			ORF1ab, N			ORF1ab, N			ORF1ab, N
LeaDEA VIASURE SARS-CoV-2 PCR Kit	z	Positive	36.16		Positive	20.80		Positive	32.64
LightMix Modular SARS-CoV (COVID19) N-gene			N			N			N
LightMix Modular SARS-CoV (COVID19) N-gene	i	Positive	39.43		Positive	23.82		Positive	38.57
SmartAmp SARS-CoV-2			Nsp15			Nsp15			Nsp15
SmartAmp SARS-CoV-2	w	Positive	27.99		Positive	13.56		Positive	20.95
GENECUBE SARS-CoV-2			Fluorescence value			Fluorescence value			Fluorescence value
	TOYOBO	Positive	51.35		Positive	54.18		Positive	53.83
	l	Positive	43.18		Positive	59.01		Negative	4.37
i-densy Pack SARS-CoV-2	e	Positive	No report		Positive	No report		Positive	No report
Aptima SARS-CoV-2			RLU value			RLU value			RLU value
	Hologic Japan	Positive	726		Positive	1,173		Positive	1,182
	No participants	—	—		—	—		—	—

No report: No Ct values or other data were reported by the participants.

*E gene or N2 gene

**N1 gene or N2 gene

販売メーカーによる測定は，5社の協力により行われた。ミュータスワコーCOVID-19はSample 1および4が，TRCReady SARSCoV-2はSample 4が検出されず，参加施設の結果と一致した。また，ジーンキューブHQ SARS-CoV-2は，参加施設においてSample 4が検出されなかったが，メーカー測定では検出された。各試薬の判定値は，EQA試料が含むSARS-CoV-2 RNA量が参加施設の測定で再現されたことを示していた。尚，販売メーカーによるSample 2の測定結果は全て陰性であった。また，Aptima SARS-CoV-2（ホロジックジャパン株式会社）は，導入施設からの報告がなかった．

5．不正解例の要因調査（Table 5）

Table 5 Inaccurate case factors

Case	Factors
1．Xpert Xpress SARS-CoV-2「セフィエド」において2施設がSample 3を検出できなかった	（施設d）精度管理試料をカートリッジに入れて測定しようとしたところ，上手くカートリッジが装填できず，検査を断念した。本来であれば，残試料で別カートリッジを使用するが，精度試料が1回分のみだったため測定できなかった。（施設f）カートリッジ装填後，12分後にERRORとなり測定が出来なかった。
2．ミュータスワコーCOVID-19においてSample 1およびSample 4の検出率が低かった	Sample 1およびSample 4からの検出が困難であることは，販売メーカーから事前に報告を受けていた。同一試料における販売メーカーの測定ではいずれも検出されなかったが，一部の施設で検出が報告された。検出施設の結果について販売メーカーにデータ解析を依頼した結果，非特異反応ではないことが示されている。このため，各試料の低い検出率は，試薬の感度によるものと考える。
3．TRCReady SARS CoV-2においてSample 4の検出が出来なかった	AcroMetrixからの目的遺伝子の精製と検出は，検査試薬が採用する試薬の技術的・至適組成の観点から，原理的に困難であることを，販売メーカーから事前に報告を受けていた。同一試料における販売メーカーの測定結果も同様であった。また，核酸の精製を他社製品で実施しTRCReady-80で検出を行った場合，多少の改善は認めるが，予備的な試験なため十分な検証はされていないことも併せて報告を受けた。
4．Loopamp新型コロナウイルス2019（SARS-CoV-2）検出試薬キットにおいて2施設がSample 4を検出できなかった	Sample 4を，核酸抽出を行わず，直接核酸増幅を行っていた可能性がある。
5．スマートジーンSARS-CoV-2においてSample 1が検出できなかった	発症から10日以上経過した検体からは目的遺伝子の検出が不可であることを，販売メーカーから事前に告知されていた。尚，Sample 1を含む本EQA試料の販売メーカーによる測定協力は得られなかった。

不正解例について，知り得る範囲で収集した。不正解の要因は，測定時のエラーや試薬の特性によるもの，試料の取り扱いの不備であった。

IV　考察

SARS-CoV-2のNAAT試薬は，多くの企業から販売されているが，核酸抽出には高品質な精製や簡易的なものがあり，核酸増幅法もポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction; PCR）の他に，ループ介在等温増幅（loop-mediated isothermal amplification; LAMP）や転写逆転写協奏反応（transcription reverse-transcription concerted reaction; TRC），転写媒介増幅（transcription mediated amplification; TMA），SmartAmp（smart amplification process）など様々で，また全自動分析装置等もあり，反応時間や判定基準も異なる。異なる施設，異なる測定間の結果の一致は，各施設の品質を評価する上で重要な要素の一つである。2020年8月に奈良県臨床検査技師会で行ったCOVID-19に関するアンケート調査では，SARS-CoV-2のNAATを行っている施設は5施設9テストであったが，今回の精度管理参加施設が26施設40テストであったことから，1年間で実施施設数が約5倍，テスト数は約4倍に増加したことが判明し，本EQAの試料はこれら全ての施設で検出されることが望まれた。既報では，陽性試料に細胞培養で得られたSARS-CoV-2を不活化したもの^3)～6)や市販コントロールなどの疑似ウイルス^1),7)～10)，COVID-19患者検体を希釈したもの¹¹⁾などが用いられている。本EQAでは，市販コントロール試料に加えて，SARS-CoV-2陽性検体から核酸抽出したものを精製水で希釈する方法で作成した独自の陽性試料を採用した。この試料の利点は，SARS-CoV-2陽性検体を準備できれば，作成は簡便且つ安価あり，感染性がないため配送が容易なことである。また，各試薬の判定値が異なる施設間で大きく変わらなかったことから，一般的な冷凍配送であれば測定まで安定性が保たれ，基となった検体のSARS-CoV-2 RNA量が反映されるものと考えられる。

陽性試料の正解率は，Sample 3でほぼ100%であったが，Sample 1とSample 4は60%程度であった。Sample 1は，「感染性を有するウイルスの低コピー数検体」の代替として用いたCt値が高い検体であった。SARS-CoV-2のNAATにおける偽陰性についてのメタアナリシスでは，偽陰性率は発症から3日目の20%から上昇し，16日目は66%となることが報告されている¹²⁾。また，軽症から中等症患者において発症から10日以上経過した後にSARS-CoV-2が検出されても，培養で検出されず感染性がないとされているため^13),14)，本来検査対象とはならない。特に国産の全自動分析装置における低い検出率は，検出感度や核酸抽出方法だけでなく，回復患者検体からSARS-CoV-2の分子断片や残存RNAと言われるものを検出することを目的としていないことが要因かもしれない。このため，低コピー試料は高コピー試料を希釈して作成することが適切であったと考える。

Sample 3の結果は，発症日の3日以内の検体であれば全ての施設で検出可能であること示している。一部の施設で同一試薬のエラーを認めたが，試料の配布を1測定分のみとしたため再測定が出来なかった。CAPサーベイでは，EQA試料が2 mL配布されるため，施設内で要員ごとの操作と結果の比較が可能となっている。EQA試料は，機器のエラーなどを考慮して複数回使用できる量を配布することが改善点として考えられた。

Sample 4は，RNA量が5,000 copies/mLであったが，半数近い施設で検出されなかった。AcroMetrix SARS-CoV-2 Controlは，全てのNAAT試薬で検出が確認されたものではなく，また1社からは試薬の特性上検出できないことが事前に伝えられていた。市販コントロールには非複製組み換えウイルスや不活化ウイルス，ゲノムRNAなどがあるが，AcroMetrix SARS-CoV-2 ControlはゲノムRNAである。既報では，陽性試料としてAcroMetrix Coronavirus 2019（COVID-19）RNA Control（Thermo Fisher Scientific）と非複製組み換えウイルスであるAccuPlex SARS-CoV-2 Verification Panel（Seracare Life Sciences）を用いていたが，全自動分析装置はAccuPlex SARS-CoV-2 Verification Panelのみで評価が行われていた¹⁾。これは，AccuPlex SARS-CoV-2 Verification PanelがほとんどのNAAT試薬で検証されているためと考えられる。機器や試薬によって検出感度の限界やコントロールとの相性があるため，各社において全ての市販コントロールを使用できるとは限らない。このため，EQA試料に市販コントロールを用いる場合は，全てのNAAT試薬で検出できるものを選定すべきであると考える。

本EQAの限界として，試料のウイルス濃度に基づいた定量的な感度評価や，他の呼吸器ウイルスを混合した試料を用いた特異度評価を行っていない。また，今回用いた試料を使用出来ない一部の機器は対象外としたため，本EQAの結果が必ずしもすべての機器・試薬や施設の品質評価とはならない。ただし，参加施設の報告結果は試料や試薬の特性を反映しており，事業デザインや実施プロセスの妥当性は示されたと考える。COVID-19パンデミックを機にNAATを初めて導入した施設が多い中で，臨床検査における正確で再現性のある結果報告を維持するためには，EQAだけでなく他の臨床検査と同様のIQAも求められる。本EQAは，参加施設における継続的な検査品質の維持管理に貢献できるものであったと考える。

奈良県臨床検査技師会では，今後も社会的な課題を的確に捉えてそれに応じた事業を行い，臨床検査の品質向上に貢献したい。

V　結語

奈良県臨床検査技師会において，SARS-CoV-2 NAATのEQAを行った。EQA試料の検出率や判定値は，試料や試薬の特性を反映していたが，全ての試薬で検出できる試料を用いることが適切であると考えられた。本EQAは，参加施設における当該検査の品質維持に貢献できたと考える。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

謝辞

本EQA事業にあたりご協力を賜りました極東製薬工業株式会社，東ソー株式会社，東洋紡株式会社，日水製薬株式会社，富士フイルム和光純薬株式会社，ベックマン･コールター株式会社，ホロジックジャパン株式会社（五十音順）に深謝いたします。

文献

1) Asai S et al.: Nationwide external quality assessment of SARS-CoV-2 nucleic acid amplification tests in Japan. Int J Infect Dis, 2022; 115: 86–92.
2) 株式会社CGI：CAPサーベイ．https://www.cgikk.com/cgicapsurvey.html（2022年3月1日アクセス）
3) Sung H et al.: Nationwide external quality assessment of SARS-CoV-2 molecular testing, South Korea. Emerg Infect Dis, 2020; 26: 2353–2360.
4) Malecki M et al.: Analysis of external quality assessment samples revealed crucial performance differences between commercial RT-PCR assays for SARS-CoV-2 detection when taking extraction methods and real-time-PCR instruments into account. J Virol Methods, 2021; 295: 114202.
5) Fischer C et al.: Variable sensitivity of SARS-CoV-2 molecular detection in European expert laboratories: External quality assessment, June and July 2020. J Clin Microbiol, 2021; 59: e02676-20.
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9) Matheeussen V et al.: International external quality assessment for SARS-CoV-2 molecular detection and survey on clinical laboratory preparedness during the COVID-19 pandemic, April/May 2020. Euro Surveill, 2020; 25: 2001223.
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Corresponding author

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