Abstract
国内におけるアルカリ性ホスファターゼ（ALP）の活性測定は，2020年4月より，2-エチルアミノエタノール（EAE）緩衝液を用いたJapan Society Clinical Chemistry（JSCC法）から，国際臨床化学連合（IFCC）の基準測定操作法であり，血液型や食事の影響を受けにくいとされる2-アミノ-2-メチルプロパノール（AMP）緩衝液を用いたInternational Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine（IFCC法）へ準備の整った施設から変更開始することとなった。当院もIFCC法への切り替え準備をしていたところ，日臨技近畿支部臨床化学のALP活性に関する実技研修会の開催を知り参加した。その目的は，JSCC法，IFCC法の試薬成分を知り自家調製できる，用手法で活性測定と活性値の計算ができる，ABO式血液型によって活性値が異なることを理解できる，であった。実技研修会でJSCC法およびIFCC法の試薬を自家調製後，食前後に採血したA型，B型，O型，AB型の検体にて，用手法で活性測定および活性値を求めた。その結果，JSCC法およびIFCC法の活性値においてA型が最も低値で，B型が最も食前に比べ食後の上昇率が大きかった。また，JSCC法/IFCC法の活性値比は概ね3.0であった。これらの結果は過去の報告と同様であった。実技研修会の約1年後の2021年4月にALP試薬をIFCC法に切り替えたが，実技研修会で得た知識・技術が役立ち，自信をもってALP活性測定ができ，診療側からの問合せにも対応できた。臨床化学検査を担当者として，試薬成分や特徴を知り，用手法で活性測定や計算ができることは必須と考える。
Translated Abstract
From April 2020, the JSCC method using 2-ethylaminoethanol (EAE) buffer solution has been used to measure alkaline phosphatase (ALP) activity in Japan. It was decided to gradually shift to the IFCC method using a 2-amino-2-methylpropanol (AMP) buffer solution, which is also a commonly used reagent. When our hospital was preparing to switch to the IFCC method, we learned about the training workshop on ALP activity conducted by the Japanese Association of Medical Technologists Kinki Branch and participated in it. Its purpose is “Understand the reagent components of the JSCC method and IFCC method, and be able to prepare them yourself. You can measure and calculate the activity value by yourself. Understand that the activity value differs depending on the ABO blood type.” After preparing the reagents myself for the JSCC and IFCC methods during the practical training workshop, ALP activity was measured using type A, type B, type O, and type AB blood samples collected from subjects before and after a meal. As a result, among the samples analyzed by the JSCC and IFCC methods, type A blood samples showed the lowest ALP activity and type B blood samples showed the highest rate of increase after meals compared with before meals. The ratio of ALP activity determined by the JSCC method to that determined by the IFCC method was approximately 3.0. These results were similar to those in previous reports. Approximately one year after the practical training workshop, the ALP reagent was switched to the IFCC method in April 2021. The knowledge and skills gained from the practical training workshop were useful, and the ALP activity could be measured with confidence. For persons in charge of clinical chemistry tests, it is essential to know the reagent components and characteristics and to be able to measure and calculate the activity value by yourself.
I はじめに
従来，国内のアルカリ性ホスファターゼ（ALP）の活性測定には，多くの施設で2-エチルアミノエタノール（EAE）緩衝液を用いたJSCC法が採用されていた1)。JSCC法では，血液型B型O型でSe（Fut2）分泌型の人が疾患とは無関係に血中に小腸型ALPが出現すること，脂肪食後に小腸型ALPが大きく出現していた。従って，診療側は血液型や食事によるALP値への影響を考慮して肝臓や骨の状態を判読する必要があった。そこで，国内では2020年4月より，国際臨床化学連合（IFCC）の基準測定操作法である2-アミノ-2-メチルプロパノール（AMP）緩衝液を用いたIFCC法に準備の整った施設から変更開始することとなった2)。これにより，血液型B型O型の一部にみられた疾患と関連しない活性値の上昇の解消や，肝臓や骨疾患の臨床的意義の向上，また，国際的協同治験にも対応しやすいなどの利点がある。
当院も2021年4月よりALP測定試薬をIFCC法に切り替える準備をしていたところ，2020年2月11日にALP活性測定に関する日臨技近畿支部臨床化学実技研修会（実技研修会）が開催されることを知った。実技研修会の目的は，①ALP活性測定におけるJSCC法とIFCC法の試薬成分を理解し自家調製できる，②用手法で活性測定と活性値の計算ができる，③ABO式血液型によって活性値が異なることを理解できる，であり，ALPに関して勉強できると考え参加した。そこで，実技研修会の内容，結果および感想を報告する。
II 対象および方法
1． 実技研修会プログラムおよび参加者
1）プログラムは，午前9時から12時までは酵素活性の基礎に関する講義の受講，ALP試薬の自家調製を行い，午後1時半から5時まではJSCC法およびIFCC法によるALP活性測定の実習，データまとめ，ディスカッションを行った。
2）参加者は36名であり，実習では1班3名から4名の11班に分けて行った。
2． 研修会用試料
本研修会の内容を説明し，採血に同意を得た4名（各血液型1名ずつ）の検体を試料として用いた。朝食は脂肪分を極力抑えた食事を摂取し，5時間後に採血し（食前），その後，昼食に同量の脂肪食とアーモンドチョコレートを摂取し，3時間後に採血した（食後）。尚，本研修会の前日に採血し，採血管はテルモ ベノジェクトII（VP-ASO76KM）を用いた。採血した血液は，それぞれ30分静置後に血清分離（1,500 g, 10 min）し，本研修会までの約24時間冷蔵保存した。
3． 試薬調製
1） JSCC法試薬（Table 1）
Table 1
今回調製したJSCC，IFCC勧告法準拠試薬組成および測定条件
|
JSCC |
IFCC |
| 緩衝液 |
EAE |
AMP |
| 緩衝液濃度（mmol/L） |
1.0 |
0.75 |
| pH |
9.87 |
10.2 |
| 4NPP（mmol/L） |
15.0 |
16.0 |
| Mg（mmol/L） |
0.5 |
2.0 |
| HEDTA（mmol/L） |
― |
2.0 |
| Zn（mmol/L） |
― |
1.0 |
| 測定波長（nm） |
405 |
405 |
| 測定温度（℃） |
25 |
25 |
①2 mol/L塩酸，500 mL：比重1.18 g/mL，含量36%の濃塩酸（分子量：36.5）は［11.6 mol/L］であり，この塩酸［85.9 mL］を精製水の入った容器に分注し，精製水で500 mLとした。
②50.5 mmol/L塩化マグネシウム溶液，50 mL：MgCl2·6H2O（分子量：203）を［0.51］g計量し，精製水で溶解し50 mLとした。
（2） 第1試薬（1.01 mol/L EAE-HCl-0.505 mmol/L MgCl2緩衝液）50 mLビーカーでEAE（分子量：89.14）を［4.5］g計量し，精製水を約25 mL攪拌しながら分注した。次に準備試薬①の2 mol/L塩酸約13.0 mLを攪拌しながら分注し，次に準備試薬②の50.5 mmol/L塩化マグネシウム溶液を［0.5］mL分注し撹拌した。準備試薬①の2 mol/L塩酸にてpH 9.87に合わせ，精製水で50 mLとした（本来は試薬を30℃に保ちながらpHを合わせるが，今回は便宜上室温25℃前後で行った）。
（3） 第2試薬（75.75 mmol/L 4-ニトロフェニルリン酸溶液）10 mL4-ニトロフェニルリン酸2Na·6H2O（分子量：371.1）を［0.28］g計量し，第1試薬で溶解し10 mLとした。
2） IFCC法試薬（Table 1）
（1） 準備試薬（＊本研修会実務委員が事前に調製）③25%塩酸，500 mL：精製水約300 mLの入った容器に11.6 mol/L塩酸を［125］mL分注し，精製水で500 mLとした。
④溶液A（25.5 mmol/Lヒドロキシメチルエチレンジアミン三酢酸2Na，12.75 mmol/L 硫酸亜鉛七水和物，25.5 mmol/L 酢酸マグネシウム4H2O），100 mL：ヒドロキシメチルエチレンジアミン三酢酸-2Na（MW: 344.2）を［0.878］g計量し，精製水約70 mLで溶解し，次に硫酸亜鉛七水和物（MW: 287.58）を［0.367］g計量し，添加し完全に溶解させ，次に酢酸マグネシウム4H2O（MW: 214.45）を［0.547］gを計量し，添加し溶解させ精製水で100 mLとした。
（2） 第1試薬（956.3 mmol/L AMP-HCl-2.55 mmol/L 酢酸マグネシウム緩衝液）50 mL比重0.934 g/mL，含量98.9%のAMP（分子量89.14）は［10.36］mol/Lであり，このAMPを［4.61］mLを精製水で溶解し，準備試薬③の25%塩酸でpH 10.3～10.5に合わせた。次に準備試薬④を5 mL分注し，2 mol/L塩酸にてpHを10.2に合わせ，精製水で50 mLとした（本来は試薬を37℃に保ちながらpHを合わせるが，今回は便宜上室温25℃前後で行った）。
（3） 第2試薬（81.6 mmol/L 4-ニトロフェニルリン酸溶液）10 mL4-ニトロフェニルリン酸2Na·6H2O（分子量：371.1）を［0.30］g計量し，精製水で10 mLとした。
尚，試薬調製に関し，［ ］内の数値は参加者が計算し，第1試薬，第2試薬の試薬類は実際に計量，分注した。
4． 使用機器および標準物質
・試薬調製時のpHメータとして，コンパクトpHメータLAQUAtwin-pH-11B（堀場製作所）を用いた。
・吸光度測定用として，分光光度計AE-350（エルマ販売株式会社）を用いた。
・ALP標準液として，酵素コントロールプラス1・2「ヤトロン」（LSIメディエンス社）を代用した。
5． ALP活性測定手順と実験内容
1） ALP活性測定手順
①反応温度は全て室温25℃前後で行った。
②分光光度計の波長を405 nmにセットし，精製水で吸光度0とした。
③室温の第1試薬2.0 mLを試験管に分注，混和した。
④JSCC法では試料25 μL，IFCC法では50 μLを分注，混和し，室温で2分間加温した。
⑤室温の第2試薬0.5 mLを分注，混和し，反応液を反応セルに分注した。
⑥反応セルを分光光度計にセットし，90秒後を0分とし，1分後，2分後，3分後の吸光度を判読した。
⑦本研修会では，反応温度が室温25℃前後と37℃より低かったため，2分間の吸光度変化量を1分間の吸光度変化量として標準液（JSCC法586 U/L，IFCC法211 U/L）を基準として求めた活性値と，4-ニトロフェノールの理論モル吸光係数18,700 L·mol−1·cm−1を用いた活性値を求めた。尚，モル吸光係数を用いた活性値は，反応温度が低いこと，測定時間が2分であること，モル吸光係数が理論値であることから正確な値を得られないため，自ら活性値の計算ができることを目的として行った。
2） 実験内容
（1） JSCC法およびIFCC法による活性値と血液型との関連性JSCC法およびIFCC法試薬で血液型A，B，AB，O型のALP活性値を求め，血液型と活性値の関連性をみた。
（2） JSCC法およびIFCC法による食前後の活性値と血液型との関連性JSCC法およびIFCC法試薬で血液型A，B，AB，O型の食前後のALP活性値を求め，血液型と食事による変動率（食後／食前）をみた。
（3） JSCC法およびIFCC法による活性値の比較JSCC法およびIFCC法試薬で血液型A，B，AB，O型のALP活性値を求め，2法の活性値比（JSCC法/IFCC法）をみた。
尚，（1）～（3）のALP活性値は標準液を基準とした活性値を求め，11グループの平均活性値で評価した。
III 結果
（1） JSCC法およびIFCC法による活性値と血液型との関連性食前の活性値は，JSCC法でA型108.3 U/L < B型174.6 U/L < O型187.7 U/L < AB型207.4 U/L（Table 2），IFCC法でA型39.3 U/L < B型59.4 U/L < O型60.1 U/L < AB型74.1 U/L（Table 3）と，2法ともA型が低活性であった。
Table 2
JSCC勧告法（EAE緩衝液）における標準液（STD：586）を基準とした昼食前後のALP活性値（U/L）およびその比
| Group |
A |
O |
AB |
B |
| Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
| 1 |
127 |
127 |
1.00 |
224 |
272 |
1.21 |
211 |
193 |
0.91 |
205 |
254 |
1.24 |
| 2 |
108 |
120 |
1.11 |
201 |
197 |
0.98 |
221 |
193 |
0.87 |
165 |
193 |
1.17 |
| 3 |
95 |
95 |
1.00 |
156 |
159 |
1.02 |
183 |
193 |
1.05 |
170 |
207 |
1.22 |
| 4 |
103 |
83 |
0.81 |
173 |
165 |
0.95 |
182 |
173 |
0.95 |
149 |
173 |
1.16 |
| 5 |
107 |
127 |
1.19 |
197 |
205 |
1.04 |
217 |
221 |
1.02 |
189 |
225 |
1.19 |
| 6 |
121 |
112 |
0.93 |
205 |
219 |
1.07 |
223 |
214 |
0.96 |
177 |
219 |
1.24 |
| 7 |
108 |
108 |
1.00 |
197 |
185 |
0.94 |
221 |
201 |
0.91 |
181 |
225 |
1.24 |
| 8 |
96 |
115 |
1.20 |
180 |
192 |
1.07 |
203 |
180 |
0.89 |
161 |
218 |
1.35 |
| 9 |
107 |
102 |
0.95 |
176 |
180 |
1.02 |
180 |
180 |
1.00 |
164 |
189 |
1.15 |
| 10 |
110 |
129 |
1.17 |
190 |
212 |
1.12 |
234 |
203 |
0.87 |
186 |
212 |
1.14 |
| 11 |
109 |
125 |
1.15 |
166 |
190 |
1.14 |
206 |
194 |
0.94 |
174 |
186 |
1.07 |
| Mean |
108.3 |
113.0 |
1.05 |
187.7 |
197.8 |
1.05 |
207.4 |
195.0 |
0.94 |
174.6 |
209.2 |
1.20 |
Table 3
IFCC勧告法（AMP緩衝液）における標準液（STD：211）を基準とした昼食前後のALP活性値（U/L）およびその比
| Group |
A |
O |
AB |
B |
| Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
Before meals |
After meals |
After/Before |
| 1 |
40 |
40 |
1.00 |
61 |
61 |
1.00 |
84 |
66 |
0.79 |
61 |
66 |
1.08 |
| 2 |
40 |
38 |
0.95 |
57 |
57 |
1.00 |
72 |
65 |
0.90 |
57 |
63 |
1.11 |
| 3 |
40 |
44 |
1.10 |
56 |
58 |
1.04 |
68 |
60 |
0.88 |
72 |
65 |
0.90 |
| 4 |
35 |
37 |
1.06 |
57 |
57 |
1.00 |
70 |
66 |
0.94 |
61 |
61 |
1.00 |
| 5 |
37 |
40 |
1.08 |
68 |
63 |
0.93 |
77 |
70 |
0.91 |
59 |
60 |
1.02 |
| 6 |
41 |
38 |
0.93 |
55 |
66 |
1.20 |
79 |
67 |
0.85 |
49 |
66 |
1.35 |
| 7 |
43 |
43 |
1.00 |
65 |
58 |
0.89 |
70 |
65 |
0.93 |
58 |
70 |
1.21 |
| 8 |
44 |
44 |
1.00 |
67 |
62 |
0.93 |
76 |
71 |
0.93 |
64 |
64 |
1.00 |
| 9 |
36 |
41 |
1.14 |
61 |
61 |
1.00 |
70 |
65 |
0.93 |
58 |
65 |
1.12 |
| 10 |
37 |
38 |
1.03 |
54 |
66 |
1.22 |
72 |
71 |
0.99 |
54 |
68 |
1.26 |
| 11 |
39 |
41 |
1.05 |
60 |
60 |
1.00 |
77 |
62 |
0.81 |
60 |
70 |
1.17 |
| Mean |
39.3 |
40.4 |
1.03 |
60.1 |
60.8 |
1.02 |
74.1 |
66.2 |
0.90 |
59.4 |
65.3 |
1.11 |
JSCC法の食事による変動率（食後／食前）は，A型が1.05，B型が1.20，AB型が0.94，O型が1.05（Table 2），IFCC法の食事による変動率（食後／食前）は，A型が1.03，B型が1.11，AB型が0.90，O型が1.02（Table 3）と，2法ともB型の食後の上昇率が大きかった。
（3） JSCC法およびIFCC法による活性値の比較食前の活性値比（JSCC法/IFCC法）は，A型が2.77，B型が2.97，AB型が2.80，O型が3.14，食後の活性値比（JSCC法/IFCC法）は，A型が2.81，B型が3.21，AB型が2.95，O型が3.25と，食前，食後とも活性値比は概ね3.0前後であり，食後の活性値比は食前の活性値比に比べて全血液型で大きかった（Table 4）。
Table 4
JSCC勧告法およびIFCC勧告法における昼食前後のALPの活性値比
| Group |
A |
O |
AB |
B |
| Before meals |
After meals |
Before meals |
After meals |
Before meals |
After meals |
Before meals |
After meals |
| 1 |
3.18 |
3.18 |
3.67 |
4.46 |
2.51 |
2.92 |
3.36 |
3.85 |
| 2 |
2.70 |
3.16 |
3.53 |
3.46 |
3.07 |
2.97 |
2.89 |
3.06 |
| 3 |
2.38 |
2.16 |
2.79 |
2.74 |
2.69 |
3.22 |
2.36 |
3.18 |
| 4 |
2.94 |
2.24 |
3.04 |
2.89 |
2.60 |
2.62 |
2.44 |
2.84 |
| 5 |
2.89 |
3.18 |
2.90 |
3.25 |
2.82 |
3.16 |
3.20 |
3.75 |
| 6 |
2.95 |
2.95 |
3.73 |
3.32 |
2.82 |
3.19 |
3.61 |
3.32 |
| 7 |
2.51 |
2.51 |
3.03 |
3.19 |
3.16 |
3.09 |
3.12 |
3.21 |
| 8 |
2.18 |
2.61 |
2.69 |
3.10 |
2.67 |
2.54 |
2.52 |
3.41 |
| 9 |
2.97 |
2.49 |
2.89 |
2.95 |
2.57 |
2.77 |
2.83 |
2.91 |
| 10 |
2.97 |
3.39 |
3.52 |
3.21 |
3.25 |
2.86 |
3.44 |
3.12 |
| 11 |
2.79 |
3.05 |
2.77 |
3.17 |
2.68 |
3.13 |
2.90 |
2.66 |
| Mean |
2.77 |
2.81 |
3.14 |
3.25 |
2.80 |
2.95 |
2.97 |
3.21 |
IV 考察
今回の実技研修会では，測定温度を室温25℃前後で行ったこと，酵素標準液に市販管理血清の表示値を使ったこと，用手法で行ったことから，得られた活性値の正確性や精密性は劣るが，11グループの平均値でJSCC法，IFCC法によるALP活性値の特徴を捉えることができた。JSCC法およびIFCC法による活性値と血液型との関連性では，JSCC法，IFCC法ともA型の活性値が一番低く，従来の報告通りであった。一方，B型，O型はAB型より高値になると予測したが若干低値であったことから，今回のB型，O型の被検者が分泌型でなかった可能性が考えられた。JSCC法およびIFCC法による食前後の活性値と血液型との関連性では，JSCC法およびIFCC法ともB型の食後の上昇率が一番大きかったことより，小腸由来のALPが分泌されていた可能性が考えられた。AB型は食後の活性値が食前より低値となったが原因は不明であった。JSCC法およびIFCC法による活性値の比較では，食前後とも活性値比（JSCC法/IFCC法）は約3.0であり従来の報告通りであった。また，食後は食前に比較して全血液型で活性値比（JSCC法/IFCC法）が大きくなったことから，JSCC法は食事による上昇率がIFCC法より大きいことが考えられ，過去の報告と同様の動きであった。
V 実技研修会に参加しての感想
・ALP活性測定試薬において，当院は2021年4月からALP活性測定試薬をIFCC法に切り替えた。実技研修会でABO式血液型による活性値差およびJSCC法とIFCC法の活性値差を概ね理解できていたため，新JSCC法への切り替えによる障壁はなく，また診療側からの問合せにも対応でき研修会の経験は大変役立った。
・現状の生化学検査担当者は測定試薬を自家調製することはなく，市販試薬導入時に基礎性能試験を行い，試薬添付説明書や文献等で該当試薬の知識，性能を知るように努力しているが，本研修会で実際にALP測定試薬を自家調製したことで，JSCC法とIFCC法の試薬成分や働きが概ね理解でき，ALP活性測定に自信をもつことができた。
・日常検査では生化学自動分析装置が測定から活性計算まで行ってくれるため，生化学検査担当者は異常反応チェック，項目間チェックおよび前回値チェックなどで検査データを保証する業務に専念できるが，その反面，用手法で測定する力や計算力は低下していた。本研修会でモル吸光係数を用いた活性値計算および標準液を用いた活性値計算を経験したことで，生化学自動分析装置内の反応や計算が良く理解できた。
VI 結語
今回，ALP測定試薬のJSCC法からIFCC法に切り替え前に，ALPに関する実技研修会に参加したことで，ALP活性測定に自信をもって検査ができ，また臨床側からの問合せに対応できた。臨床化学検査担当者として，試薬調製や用手法で測定，濃度および活性値の計算ができることは，新しい検査法の開発や異常反応の確認時に必要な知識・技術と考える。今後も本研修会同様の実技研修会があれば積極的に参加すると共に，いずれは自分が主催側になれるように力をつけたい。
なお，この論文内容は，異動前の大阪市民病院機構大阪市立総合医療センター医療技術部検体検査部門配属時に経験したものである。
COI開示
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
