Abstract
当院では，血液培養陽性時の薬剤感受性検査直接法は，ボトル内容液からディスク拡散法で行っているが，最終的な結果報告には間接法で実施する必要があり，数日を要する。そこで今回，turn around time（TAT）の短縮を目的に内容液から直接自動機器による同定・感受性検査を行う方法を検討した。当院で期間中に血液培養陽性となった353件（グラム陽性球菌140件，グラム陰性桿菌213件）を対象とし，直接MicroScanWalkAway96plus（ベックマン・コールター社）で同定・薬剤感受性検査（以下迅速法）を実施した。並行して直接ディスク拡散法（以下ディスク法）を実施し，それぞれ間接法と比較した。間接法と迅速法の腸内細菌目細菌菌種名一致率は 98.0%，薬剤感受性検査結果解釈カテゴリー一致率はディスク法79.2%，迅速法94.5%で，迅速法が良好な結果を示した。薬剤別カテゴリー一致率はEscherichia coliで99%以上，Klebsiella pneumoniaeで91%以上を示した。菌種や抗菌薬により注意を要するが，単一菌検出の場合は間接法を省略し，現行より1日早く薬剤感受性検査結果報告をすることが可能であり，臨床的にも経済面でも非常に有益であるといえる。
Translated Abstract
At our hospital, the direct method of antimicrobial susceptibility testing of pathogen-positive blood cultures is performed by the disk diffusion method using the bottle culture medium. However, it is necessary to perform an indirect method to obtain the final result, and this takes several days. Therefore, to shorten the turn around time, we examined an indirect but rapid method (rapid method) for both the identification of causal microorganisms and antimicrobial susceptibility testing directly using the bottle culture medium and the autoanalyser MicroScan WalkAway 96plus (Beckman Coulter). We performed the rapid method using 353 blood culture samples (140 positive for cocci and 213 negative for bacilli) during the period at our hospital, and in parallel, we performed the direct disk diffusion method (disk method) and compared its results with those of the rapid method. About 98.0% were correctly identified by the rapid method. The categorical agreement was 79.2% for the disk method and 94.5% for the rapid method. The rapid method showed better results. The categorical agreement was ≥ 99% for Escherichia coli and ≥ 91% for Klebsiella pneumoniae. Although caution is required depending on the strain and antimicrobial agents, in the case of a single culture, the rapid method can be finished one day earlier than the current system, which is very beneficial in terms of both clinical and diagnostic aspects.
I 序文
血液培養検査は敗血症や菌血症の診断および治療において重要であり，緊急性の高い検査である。血液培養陽性時の原因微生物の同定と薬剤感受性検査の結果は，治療方針の決定と抗菌薬選択に利用されるため，特に迅速性が求められる。当院では，診断の補助として，The Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）の方法に準拠し薬剤感受性検査直接法をボトル内容液からディスク拡散法1)で行っているが，直接法では定性的な結果しか得られない。正確な感受性結果の報告にはコロニーから間接法2)として実施する必要があり，約2日間を要するのが現状である。
近年導入が増えている質量分析装置3)や自動多項目同時遺伝子関連検査システム等を用いて，菌種名同定と耐性遺伝子の検出が短時間で実施可能となったが4)，経済性，設備の問題等によりすべての施設で導入することは困難である。
そこで今回，turn around time（TAT）の短縮を目的に，迅速検査法として血液培養ボトル内容液から血清分離用試験管を用いて菌液を調製し，直接自動機器による同定・感受性試験を行う方法を検討したので報告する。
II 対象および方法
1． 対象
当院にて2020年10月から2021年11月に血液培養でグラム陽性球菌，グラム陰性桿菌が陽性となった患者検体 407件のうち，MicroScanWalkAway（以下，W/A）による迅速直接法（以下，迅速法）実施対象は，塗抹でStreptococcus sp.と推定された22件，複数菌が観察された32件を除く，単一菌と判断された353件（グラム陽性球菌140件，グラム陰性桿菌213件）とした。そのうち迅速法と間接法の比較は，塗抹でEnterococcus sp.と推測したため迅速法を実施したが，培養でStreptococcus sp.となり対象外となった5件を除く，348件（グラム陽性球菌135件，グラム陰性桿菌213件），迅速法とディスク拡散法による直接法（以下，ディスク法）の比較は，CLSI標準法に準じて実施したディスク法157件を対象とした。菌種名一致率の検討は353件を対象とした。
2． 方法
血液培養ボトルが陽転直後に，ディスク法，迅速法を並行して実施し，間接法との薬剤感受性検査結果解釈カテゴリー（以下，カテゴリー）一致率，菌種名一致率を求めた。
迅速法におけるW/Aのパネルは，グラム染色形態で選択し，腸内細菌目細菌とブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の判断が困難な場合は，生鮮標本の顕微鏡観察をし，運動性の確認から推定して選択した。
1） ディスク法
CLSI標準法に準じ，血液培養ボトル内容液を直接Mueller-Hinton寒天培地に塗布し，抗菌薬ディスク（センシディスク：日本ベクトン・ディッキンソン）を置き，35 ± 2℃大気培養，16～18時間後にディスクの阻止円直径を測定した。
2） 迅速法
血液培養ボトル内容液5 mLを血清分離用試験管（テルモ・ベノジェクトII真空採血管／滅菌品：JMDNコード35414000）に分注後3,000 rpmで10分間遠心した。デカントして上清を捨て，滅菌水を加えた後，滅菌スポイトを用いて攪拌し，3,000 rpmで10分間再遠心を行った。赤血球成分を除去し上清を捨てた後，滅菌生理食塩液を0.5～1 mL加えゆっくり振り，白濁した部分を菌液とした。菌液を滅菌試験管に移し，濁度計を用いて滅菌生理食塩液を用いてMcFarland No. 0.5の濁度に調製した。調製した菌液をプロンプトに100 μL加え，W/Aを用いて同定・薬剤感受性検査を実施した。
3） 間接法
培養翌日に形成したコロニーからW/Aにてプロンプト法で実施した。
3． 評価の分類
感性（S），中等度耐性（I），耐性（R）のカテゴリー一致の評価の分類は，迅速法およびディスク法で感性（S）に対し間接法で耐性（R）の場合をvery major error（VME），迅速法およびディスク法で耐性（R）に対し間接法で感性（S）をmajor error（ME），それぞれの方法のどちらか一方が中等度耐性（I）の場合をminor error（Mi）とした（Table 1）。
Table 1
評価の分類
| 評価の分類 |
間接法 |
|---|
| S |
I |
R |
| 迅速法／ディスク法 | S | 一致 | Mi | VME |
| I | Mi | 一致 | Mi |
| R | ME | Mi | 一致 |
迅速法／ディスク法と間接法との比較評価分類
Very major error (VME)
Major error (ME)
Minor error (Mi)
血液培養装置はBACTEC FX（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を使用した。
菌種の同定・感受性検査は，2021年7月11日までは全自動感受性分析装置MicroScanWalkAway96Plus，それ以降はMicroScanWalkAwayDxM1096（ベックマン・コールター株式会社）で実施し，グラム陽性球菌用パネルPos Combo 1J，グラム陰性桿菌腸内細菌用パネルNeg Combo EN3J，グラム陰性桿菌非発酵菌用パネルNeg Combo NF3Jを使用した。
5． 使用薬剤
微量液体希釈法およびディスク法のグラム陰性桿菌・グラム陽性球菌にはTable 2の薬剤を使用した。
Table 2
使用薬剤一覧
| 微量液体希釈法 |
ディスク法 |
| グラム陰性桿菌 |
濃度範囲（μg/mL） |
グラム陽性球菌 |
濃度範囲（μg/mL） |
グラム陰性桿菌 |
グラム陽性球菌 |
| ampicillin（ABPC） |
8–16 |
ampicillin（ABPC） |
0.12–8 |
ampicillin（ABPC） |
Staphylococcus sp. |
| piperacillin（PIPC） |
8–64 |
penicillinG（PCG） |
0.12–8 |
ampicillin/sulbactam（ABPC/SBT） |
penicillinG（PCG） |
| ampicillin/sulbactam（ABPC/SBT） |
8/4–16/8 |
oxacillin（MPIPC） |
0.25–2 |
piperacillin/tazobactam（PIPC/TAZ） |
cefoxitin（CFX） |
| piperacillin/tazobactam（PIPC/TAZ） |
16/4–64/4 |
cefoxitin（CFX） |
4 |
cefazolin（CEZ） |
Enterococcus sp. |
| cefazolin（CEZ） |
4–16 |
gentamicin（GM） |
2–8 |
cefmetazole（CMZ） |
ampicillin（ABPC） |
| cefmetazole（CMZ） |
8–32 |
minocycline（MINO） |
2–8 |
cefotaxime（CTX） |
penicillinG（PCG） |
| cefotaxime（CTX） |
1–2 |
levofloxacin（LVFX） |
0.5–4 |
ceftazidime（CAZ） |
vancomycin（VCM） |
| ceftriaxone（CTRX） |
1–2 |
sulfamethoxazole-trimethoprim（ST） |
1/19–2/38 |
cefepime（CFPM） |
|
| cefaclor（CCL） |
8–16 |
fosfomycin（FOM） |
4–16 |
aztreonam（AZT） |
|
| ceftazidime（CAZ） |
4–8 |
erythromycin（EM） |
0.5–4 |
meropenem（MEPM） |
|
| cefepime（CFPM） |
2–16 |
clindamycin（CLDM） |
0.5–2 |
|
|
| aztreonam（AZT） |
4–8 |
rifampicin（RFP） |
0.5–2 |
|
|
| imipenem（IPM） |
1–2 |
vancomycin（VCM） |
0.5–16 |
|
|
| meropenem（MEPM） |
1–2 |
teicoplanin（TEIC） |
2–16 |
|
|
| gentamicin（GM） |
2–8 |
linezolid（LZD） |
1–4 |
|
|
| amikacin（AMK） |
4–32 |
daptomycin（DAP） |
0.25–2 |
|
|
| minocycline（MINO） |
2–8 |
|
|
|
|
| levofloxacin（LVFX） |
0.5–4 |
|
|
|
|
| sulfamethoxazole-trimethoprim（ST） |
2/38 |
|
|
|
|
III 結果
1． 菌種名一致率
対象期間中に検出された菌種と一致率をTable 3に示す。Escherichia coliは115株中23株，Klebsiella pneumoniaeは46株中1株がExtended spectrum β-lactamases（ESBL）であった。Staphylococcus aureusは52株中17株がmethicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）であった。
Table 3
迅速法と間接法による検出菌と菌種名の一致率（%）
| 間接法による同定菌名 |
株数 |
一致率 |
| グラム陰性桿菌腸内細菌用パネルNeg Combo EN3J |
| Escherichia coli |
115 |
100.0 |
| Klebsiella pneumoniae |
46 |
100.0 |
| Klebsiella oxytoca |
13 |
100.0 |
| Enterobacter cloacae |
12 |
75.0 |
| Citrobacter freundii |
3 |
100.0 |
| Citrobacter koseri |
3 |
100.0 |
| Klebsiella aerogenes |
3 |
100.0 |
| Proteus mirabilis |
3 |
100.0 |
| Serratia marcescens |
2 |
100.0 |
| Citrobacter farmeri |
1 |
100.0 |
| Aeromonas caviae complex |
1 |
0.0 |
| グラム陰性桿菌非発酵菌用パネルNeg Combo NF3J |
| Pseudomonas aeruginosa |
8 |
100.0 |
| Stenotrophomonas maltophilia |
2 |
100.0 |
| Elizabethkingia meningoseptica |
1 |
0.0 |
| グラム陽性球菌用パネルPos Combo 1J |
| Coagulase-negative staphylococci |
63 |
84.1 |
| Staphylococcus aureus |
52 |
100.0 |
| Enterococcus faecalis |
11 |
100.0 |
| Enterococcus faecium |
8 |
100.0 |
| Streptococcus agalactiae |
4 |
0.0 |
| Enterococcus casseliflavus |
1 |
100.0 |
| Streptococcus salivarius |
1 |
0.0 |
菌種名不一致であった例は20件あった。そのうちの4件はグラム陰性桿菌腸内細菌用パネルで実施し，間接法でAeromonas caviae complexと同定された菌が迅速法ではAeromonas hydrophila complex 1件，Enterobacter cloacaeと同定された菌がEnterobacter intermedius 1件，Enterobacter hormaechei 2件と誤同定された。1件はブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌で，間接法でElizabethkingia meningosepticaと同定された菌がChryseobacterium indologenesと誤同定された。10件はCoagulase-negative staphylococci（CNS）で，菌種名は不一致であったが，CNSとしての一致率は100%であった。Enterococcus sp.と判断したもののうち，Streptococcus agalactiaeと誤同定されたものが4件，Streptococcus salivariusが1件であった。
2． カテゴリー一致率
グラム陰性桿菌については，間接法に対する迅速法およびディスク法の全体一致率，E. coli，K. pneumoniae，Klebsiella oxytoca，E. coli ESBLの菌種別一致率を，グラム陽性球菌については，間接法と迅速法の一致率，MRSA，methicillin-susceptible Staphylococcus aureus（MSSA），CNS，Enterococcus faecalis，Enterococcus faecium，Enterococcus casseliflavusの菌種別一致率をTable 4に示した。
Table 4
間接法と迅速法・ディスク法のカデゴリー一致率（%）
|
迅速法 |
ディスク法 |
| 件数 |
全一致
（%） |
Mi
（%） |
ME
（%） |
VME
（%） |
件数
（%） |
全一致
（%） |
Mi
（%） |
ME
（%） |
VME
（%） |
|
348（件） |
320 |
21 |
3 |
4 |
157（件） |
135 |
11 |
9 |
2 |
|
（%） |
92.0 |
6.0 |
0.9 |
1.1 |
（%） |
86.0 |
7.0 |
5.7 |
1.3 |
| グラム陰性桿菌 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| 腸内細菌 |
202 |
94.5 |
4.5 |
0.0 |
1.0 |
77 |
79.2 |
11.7 |
6.5 |
2.6 |
| E. coli |
92 |
97.8 |
2.2 |
0.0 |
0.0 |
28 |
85.7 |
7.1 |
3.6 |
3.6 |
| K. pneumoniae |
46 |
93.5 |
4.3 |
0.0 |
2.2 |
23 |
82.6 |
8.7 |
8.7 |
0.0 |
| K. oxytoca |
13 |
84.6 |
7.7 |
0.0 |
7.7 |
4 |
75.0 |
0.0 |
25.0 |
0.0 |
| E. coli ESBL |
23 |
95.7 |
8.7 |
0.0 |
0.0 |
11 |
81.8 |
18.2 |
0.0 |
0.0 |
| ブドウ糖非発酵菌 |
11 |
81.8 |
18.2 |
0.0 |
0.0 |
10 |
80.0 |
10.0 |
10.0 |
0.0 |
| グラム陽性球菌 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| Staphylococcus sp. |
115 |
90.5 |
6.1 |
1.7 |
1.7 |
|
|
|
|
|
| MRSA |
17 |
100.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
|
|
|
|
|
| MSSA |
35 |
94.3 |
2.9 |
2.9 |
0.0 |
|
|
|
|
|
| CNS |
63 |
85.7 |
9.5 |
1.6 |
3.2 |
|
|
|
|
|
| Enterococcus sp. |
20 |
85.0 |
10.0 |
5.0 |
0.0 |
|
|
|
|
|
| E. faecalis |
11 |
90.9 |
9.1 |
0.0 |
0.0 |
|
|
|
|
|
| E. faecium |
8 |
75.0 |
12.5 |
12.5 |
0.0 |
|
|
|
|
|
| E. casseliflavus |
1 |
100.0 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
|
|
|
|
|
Table 4の迅速法におけるVMEの4件はK. pneumoniaeの PIPC，K. oxytocaのPIPC，Staphylococcus epidermidisのST，S. epidermidisのABPC，PCGであった。薬剤別カテゴリー一致率をTable 5，6に示した。
Table 5
グラム陰性桿菌の薬剤別カテゴリー一致率（%）
| 薬剤名 |
E. coli |
K. pneumoniae |
K. oxytoca |
E. coli ESBL |
| ABPC |
100 |
100 |
100 |
100 |
| PIPC |
100 |
91 |
85 |
100 |
| S/A |
100 |
100 |
100 |
96 |
| T/P |
100 |
98 |
100 |
96 |
| CEZ |
100 |
100 |
100 |
100 |
| CTX |
100 |
100 |
100 |
100 |
| CAZ |
100 |
100 |
100 |
96 |
| CFPM |
100 |
100 |
100 |
96 |
| CTRX |
100 |
100 |
100 |
100 |
| CCL |
99 |
100 |
100 |
100 |
| CMZ |
100 |
98 |
100 |
100 |
| AZT |
99 |
100 |
100 |
96 |
| IPM |
100 |
100 |
92 |
100 |
| MEPM |
100 |
100 |
100 |
100 |
| GM |
100 |
100 |
100 |
100 |
| AMK |
100 |
100 |
100 |
100 |
| MINO |
100 |
100 |
100 |
96 |
| LVFX |
100 |
100 |
100 |
100 |
| ST |
100 |
100 |
92 |
100 |
Table 6
グラム陽性球菌の薬剤別カテゴリー一致率（%）
| 薬剤名 |
MRSA |
MSSA |
E. faecalis |
E. faecium |
CNS |
| ABPC |
― |
89 |
100 |
100 |
89 |
| PCG |
― |
89 |
100 |
100 |
89 |
| MPIPC |
100 |
97 |
100 |
100 |
100 |
| CFX |
100 |
100 |
100 |
100 |
98 |
| GM |
94 |
100 |
― |
― |
100 |
| MINO |
100 |
100 |
100 |
88 |
100 |
| LVFX |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
| ST |
100 |
100 |
― |
― |
100 |
| FOM |
100 |
100 |
100 |
100 |
94 |
| EM |
100 |
100 |
91 |
88 |
100 |
| CLDM |
100 |
100 |
― |
― |
100 |
| RFP |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
| VCM |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
| TEIC |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
| LZD |
94 |
100 |
100 |
100 |
98 |
| DAP |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
IV 考察
本検討において，菌種名一致率は，腸内細菌目細菌，ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌，S. aureus，Enterococcus sp.で高い一致率を示していた。菌種名が不一致であった20件のうち10件がCNSであり，CNSの菌種名一致率は他の菌種に比べ低かった。CNSの菌種名を詳細に報告する必要がある場合には，迅速法の結果で最終報告とすることは不適当であると考えられる。しかしながら，CNSとしての報告であればS. aureus，Enterococcus sp.同様，高い一致率であり報告が可能である。
また，カテゴリー一致率では，プロンプト法を用いた間接法と基準濁度法に準じた迅速法の比較になるが，間接法との一致率は従来法であるディスク法と比較し，迅速法の一致率が高かった。また，ME，VMEの評価指標としては，米国食品医薬品局（FDA）による新規の薬剤感受性検査装置に求める性能指標を用いた。これには，reference methodと比較して①カテゴリー判定の一致率が90%以上であること②major errorの割合が3%未満であること③very major error推算率で0.3～3.68%未満であること④発育不全株数が被検菌株の10%未満であることの4点が挙げられている5)。本検討において，迅速法におけるカテゴリー判定の一致率が90%を下回ったのはK. oxytoca，E. faecium，CNSであった。Chapinら6)のSensititreBroth微量希釈プレート（TREK Diagnostic Systems）を用いた検討では，全体のMEは0%，VMEは1.9%であったが，本検討の全体のMEは3/348件（0.9%），VMEは 4/348件（1.1%）であり，良好な結果を示した。
一致率が低かった菌種をそれぞれ見ると，K. oxytocaはMi，VMEが共に1/13株ずつの検出で，いずれも薬剤はPIPCのみの乖離であり，他の薬剤の一致率は良好であった。全体の一致率は84.6%であったが，検出数が少ないため今後件数を増やして評価する必要がある。同様にE. faeciumはMi，ME共に1件ずつの検出であり，検出総数自体も少なかったことが割合に影響を大きく与えたことが言える。また，薬剤はMINO，EMのみの乖離で，他の薬剤の一致率は良好であった。CNSにおいてカテゴリー一致率は，基準範囲外となり，Chapinら6)の報告同様迅速法での報告は推奨しない。他の検出菌はカテゴリー一致率，ME，VMEにおいても基準範囲内で，良好な結果を示した。今回の検討で発育不全株は認められなかった。
以上のことより，迅速法は，FDAの性能指標基準におけるカテゴリー一致率の評価において，範囲外となった菌種はあるものの良好な結果を示しており，また，ディスク法に比較しても迅速法が優れており，血液培養ボトル内容液からの直接感受性検査として妥当であると考えられた。
さらに薬剤別カテゴリー一致率においてE. coli，K. pneumoniae，E. coli ESBLは高い一致率を示しており，迅速法での報告が可能であると言える。MSSAはPCGとABPCが88.6%とやや低いが，その他の薬剤は良好な結果を示し，迅速法での報告も可能であると示唆された。CNSはABPC，PCGで一致率が低いため全体としての一致率が低く算出された。最終報告として報告するには注意が必要であるが，MPIPC，CFXの一致率は高く耐性菌の検出に関するVMEは無かった。Enterococcus sp.は，MINO，EM，CLDMがやや低いが，他の薬剤の一致率は良好であった。Chapinら6)の検討ではE. coliのPIPC，K. pneumoniaeのABPCがVMEであったが，本検討ではK. oxytocaのPIPC以外良好な結果であった。Enterococcus sp.のMINO，EM，CLDMや，K. oxytocaのPIPCは治療薬として推奨されておらず，使用される可能性が低い抗菌薬である7)。これらの点から，菌種や抗菌薬により，注意を要するものもあるが，ルーチン検査で報告している結果との乖離がなく，迅速法で報告することにより薬剤感受性検査結果報告が1日短縮できることから有用であると考えられた。
本検討における迅速法の実施は，グラム染色で完全に見分けがついていることと，発育が単一菌検出の場合であることが前提であり，塗抹で複数菌種の検出が認められた場合は，偽耐性報告のリスクを含むため，迅速法の結果で最終報告とすることはできない。また，W/Aは，一般的に用いられるプロンプト法において承認を得ており，本検討のように，迅速法を用いることによりVME頻度が高くなる可能性は否定できない。しかしながら，当院では血液培養陽性時の単一菌検出率はおよそ9割であり，報告に留意する必要はあるが，高い割合で迅速法での最終報告が可能であると言える。
V 結語
迅速法を利用することで薬剤感受性検査結果報告までの日数が約1日短縮され，臨床の診断・治療に貢献できるだけでなく，検査を行う上でも日常的に使用している装置を用いるため，実務面でも経済面でも負担が少なく実施できることは非常に有益であるといえる。
COI開示
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
文献
- 1) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI): Performance standards for antimicrobial disk Susceptibility tests. CLSI document M02-A11, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA, 2012.
- 2) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI): Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI document M07-A9, Clinical and Laboratory Standard Institute, Wayne, PA, USA, 2012.
- 3) 山田 直輝，他：質量分析器における血液培養からの直接同定法に関する基礎的検討．医学検査，2018; 67: 307–313.
- 4) 山川 壽美，他：敗血症早期診断のための検査法―迅速遺伝子検査の最前線．医学のあゆみ，2018; 267: 473–474.
- 5) US Department of Health and Human Services et al.: Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems-Class II Special Controls Guidance for Industry and FDA. https://www.fda.gov/medical-devices/guidance-documents-medical-devices-and-radiation-emitting-products/antimicrobial-susceptibility-test-ast-systems-class-ii-special-controls-guidance-industry-and-fda（2021年11月1日アクセス）
- 6) Chapin KC et al.: Direct susceptibility testing of positive blood cultures by using Sensititre broth microdilution plates. Journal of Clinical Microbiology, 2003; 41: 4751–4754.
- 7) Gilbert DN et al.：日本語版サンフォード感染症治療ガイド―アップデート版―．https://lsp-sanford.jp/sguide/index.php（2021年11月1日アクセス）
