2023 Volume 72 Issue 2 Pages 191-196
マラセチアは皮膚に常在する酵母様真菌で，癜風やマラセチア毛包炎，脂漏性皮膚炎，アトピー性皮膚炎などの起炎菌になりうる。しかしながら，脂質要求性であるため従来の培養法では分離が困難であることやマラセチア属の形態および生化学的所見は類似しており，表現形のみで菌種同定は難しく，菌種同定に至らないことが多い。菌種同定法として分子生物学的手法が用いられるが，利用できる施設が限られている。近年では，専用培地により培養することが可能となったが，マラセチアの分離状況に関する報告は少なく詳細は不明である。本研究では，専用培地で培養および分離を行い，分離頻度や分子生物学的手法による菌種同定，材料別の菌種検出状況を解析した。その結果，従来より用いられているオリーブオイル重層培地での培養と比較し，専用培地での培養では分離頻度が約9倍増加した。また，マラセチアが検出された臨床分離保存菌株43株の検体材料の内訳は，耳漏（20/43株），皮膚（10/43株），鼻腔（9/43株），気管内採痰（3/43株），眼脂（1/43株）の順で多かった。検出した全てのマラセチア属は分子生物学的手法を用いることで菌種レベルでの同定が可能であった。専用培地を用いることで菌の分離頻度が改善し，さらに分子生物学的手法を組み合わせることで菌種の同定が可能であった。今後は，培養法の更なる改善や質量分析装置を用いて，より簡便かつ迅速に同定できる方法の確立が必要と考えられる。
Malassezia is a yeast-like fungus that is endemic to human and animal skin. It can be pathogenic bacteria for various diseases such as tinea versicolor, Malassezia folliculitis, seborrheic dermatitis, atopic dermatitis, and others. Malassezia is a lipid-requiring fungus and difficult to isolate by conventional culture methods. The morphological and biochemical findings of Malassezia spp. are similar, making it very difficult to identify the species on the basis of phenotype alone. Therefore, molecular biological methods to identify fungi at the species level are used, but few laboratories are available. Recently, selective culture media have been developed, allowing for easy cultivation. However, there are only a few studies on the analysis of the isolation of Malassezia in detail. In this study, we analyzed the frequency of isolation, identification of fungi at the species level by molecular biological methods, and detection of fungi in various types of the sample using a selective culture medium. The results showed a ninefold increase in the separation frequency when using the selective medium compared with cultivation in the olive oil-stratified medium. Malassezia spp. were detected in five types of sample: otorrhea (20/43), skin (10/43), nasal swabs (9/43), sputum (3/43), and eye discharge (1/43) using 43 clinical isolates and preserved strains. All the Malassezia spp. detected were identified at the species level using molecular biological techniques. These results indicate that the selective medium increases the frequency of fungal isolation and, when combined with molecular biological techniques, identifies the species. In the future, it will be necessary to further improve the culture method and establish a simple and rapid identification method using a mass spectrometer.
マラセチアは皮膚に常在する酵母様真菌で，皮膚の感染症として癜風やマラセチア毛包炎が主な感染症として知られているが，脂漏性皮膚炎やアトピー性皮膚炎などの増悪に関与することが報告されている1)。また，癜風や脂漏性皮膚炎，アトピー性皮膚炎などの疾患で優位な菌種が明らかになっている2),3)。マラセチアは脂質要求性の菌であるため，グラム染色でマラセチア様の酵母様真菌が認められた場合，培地にオリーブオイルを加えたオリーブオイル重層培地での培養が一般的に用いられていた1)。しかし，この方法ではMalassezia restricta やM. obtusaなど発育しないマラセチアもあり分離培養が困難であった4)。このような分離培養の問題を解決するために，マラセチアの専用培地であるクロモアガーマラセチア／カンジダ培地（関東化学，東京）が発売されている。この培地の特徴は脂質や沈殿物を形成させる成分を培地に含んでおり，その特性から多くのマラセチアの分離培養やコロニーの特徴から約4菌種ほどの推定が可能とされる。しかし，17菌種に分類されるマラセチアをコロニーから同定するのは容易でない。さらに，質量分析装置でもデータベース（MALDI Biotyper 真菌のライブラリーバージョン1.0）にM. furfur，M. pachydermatisの2菌種しか登録されていないため菌種レベルでの同定は行われていないのが現状である。菌種同定法として分子生物学的手法が用いられるが，利用できる施設が限られている。また検体採取部位や材料別の菌叢解析等の報告は少なく詳細は不明である。このため，マラセチアが検出された各種臨床材料や分離された菌種を解析することは，マラセチア関連疾患の原因を明らかにするために重要と考えられる。今回，我々は当院におけるクロモアガーマラセチア／カンジダ培地使用前後の分離率の解析，分子生物学的手法による菌種同定及び材料別の菌種検出状況の解析を行ったので報告する。
2011年～2015年の期間にポアメディアカンジダGS培地（栄研化学，東京）にオリーブオイルを重層する方法で培養を行った43,328件と2016年～2021年の期間にクロモアガーマラセチア／カンジダ培地（関東化学，東京）で培養を行った51,343件の94,671件を対象とした。また各種臨床材料別のマラセチア検出頻度や菌種の分子生物学的解析には，当院でクロモアガーマラセチア／カンジダ培地を使用開始した2016年～2021年の間にマラセチアと同定した臨床分離保存菌株43株を対象とした。
2． 方法 1） 分離率の比較クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入前後でのマラセチア分離率の比較を行った。当院では血液培養よりマラセチア属が検出されていないため，血液培養を除いた総検体数を分母とし，対象の期間に分離されたマラセチアを分子として分離率を算出した。
2） 保存株の培養マラセチア属と同定した臨床分離保存株43株を用いてクロモアガーマラセチア／カンジダ培地で培養した。培養条件は35℃，5% CO2条件下で培養を行った。
3） 分子生物学的手法による菌種同定および検査材料別の検出状況の解析クロモアガーマラセチア／カンジダ培地に発育したコロニーを用いてMcFarland 0.5の菌液を調製した。作成した菌液50 μLを50 mmol/L NaOH 50 μLに加え，加熱処理後，100 mmol/L TrisHCl（pH 7.0）を100 μL加えた。その後15,500 gで2分間遠心し，その上清をPCRの鋳型として使用した。PCRは，山田らの報告をもとにリボゾームRNA（rRNA）をコードするDNAのうち，D1/D2領域に特異的にアニールするプライマーを使用した5)。D1/D2領域のプライマーはD1/D2-F（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）及びD1/D2-R（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）を使用した。PCRの条件は，98℃ 20秒加温した後，98℃ 10秒，55℃ 10秒，72℃ 30秒のステップを35サイクル実施した。得られたPCR産物は1.0%アガロースゲルで電気泳動し確認した。またPCR産物はApplied Biosystems 3500 Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific，東京）を用いた直接塩基配列決定法で解析した。得られた塩基配列はDDBJ（DNA Data Bank of Japan）のデータベースで相同性を検索した。相同性が96%以上で最も一致率の高い菌種を同定菌種とした。分子生物学的手法で得られた菌種をもとに，材料別に検出された菌種名と検出された件数を解析した。
クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入前後でマラセチアの分離比率は，クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入前の2011年～2015年では0.01%（5/43,328），クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入後の2016年～2021年では0.09%（44/51,343）であり，分離率は約9倍に増加していた（Figure 1）。
縦軸は検体数を分母としたときのマラセチアが検出された割合を示す。マラセチアの分離率はクロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入前の2011年～2015年（白）と比較し，クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入後の2016年～2021年（黒）で約9倍に増加した。
臨床から分離された44株のうち分離保存が可能であった43株をD1/D2領域を用いた塩基配列解析により同定した。その結果M. slooffiaeが17株，M. furfurが10株，M. restrictaが9株，M. sympodialisが4株，M. obtusaが2株，M. japonicaが1株同定された（Table 1）。
| No. | Closest species (D1/D2) | Matched (bp)/Reference (bp) | Matched (%) |
|---|---|---|---|
| 1 | M. slooffiae | 439/439 | 100 |
| 2 | M. slooffiae | 437/437 | 100 |
| 3 | M. slooffiae | 606/608 | 99 |
| 4 | M. slooffiae | 356/360 | 98 |
| 5 | M. slooffiae | 440/444 | 99 |
| 6 | M. slooffiae | 367/371 | 98 |
| 7 | M. slooffiae | 343/343 | 100 |
| 8 | M. slooffiae | 358/361 | 99 |
| 9 | M. slooffiae | 457/457 | 100 |
| 10 | M. slooffiae | 377/378 | 99 |
| 11 | M. slooffiae | 345/346 | 99 |
| 12 | M. slooffiae | 274/285 | 96 |
| 13 | M. slooffiae | 323/325 | 99 |
| 14 | M. slooffiae | 559/559 | 100 |
| 15 | M. slooffiae | 553/553 | 100 |
| 16 | M. slooffiae | 605/606 | 99 |
| 17 | M. slooffiae | 607/607 | 100 |
| 18 | M. furfur | 387/387 | 100 |
| 19 | M. furfur | 531/531 | 100 |
| 20 | M. furfur | 295/303 | 97 |
| 21 | M. furfur | 314/317 | 99 |
| 22 | M. furfur | 610/610 | 100 |
| 23 | M. furfur | 606/606 | 100 |
| 24 | M. furfur | 603/603 | 100 |
| 25 | M. furfur | 614/614 | 100 |
| 26 | M. furfur | 620/620 | 100 |
| 27 | M. furfur | 621/621 | 100 |
| 28 | M. restricta | 440/440 | 100 |
| 29 | M. restricta | 329/329 | 100 |
| 30 | M. restricta | 354/356 | 99 |
| 31 | M. restricta | 316/316 | 100 |
| 32 | M. restricta | 440/440 | 100 |
| 33 | M. restricta | 547/551 | 99 |
| 34 | M. restricta | 553/553 | 100 |
| 35 | M. restricta | 503/503 | 100 |
| 36 | M. restricta | 606/607 | 99 |
| 37 | M. sympodialis | 318/318 | 100 |
| 38 | M. sympodialis | 417/417 | 100 |
| 39 | M. sympodialis | 312/313 | 99 |
| 40 | M. sympodialis | 534/534 | 100 |
| 41 | M. obtusa | 361/364 | 99 |
| 42 | M. obtusa | 261/267 | 97 |
| 43 | M. japonica | 398/398 | 100 |
マラセチアは，5材料から検出された。その頻度は耳漏47%（20/43），皮膚23%（10/43），鼻腔21%（9/43），気管内採痰7%（3/43），眼脂2%（1/43）であり，耳漏からの検出が最も多かった（Figure 2）。検査材料別のマラセチアの菌種の検出状況は皮膚から4菌種，耳漏，鼻腔，気管内採痰からそれぞれ3菌種，眼脂から1菌種が検出された。皮膚からはM. furfurが，耳漏からはM. slooffiaeが最も多く検出された。また鼻腔と気管内採痰からは同様の3菌種が検出された（Table 2）。
マラセチア43株は耳漏，皮膚，鼻腔，気管内採痰，眼脂の5材料から検出された。それぞれの材料から検出された割合を円グラフで示す。
マラセチアは耳漏で47%（20株/43株），皮膚で23%（10株/43株），鼻腔で21%（9株/43株），気管内採痰で7%（3株/43株），眼脂で2%（1株/43株）検出され，耳漏からの検出が最も多かった。
| 材料 | 菌名 | 件数 |
|---|---|---|
| 皮膚 | M. furfur | 7 |
| M. restricta | 1 | |
| M. obtusa | 1 | |
| M. slooffiae | 1 | |
| 耳漏 | M. slooffiae | 16 |
| M. restricta | 3 | |
| M. obtusa | 1 | |
| 鼻腔 | M. restricta | 4 |
| M. sympodialis | 3 | |
| M. furfur | 2 | |
| 気管内採痰 | M. furfur | 1 |
| M. sympodialis | 1 | |
| M. restricta | 1 | |
| 眼脂 | M. japonica | 1 |
マラセチアは脂質要求性の菌であるため，培地にオリーブオイルを加えたオリーブオイル重層培地での培養が行われてきた。しかし，オリーブオイルを重層する方法でも菌の発育がない場合が多く，分離率の向上が課題であった4)。当院では2016年以降，マラセチアの専用培地であるクロモアガーマラセチア／カンジダ培地を用いることで，導入前のオリーブオイル重層培地と比較して分離頻度が約9倍増加していた。この理由として，専用培地はマラセチアの必須発育促進物質である牛胆汁酸，グリセリン，モノステアリン酸，Tween60，Tween40を含んでいることがあげられる。実際に，クロモアガーマラセチア／カンジダ培地はオリーブオイル重層培地で発育が困難なM. restricta，M. obtusaの発育を支持し，さらにM. slooffiae やM. sympodialisなど，McFarland 0.5より低い濃度で発育の認められない菌種の発育を支持すると報告されている4)。本研究では，オリーブオイル重層培地で分離された5株の保存菌株がなかったため詳細な解析ができなかったが，クロモアガーマラセチア／カンジダ培地はオリーブ重層培地で発育の困難なM. restricta 9株，M. obtusa 2株，M. slooffiae 17株，M. sympodialis 4株の検出率が上昇しており，これらの菌株が検出したマラセチアの74%を占めていた。専用培地への変更により従来方法では分離培養が困難なマラセチア株の分離培養が可能となり，臨床検体における起炎菌の同定に有用であると考えられた。
マラセチアが検出された材料の割合は耳漏が約47%と最も多かった。耳垢は落屑表皮が外耳道の耳垢腺，汗腺，皮脂腺の分泌物と混ざったもので，約20%は脂質であり，脂質要求性のマラセチアの発育に適した環境であることが要因として考えられる6)。耳漏から検出されたマラセチアのうち80%がM. slooffiaeであった。森川ら7)は耳垢の性状に注目し，Wet typeのヒトの外耳道で検出されたマラセチアがすべて（4/4）M. slooffiaeであったと報告している。また，Shiotaら8)は外耳道炎患者74症例のうち，5症例の起炎菌がマラセチアで，その80%（4/5症例）はM. slooffiaeであったと報告している。このことからM. slooffiaeが外耳道の常在菌であり，かつ起炎菌となり得る可能性が示唆されており今回の解析とも一致した。皮膚材料からはM. furfurが7株と最も多く検出された。M. furfurは皮膚疾患の原因となる最も一般的な菌種の一つであることが知られており本検討とも一致した9)。一方で，本院ではM. furfurが多く検出されたのに対し，Guptaらの報告10)では，健常人245人の頭皮，額，胸部，背中のマラセチアの分布を培養法で確認したところ，661株のマラセチアが検出され，そのうち376株（56.2%）がM. sympodialisで，M. furfurは40株（6.1%）であったと報告している。この理由として，ヒトの皮膚におけるマラセチアの分布は，体幹部では頭部と比較してM. sympodialisが多く検出されるなど，皮膚の採取部位によって検出されるマラセチアが異なるため優位に検出されたマラセチアが一致しなかった可能性が考えられる10)。また皮膚疾患においては癜風でM. globosa，脂漏性皮膚炎ではM. restrictaが量的に優位で，アトピー性皮膚炎，乾癬ではM. restrictaがやや優位であるなど，疾患により量的な優位菌種が異なることも明らかになっている2),3)。
鼻腔からのマラセチアの検出は，材料別で3番目に多い結果であった。菌種ではM. restrictaが最も多く分離されていた。Zhangら11)は非培養法で健常人39人の鼻腔を解析し，78.3%でM. restrictaが検出され，その他のマラセチア属は検出されなかったと報告している。またJungら12)はアレルギー性鼻炎患者と健常人4人ずつの鼻前庭を非培養法で解析し，M. restrictaが最も多く検出され，2番目はM. globosaであったと報告している。どちらの解析でもM. restrictaが最も多く検出されており，今回の解析と一致した。2番目に多く検出された菌は当院ではM. sympodialisで一致しなかったが，アレルギー性鼻炎患者と健常人2人ずつの鼻前庭からM. sympodialisが検出されたとの報告がある12)。また鼻腔のマラセチアの菌量は，健常人と比較しアレルギー性鼻炎患者で優位に高いとの報告があり，さらにマラセチアと副鼻腔炎の関係も報告されており，疾患との関連も示唆されている12),13)。気管内採痰からは鼻腔から検出された菌種と同様の3菌種が検出された。気管内採痰から検出されたマラセチアは鼻腔からの混入が考えられる。
眼脂から検出されたM. japonicaは2003年にSugitaら14)により報告された菌種で，健常人の皮膚から検出された。この菌種が皮膚疾患において重要な役割を果たすかどうかは知られていないため，今後さらなる症例の蓄積が必要と考えられる。
以上のことからマラセチアは様々な疾患に関与し，部位や疾患により菌種が異なることも明らかになってきている。このため，マラセチアを検出し菌種を同定することは適切な診断や治療につながると考えられた。またグラム染色でマラセチアを疑う菌体が認められた場合にクロモアガーマラセチア／カンジダ培地を追加することで検出率を向上させることができると考えられる。
今回の検討で専用培地および分子生物学的手法を用いることで，マラセチア種の同定が可能であることが示唆された。現在のところ遺伝子のデータベースが充実している遺伝子解析による同定が有用と考えられるが，検査に2～3日と時間を要す。このため，質量分析装置などのデータベースの拡充を行うことで簡便かつ迅速に同定できる可能性があると思われた。
本研究の限界の1つとして，本検討では，発育したマラセチアのみを対象として評価したため，グラム染色でマラセチア様の菌が認められた場合の培養での発育の有無については評価できていない点がある。クロモアガーマラセチア／カンジダ培地での培養によるマラセチアの分離率の変化をより正確に評価するためには，グラム染色でマラセチア様の菌が認められた総検体数を分母とした検討が必要である。また，本研究では，オリーブオイル重層培地で発育した菌株を保存できていないことから，オリーブオイル重層培地で検出できるマラセチアの詳細な解析が必要と考えられる。もう一つの限界は，17菌種あるマラセチアのうち今回臨床分離された菌種は6菌種のみであり全てのマラセチアを網羅できていない点である。今後，マラセチアによる感染症をより広く評価するためには，今回の解析対象以外のマラセチア菌種も検討する必要があると考えられた。
クロモアガーマラセチア／カンジダ培地導入により，オリーブオイル重層培地では検出できなかったマラセチア菌種の分離培養同定率が向上した。また，菌株の分子生物学的同定によってマラセチア菌種と感染病巣部位に特徴があることも示された。クロモアガーマラセチア／カンジダ培地によるマラセチア検出感度を高め，菌種を同定することは早期診断や治療に有用であると考えられた。
本研究は宮崎大学医学部医の倫理委員会の承認を得て遂行した（承認番号：1034）。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
