Activation of monocytes and granulocytes by stimulating antiphospholipid antibodies

Abstract

抗リン脂質抗体症候群（antiphospholipid syndrome; APS）は，患者血中に抗リン脂質抗体群（antiphospholipid antibodies; aPLs）が出現することにより，動・静脈血栓症や妊娠合併症など多彩な合併症を発症する自己免疫疾患であるが詳細な病態発症機序は未だ解明されていない。本研究では，患者血漿から精製したIgG-aPLsを用いて血栓形成や血管炎症に関与する単球及び顆粒球にaPLsがどのような作用を及ぼすか検討した。その結果，単球をIgG-aPLs存在下で培養することでCD14+/CD16+活性化単球の割合が増加することを確認した。さらに，炎症マーカーである顆粒球表面CD44抗原の強陽性分画及びCD44 v6発現が増強することを見出した。加えて，IgG-aPLs刺激により，顆粒球の各種基質（fibronectinやcollagen I・IV）への接着性が増すことを確認した。CD14+/CD16+単球は炎症性疾患や自己免疫疾患と関連が深いことが報告されており，IgG-aPLs刺激によるCD14+/CD16+単球の増加がAPSの病態形成に関与している可能性が示唆された。さらに，顆粒球はIgG-aPLs刺激により炎症状態が惹起されることに加え，生体内では血管内皮細胞などへの接着能も増し，血栓へ向かう“向血栓傾向”を有するようになると推測される。

Translated Abstract

Antiphospholipid syndrome (APS) is an autoimmune disorder characterized by arterial/venous thrombosis or pregnancy complications caused by the appearance of antiphospholipid antibodies (aPLs). The presence of aPLs apparently constitutes a risk factor for arterial and/or venous thrombotic complications. However, the precise mechanisms underlying thrombotic complications in these patients have not yet been elucidated. In this study, we investigated the effects of IgG-aPLs on monocytes and granulocytes associated with thrombus formation and vascular inflammation by evaluating cell surface and cell adhesion. As a result, we found that the percentage of activated monocytes (CD14+/CD16+) was significantly increased by IgG-aPL stimulation compared with no stimulation. In addition, we confirmed the granulocyte surface CD44 expression after IgG-aPL stimulation. There was no significant change in the percentage of CD44-positive cells, but the percentages of granulocytes expressing CD44 v6 and overexpressing CD44 were increased by IgG-aPL stimulation. Moreover, IgG-aPL stimulation enhanced the adhesion of granulocytes to the extracellular matrix (fibronectin, collagen I, and collagen IV). We found that the presence of IgG-aPLs increases the percentage of activated monocytes associated with inflammatory and autoimmune diseases. CD14+/CD16+ monocytes may be involved in the pathogenesis of APS. We also found that IgG-aPLs may promote the inflammatory responses of granulocytes and their adhesion to vascular endothelial cells. These findings suggest that aPLs may induce the inflammatory responses of vascular endothelial cells and provide a scaffold for thrombus formation. Furthermore, granulocytes may have a “prothrombotic tendency” toward thrombus through their increased adhesive ability to vascular endothelial cells in vivo, in addition to the inflammatory state induced by IgG-aPL stimulation.

I　 はじめに

抗リン脂質抗体症候群（antiphospholipid syndrome; APS）は，患者血中にリン脂質に関連する自己抗体である抗リン脂質抗体群（antiphospholipid antibodies; aPLs）が出現することにより，動・静脈血栓症や妊娠合併症など多彩な合併症を発症する自己免疫疾患である^1)～3)。

APSに関連する血栓性病態は極めて多彩であり，動脈血栓症では脳梗塞や一過性脳虚血発作などの脳血管障害が最も多く，動脈血栓症全体の約80%を占めている⁴⁾。一方，静脈血栓症では下肢深部静脈血栓症が最も多く，しばしば肺塞栓症を併発する⁴⁾。このようにAPSでは動脈・静脈を問わずに血栓塞栓症を繰り返し発症するが，詳細な血栓症発症機序は未だ解明されていない。

本研究では，血管炎症に関連する単球及び顆粒球に対してaPLsが及ぼす作用を検討した。

まず，血栓性合併症との関連が強く示唆されている⁵⁾抗カルジオリピン/β₂-グリコプロテインI抗体（anti-cardiolipin/β₂-glycoprotein I antibodies; aCL/β₂GPI）及び抗ホスファチジルセリン／プロトロンビン抗体（anti-phosphatidylserine/prothrombin antibodies; aPS/PT）を用いた単球株（THP-1）培養実験系にて，CD14/CD16サブセット解析を行い，抗体刺激によりCD14+/CD16+活性化単球の割合が増加するか検討した。

さらに，近年炎症マーカーとして注目されており，細胞間相互作用や細胞接着及び移動に関与する細胞表面糖タンパク質である「CD44」に着目し^6),7)，aPLs刺激後の各種白血球表面CD44発現並びに顆粒球表面CD44 v6の比率を評価するとともに，CD44と関連のある各種基質（fibronectin・Collagen I・Collagen IV）への接着性が増すか検討した。

II　 材料と方法

1． IgG-aPLsの精製

MAbTrap^TM Kit（GE Healthcare, USA）を用いて，APS患者血漿からIgG-aPLsを精製した。

2． 末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell; PBMC）の分離

BDバキュティナ^®CPT^TM単核球分離用採血管（Becton Dickinson, USA）に6名の健常人末梢静脈血を採血し，遠心した（1,700 g 15 min）。遠心後，単核球層を回収・洗浄し，10%ウシ胎児血清（fetal bovine serum; FBS）含有RPMI 1640培地（Life Technologies, USA）に再浮遊させた。細胞数を調整後，6 wellプレート（Falcon, USA）に播種し（1 × 10⁶個/well），1.5 h静置した（37℃・5% CO₂）。

3． 末梢血多核白血球（polymorphonuclear cell; PMNC）の分離

分離剤Polymorphprep^TM（SEW, Germany）5.0 mLにヘパリンを用いて抗凝固処理した健常人末梢血5.0 mLを重層後，遠心分離した（500 g 30 min）。遠心後，多核顆粒球層を回収し，溶血処理と洗浄操作を行い，10% FBS含有RPMI 1640培地に再浮遊させた。細胞数を調整後，プレートに播種し（2 × 10⁵個/well），1 h静置した（37℃・5% CO₂）。

4． aPLs刺激による単球活性化作用の検討

T-75フラスコ（Falcon, USA）よりTHP-1（ATCC, USA）を回収し，プレートに播種した（2 × 10⁵個/well）。播種後1 h静置し（37℃・5% CO₂），THP-1を3種類のIgG-aPLs（A–C）（Table 1）にて6 h刺激した（37℃・5% CO₂）。コントロールとして無刺激を置いた。無刺激とは，IgG-aPLsの代わりに10% FBS含有RPMI 1640培地を添加したものである。

Table 1  各種IgG-aPLsのAPS患者血清中の力価

	aCL/β2GPI [U/mL]	aPS/PT [U/mL]
A	87.45 (+)	17.3 8 (+)
B	158.40 (+)	−
C	−	12.5 (+)
D	632.10 (+)	1,234.0 (+)
E	13.28 (+)	17.86 (+)
F	19.91 (+)	−
G	156.80 (+)	48.30 (+)
H	53.47 (+)	−
I	13.49 (+)	11.73 (+)
J	34.37 (+)	26.32 (+)

刺激終了後，THP-1を回収・遠心し（300 g 5 min），1%ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin; BSA）溶液100 μLに再浮遊させたものをCD14-PE（Miltenyi Biotec, Germany）及びCD16-FITC（Miltenyi Biotec, Germany）を用いて染色した（4℃・遮光15 min）。染色後，OptiLyse C（Beckman Coulter, USA）500 μLを添加し，固定・溶血処理を行った（室温・遮光10 min）。遠心後上清を除去し，0.1%ホルマリン500 μLに再浮遊させ，MACSQuant^® Analyzer 10 Flow Cytometer（Miltenyi Biotec, Germany）を用い，CD14/CD16サブセット解析を行った。

5． 白血球表面抗原（CD44・CD44 v6）の解析

PBMC並びにPMNCを6種類のIgG-aPLs（D–I）（Table 1）にて，PBMCは6 h，PMNCは2 h刺激した（37℃・5% CO₂）。刺激終了後，PBMC及びPMNC浮遊液を遠心し（300 g 5 min），1% BSA 100 μLに再浮遊させたものをCD44-APC（Miltenyi Biotec, Germany）を用いて染色した（4℃・遮光15 min）。染色後，OptiLyse C 500 μLを添加し，固定・溶血させた（室温・遮光10 min）。遠心後上清をアスピレートし，0.1%ホルマリン500 μLに再浮遊させ，単球・顆粒球・リンパ球表面のCD44陽性細胞比率をフローサイトメトリー（FCM）解析した。

さらに，PMNCを3種類のIgG-aPLs（G・I・J）（Table 1）にて刺激した。コントロールとして無刺激を置いた。同様に遠心・染色後，顆粒球表面のCD44 v6陽性細胞比率をFCM解析した。

6． 顆粒球の各種基質への接着性の検討

分離剤Polymorphprep^TM 5.0 mLにヘパリンを用いて抗凝固処理した健常人末梢血5.0 mLを重層後，遠心分離した（500 g 30 min）。遠心後，多核顆粒球層を回収し，溶血処理と洗浄操作を行い，無血清RPMI 1640培地に再浮遊させた。各種基質への接着性は，CytoSelect^TM 48-well Cell Adhesion Assay（CBL, USA）を用いて検討した。まず細胞数を調整後，cell adhesion assay plate（CBL, USA）に播種し（2 × 10⁵個/well），1 h静置した（37℃・5% CO₂）。静置後，6種類のIgG-aPLs（D–I）（Table 1）を添加し2 h刺激した（37℃・5% CO₂）。

刺激終了後，各ウェルから上清を吸引除去し，PBSにて洗浄した。続いて，細胞染色溶液（CBL, USA）で染色し（室温10 min），脱イオン水にて洗浄した。洗浄後，ウェルを乾燥させ，抽出溶液（CBL, USA）を加えた後（振盪10 min），cell adhesion assay plateから96 well polysoap plate（Nunc, Denmark）に各サンプルを移し，吸光度を測定した（OD 560 nm）。

7． 統計解析

統計解析には統計解析ソフト（StatFlex ver. 7）を用いて解析した。

8． 倫理審査

本研究は，山口大学大学院医学系研究科保健学専攻医学系研究倫理審査委員会の承認（管理番号：617）を得て実施した。

III　 結果

1． aPLs刺激による単球活性化作用の検討

THP-1を3種類のIgG-aPLs（A–C）にて刺激し，CD14/CD16サブセット解析を行った。その結果，無刺激に比較してIgG-aPLs刺激でCD14+/CD16+活性化単球の割合が有意に増加することを確認した（Figure 1）。活性化単球の割合はaCL/β₂GPI，aPS/PTがそれぞれsingle positiveであるIgGに比較して，両抗体がdouble positiveであるIgGで刺激した場合に顕著に増加することが示された。

Figure 1 抗リン脂質抗体刺激による単球活性化作用の検討

THP-1をIgG-aPLs（A–C）にて刺激し，THP-1表面のCD14/CD16サブセット解析を行った。無刺激に比較してIgG-aPLs刺激でCD14+/CD16+活性化単球の割合が有意に増加することを確認した。

Mann-Whitney test：*¹無刺激vs. aPS/PT⁺-IgG，p < 0.05；*²無刺激vs. aCL/β₂GPI⁺-IgG，p < 0.001；*³無刺激vs. aCL/β₂GPI⁺/aPS/PT⁺-IgG，p < 0.001

aPLs：抗リン脂質抗体群，aCL/β₂GPI：抗カルジオリピン/β₂-グリコプロテインI抗体，aPS/PT：抗ホスファチジルセリン／プロトロンビン抗体

2． 白血球表面抗原CD44のFCM解析

6種類のIgG-aPLs（D–I）を用いて，健常人6名のPBMC及びPMNCを刺激し，刺激後の各種白血球表面CD44陽性細胞比率をFCM解析した。その結果，無刺激時と比較してIgG-aPLs刺激時に，単球ではCD44陽性細胞比率が有意に減少し，リンパ球では陽性細胞比率に変化はみられなかった（Figure 2）。顆粒球も同様に検討した結果，CD44陽性細胞比率に変化はなかったが，CD44強陽性細胞比率が有意に増加していた（Figure 2, 3）。

Figure 2 抗リン脂質抗体刺激による各種白血球表面CD44陽性細胞比率の解析

IgG-aPLs（D–I）を用いて健常人6名のPBMC及びPMNCを刺激した。刺激後の各種白血球表面CD44陽性細胞比率をFCM解析にて評価した結果，IgG-aPLs刺激で単球表面CD44陽性細胞比率が有意に減少し，リンパ球では陽性細胞比率に変化はみられなかった。顆粒球ではCD44陽性細胞比率に変化はなかったが，強陽性細胞比率が有意に増加していた。

Mann-Whitney test：*1 無刺激vs. IgG-aPLs（D–I），p < 0.001；*2 無刺激vs. IgG-aPLs（D），p < 0.01；*3 無刺激vs. IgG-aPLs（E–I），p < 0.005

aPLs：抗リン脂質抗体群

Figure 3 抗リン脂質抗体刺激による顆粒球表面CD44発現量の変化

顆粒球をIgG-aPLs（D–I）にて刺激したところ，CD44陽性分画より蛍光強度が強いCD44強陽性分画を確認した。

aPLs：抗リン脂質抗体群

3． 顆粒球表面抗原CD44 v6のFCM解析

3種類のIgG-aPLs（G・I・J）を用いて健常人6名のPMNCを刺激し，顆粒球表面CD44 v6陽性細胞比率をFCM解析した。その結果，無刺激時と比較してIgG-aPLs刺激時に，CD44 v6陽性細胞比率が有意に増加していることを確認した（Figure 4）。

Figure 4 抗リン脂質抗体刺激による顆粒球表面CD44 v6陽性細胞比率の解析

IgG-aPLs（G・I・J）を用いて健常人6名のPMNCを刺激し，CD44 v6発現量をFCM解析した。無刺激と比較して，IgG-aPLs刺激で顆粒球表面のCD44 v6陽性細胞比率が有意に増加した。

Mann-Whitney test：*¹無刺激vs. IgG-aPLs（G），p < 0.005；*²無刺激vs. IgG-aPLs（I），p < 0.005；*³無刺激vs. IgG-aPLs（J），p < 0.005

aPLs：抗リン脂質抗体群

4． 顆粒球の各種基質への接着性の検討

顆粒球をIgG-aPLsにて刺激することにより，CD44と関連のある基質への接着性が増すかcell adhesion assay kitを用いて検討した。刺激には「2. 白血球表面抗原CD44のFCM解析」で用いたものと同様のIgG-aPLs（D–I）を使用した。検討の結果，non-APS IgG刺激に比較して，IgG-aPLs刺激により顆粒球のfibronectin，collagen I，collagen IVへの接着性が増すことを確認した（Figure 5）。

Figure 5 顆粒球の各種基質への接着性の検討

顆粒球をIgG-aPLs（D–I）にて刺激することにより，CD44と関連のある基質への接着性が増すかcell adhesion assay kitを用いて検討した。non-APS IgG刺激に比較して，IgG-aPLs刺激により顆粒球のfibronectin，collagen I，collagen IVへの接着性が増すことを確認した。

aPLs：抗リン脂質抗体群

IV　 考察

当研究室では，IgG-aPLsが単球に作用することにより，外因系凝固のトリガーとなる細胞表面組織因子（tissue factor; TF）の発現を亢進させるとともに，IL-1β・IL-6・TNF-α等の炎症性サイトカイン産生を促進させることを明らかにしてきた^5),8)。

本研究では，実際に単球が活性化状態にあるかを検討すべく，単球細胞株THP-1をIgG-aPLsにて刺激し，単球のCD14/CD16サブセット解析を行った。CD14抗原並びにCD16抗原がともに陽性である活性化単球はTNF産生量が多く，炎症性疾患や自己免疫疾患と関連が深いことが報告されている^9),10)。本検討より，無刺激に比較してIgG-aPLs刺激でCD14+/CD16+活性化単球の割合が有意に増加することを確認した。活性化単球の割合はaCL/β₂GPI及びaPS/PTがsingle positiveであるIgGに比較して，両抗体がdouble positiveであるIgGで刺激した場合に顕著に増加することが示された。実際，aCL/β₂GPI・aPS/PT-double positive症例で血栓症発症（再発）が多いことが報告されており¹¹⁾，IgG-aPLsが単球を活性化に導くことにより，種々の炎症反応（単球表面TF発現亢進・炎症性サイトカインの産生促進など）や血栓形成作用を惹起することで，APSの病態形成に関与している可能性が示唆された。

また本研究では，単球以外の白血球（顆粒球・リンパ球）に対してaPLsが及ぼす作用を検討した。IgG-aPLsにて顆粒球を刺激したところ，無刺激と比較して，細胞表面CD44強陽性細胞比率及びCD44 v6陽性細胞比率が有意に増加することを確認した。CD44は近年炎症マーカーとして注目されており，細胞間相互作用や細胞接着及び移動に関与する細胞表面糖タンパク質である^6),7)。CD44のアイソフォームであるCD44 v6は，癌細胞の悪性化・転移との相関や炎症性疾患との関連が知られている^7),12)。したがって，IgG-aPLs刺激により顆粒球の活性化が惹起されている可能性が高いことが示された。

さらに，non-APS IgG刺激に比較して，IgG-aPLs刺激により顆粒球のfibronectin，collagen I，collagen IVへの接着性が増すことを確認したことから，aPLsの存在は顆粒球の他細胞への接着性を増加させる作用があると推測した。ただし，保有するaPLsの組み合わせや力価により，接着性が増す因子が異なることが示唆されたため，aPLsと接着因子の関連に関してはさらなる検討が必要であると考える。

これらの知見と研究成果を結びつけて考えると，顆粒球はIgG-aPLs刺激により炎症が惹起されることに加え，接着因子（fibronectin・collagen I・collagen IV）を介して血管内皮細胞などに接着することにより局所炎症を引き起こし，血栓へ向かう“向血栓傾向”を有するようになると推測される。

V　 結語

APS患者における血栓症発症機序は未だ解明されていない部分も多い。抗リン脂質抗体が単球や顆粒球へ及ぼす影響を詳細に解明し，それら炎症細胞と血管内皮細胞の相互作用を明らかにすることができれば，抗リン脂質抗体による血栓症発症機序の解明に繋がることが期待できる。本研究成果が，APS病態解明の一助となれば幸いである。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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