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Evaluation of an antimicrobial susceptibility testing system for Aerococcus urinae using DPS192iX
2023 Volume 72 Issue 4 Pages 557-561
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2023 Volume 72 Issue 4 Pages 557-561
Aerococcus urinaeの薬剤感受性試験に関する検討報告は少ない。本検討ではA. urinae 38株及び精度管理用標準菌株2株を対象とし，DPS192iXおよび対照法としたフローズンプレート‘栄研’（栄研化学）により各抗菌薬のMICを測定，その一致率を検討した。全抗菌薬におけるMICの±1管差以内の一致率（±1 Essential agreement; ±1 EA）は94.3%（85.7～100%），カテゴリー判定一致率（category agreement; CA）は97.1%（85.7～100%）であったが，ceftriaxoneとlinezolidで±1 EA が90%未満，levofloxacinでCAが90%未満であった。Minor errorはceftriaxone 2.9%，ciprofloxacin 8.6%，levofloxacin 14.3%，Major errorおよびVery major errorは認められなかった。A. urinaeにおけるDPS192iXの自動判定を用いた薬剤感受性試験は多くの抗菌薬で参照法との良好な一致率を示したが，フルオロキノロン系抗菌薬やceftriaxone，linezolidなど一部の抗菌薬では，さらなる検討が必要であると考えられた。
In this study, we evaluated the clinical usefulness of an automated antimicrobial susceptibility testing system (DPS192iX, Eiken Chemical Co. Ltd.) for Aerococcus urinae. MICs for nine antimicrobial agents, whose breakpoints were defined in CLSI M45 3rd Edition, were measured using DPS192iX for 38 A. urinae strains isolated and stored in the University of the Ryukyus Hospital between 2014 and 2020 and two ATCC strains, Streptococcus pneumoniae ATCC49619 and A. urinae ATCC51268. Results were compared with MICs determined by a reference method using frozen plates (Eiken Chemical Co., Ltd.). Overall, the ±1 essential agreement (±1 EA) and category agreement (CA) were 94.3% and 97.1%, respectively, whereas the ±1 EA or CA for several agents was less than 90% (±1 EA for ceftriaxone was 85.7%, that for linezolid was 88.6%, and CA for levofloxacin was 85.7%). The minor errors for ciprofloxacin and levofloxacin were 8.6% and 14.3%, respectively, but we did not observe a major error or a very major error. From these observations, the antimicrobial susceptibility testing system DPS192iX is considered useful for A. urinae, although further evaluation is required for several antimicrobial agents such as fluoroquinolones, ceftriaxone, and linezolid.
Aerococcus urinaeは尿路感染症の原因微生物の一つであり，高齢者や前立腺肥大症，尿道カテーテル留置などの尿路感染症の素因を持つ患者から分離されることが多いが，時に血流感染症や感染性心内膜炎など重篤な感染症を引き起こすことが報告されている1)。Aerococcus属菌は5%ヒツジ血液寒天培地上にて35℃，5% CO2条件下で培養した際の集落が溶血性連鎖球菌様の形態を示し，他菌種に比べ比較的発育が遅いことから，尿培養検査で見逃されることや他の菌種と誤認されることがある。近年，微生物検査領域にマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析装置（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer; MALDI-TOF MS）が導入されA. urinaeをはじめとするAerococcus属菌の菌種同定検査に要する時間は短縮され，精度も向上している1)。一方，Aerococcus属菌の薬剤感受性検査は5% CO2条件下で実施する必要があることから全自動薬剤感受性装置で測定することは困難とされている2)。A. urinaeは尿路感染症における治療抗菌薬としての使用頻度が高いlevofloxacin（LVFX）に対して，耐性を示す菌株が16%程度存在するとの報告もあり3)，正確な薬剤感受性検査の結果報告が求められる。A. urinaeの薬剤感受性検査に関しては，抗菌薬ディスクやEtest（bioMérieux）等の濃度勾配ストリップを用いた用手法を検討した報告はあるものの4),5)，自動薬剤感受性装置を検討した報告は我々が検索する限り認められない。用手法での薬剤感受性検査は検査者の手技や目視での最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration; MIC）判定の際に主観的な判断が影響する可能性がある。よって，今回，自動撮影で客観的な判定が可能な微生物感受性分析装置DPS192iX（栄研化学）を用いたA. urinaeの薬剤感受性検査の検討を行ったので報告する。
既知のA. urinae菌株としてA. urinae ATCC 51268，およびCLSI M45 3rd Editionにて精度管理用菌株として定められているStreptococcus pneumoniae ATCC 496192)各1株を使用した。それぞれ添付書記載の方法で培養した。
2． 臨床分離株2014年から2020年の期間に当院検査・輸血部にて尿検体もしくは血液培養検体より分離され，質量分析装置VITEK MS（bioMérieux）にてA. urinaeと同定・保管された臨床分離株38株を用いた。保存菌株は5%トリプチケースソイヒツジ血液寒天培地（日本BD）を用いて，2代継代培養（5% CO2，35℃/18時間）した集落を用いた。
3． 薬剤感受性試験DPS192iXおよび対照法としたフローズンプレート‘栄研’を用いた薬剤感受性試験は添付文書に準拠して行い，それぞれの株について臨床分離株は1回，ATCC株は5回測定を行った。
1） DPS192iX菌集落から0.45%滅菌食塩水にてMcFarland No. 0.5に調製した菌液25 μLをミューラーヒントンブイヨン‘栄研’（栄研化学）12 mLに加え，均等に浮遊させて接種用菌液とした。接種用菌液を付属のFunDropperを用いて，ドライプレート‘栄研’EP24（栄研化学）の各ウェルに50 μL接種後，5% CO2環境下にて35℃，24時間培養した。培養後のプレートをDPS192iXに装填し，MICの判定を行った。菌の発育状況はDPS192iXにより自動撮影・判定された画像および薬剤感受性プレートを目視確認し，気泡やウェル裏面の傷などが認められるウェルは偽陽性と判断した。
2） フローズンプレート‘栄研’（対照法）菌集落から0.45%滅菌食塩水にてMcFarland No. 1に調製した菌液1 mLを0.45%滅菌食塩水に加え，均等に浮遊させて接種用菌液とした。トランスファーセット（stem）を用いてフローズンプレート‘栄研’（栄研化学）に菌液を接種し，5% CO2環境下にて35℃，24時間培養後，MICを目視判定した。肉眼的にウェルの混濁または直径1 mm以上の沈殿が認められた場合，あるいは沈殿物の直径が1 mm未満であっても沈殿塊が2個以上認められた場合は発育陽性とした。
3） 対象薬剤CLSI M45 3rd EditionにてA. urinae ATCC 51268に対するブレイクポイントが設定されているpenicillin（PCG），cefotaxime（CTX），ceftriaxone（CTRX），meropenem（MEPM），ciprofloxacin（CPFX），LVFX，sulfamethoxazole/trimethoprim（ST），vancomycin（VCM），linezolid（LZD）の9薬剤とした2)。
なお，in vivoにおけるA. urinaeのST合剤の効果は尿中葉酸濃度の影響を受けるため，報告すべきではないとされているが2)，今回は薬剤感受性試験の検討のため集計を行った。
4） 評価方法DPS192iXで得られたMICを対照法であるフローズンプレート‘栄研’のMICと比較し，MICの±1管差以内のMIC一致率（±1 essential agreement; ±1 EA）と，MICが対照法に対して上方か下方の一方向に偏りがあるかを判断するBiasを求めた。国際標準化機構（International Organization for Standardization; ISO）20776（2nd edition）にて定められた臨床検査室における薬剤感受性装置の性能基準である±1 EA 90%以上，またBias ±30%以内であることを6)を満たすか判定した。
さらに，各抗菌薬に対するカテゴリー判定［感性（S）および中等度耐性（I），耐性（R）］からカテゴリー一致率（category agreement; CA）を算出し，DPS192iXが感性かつ対照法が耐性の場合をvery major error（VME），DPS192iXが耐性かつ対照法が感性の場合をmajor error（ME），DPS192iXまたは対照法が中等度耐性で，かつ他法が感性または耐性の場合をminor error（MiE）とした。米国食品医薬品局（food and drug administration; FDA）にて定められたVMEおよびME 3%以下，発育不全株数が被検菌株の10%未満であること7)を満たすか判定した。
S. pneumoniae ATCC 49619のQC Rangeに対する一致率はCTX，CTRX，CPFX，LVFX，VCM，LZDでは100%，PCG，MEPM，STでは80%（4/5）であった（Table 1）。また，QC RangeからMICが逸脱した株のMICはすべてQC Rangeの上限または下限から一管差以内であった。
| Antimicrobial agents | Out of ranges | QC Range agreement |
|---|---|---|
| PCG | 20 (1) | 80 (4) |
| CTX | 0 (0) | 100 (5) |
| CTRX | 0 (0) | 100 (5) |
| MEPM | 20 (1) | 80 (4) |
| VCM | 0 (0) | 100 (5) |
| CPFX | 0 (0) | 100 (5) |
| LVFX | 0 (0) | 100 (5) |
| ST | 20 (1) | 80 (4) |
| LZD | 0 (0) | 100 (5) |
Percent of a total (five determinations) is presented. Number of the determination is shown in parenthesis.
PCG: Penicillin G, CTX: Cefotaxime, CTRX: Ceftriaxone, MEPM: Meropenem, VCM: Vancomycin, CPFX: Ciprofloxacin, LVFX: Levofloxacin, ST: Sulfamethoxazole-Trimethoprim, LZD: Linezolid
A. urinae ATCC 51268では，評価対象抗菌薬のうちPCG，CTX，CTRX，MEPM，VCM，CPFX，LVFXのMICはすべて±1管差以内であった（±1 EA: 100%）。一方，ST及びLZDの±1 EAは80%（4/5）であった。CAは測定したすべての抗菌薬で100%であり，A. urinae ATCC 51268のQC Rangeは設定されていないものの，5回測定で得られたMICは概ね収束していた（Table 2）。
| Antimicrobial agents | ±1 EA | CA | MiE | ME | VME |
|---|---|---|---|---|---|
| PCG | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| CTX | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| CTRX | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| MEPM | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| VCM | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| CPFX | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| LVFX | 100 (5) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| ST | 80 (4) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| LZD | 80 (4) | 100 (5) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
Percent of a total (five determinations) are presented. Number of the determination is shown in parenthesis.
PCG: Penicillin G, CTX: Cefotaxime, CTRX: Ceftriaxone, MEPM: Meropenem, VCM: Vancomycin, CPFX: Ciprofloxacin, LVFX: Levofloxacin, ST: Sulfamethoxazole-Trimethoprim, LZD: Linezolid, MIC: minimum inhibitory concentration, EA: essential agreement, CA: category agreement
MiE: Minor error, Intermediate in DPS192iX, but susceptible or resistant in reference method, or vise versa.
ME: Major error, Resistant in DPS192iX, but susceptible in reference method.
VME: Very major error, Susceptible in DPS192iX, but resistant in reference method.
DPS192iXの自動判定結果と目視判定結果のMICに乖離が無いか確認を行った。CTRXのMIC判定で臨床分離株において1株乖離（目視判定MIC：< 0.06 μg/mL，自動判定MIC：0.25 μg/mL）が認められた。しかしながら，他の抗菌薬では自動判定と目視判定のMICに乖離は認めず，さらにカテゴリー判定に影響はなかった。
臨床分離株における±1 EAは85.7～100%，CAは85.7～100%であり，MiEはCTRX 2.9%（1株），CPFX 8.6%（3株），LVFX 14.3%（5株）で認められた（Table 3）。MEおよびVMEは認められなかった。また，臨床分離株のBiasは−36.7～+38.2%であり，CTRXとLZDのみが規格合格となる±30%から逸脱した（CTRX −36.7%, LZD +38.2%, Table 3）。
| Antimicrobial agents | Agreement with reference MIC*1 | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| −3 | −2 | −1 | 0 | +1 | +2 | +3 | ±1 EA*2 | CA*2 | MiE*2 | ME*2 | VME*2 | Bias (%) | |
| PCG | 0 | 0 | 0 | 34 | 1 | 0 | 0 | 100 (35) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | +2.9 |
| CTX | 0 | 1 | 2 | 26 | 5 | 1 | 0 | 94.3 (33) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | +20.4 |
| CTRX | 1 | 0 | 11 | 14 | 5 | 4 | 0 | 85.7 (30) | 97.1 (34) | 2.9 (1) | 0 (0) | 0 (0) | −36.7 |
| MEPM | 0 | 0 | 0 | 31 | 4 | 0 | 0 | 100 (35) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | +11.4 |
| VCM | 0 | 0 | 8 | 25 | 2 | 0 | 0 | 100 (35) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | −18.5 |
| CPFX | 0 | 0 | 3 | 27 | 3 | 0 | 2 | 94.3 (33) | 91.4 (32) | 8.6 (3) | 0 (0) | 0 (0) | +1.5 |
| LVFX | 0 | 0 | 1 | 27 | 5 | 1 | 1 | 94.3 (33) | 85.7 (30) | 14.3 (5) | 0 (0) | 0 (0) | +17.9 |
| ST | 0 | 2 | 10 | 11 | 11 | 1 | 0 | 91.4 (32) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | −22.9 |
| LZD | 0 | 0 | 4 | 12 | 15 | 4 | 0 | 88.6 (31) | 100 (35) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | +38.2 |
PCG: Penicillin G, CTX: Cefotaxime, CTRX: Ceftriaxone, MEPM: Meropenem, VCM: Vancomycin, CPFX: Ciprofloxacin, LVFX: Levofloxacin, ST: Sulfamethoxazole-Trimethoprim, LZD: Linezolid, MIC: minimum inhibitory concentration, EA: essential agreement, CA: category agreement
*1Number of isolates according to the matched doubling dilution MICs from the reference method is shown. *2Percent of a total is presented. Number of isolates is shown in parenthesis.
MiE: Minor error, Intermediate in DPS192iX, but susceptible or resistant in reference method, or vise versa.
ME: Major error, Resistant in DPS192iX, but susceptible in reference method.
VME: Very major error, Susceptible in DPS192iX, but resistant in reference method.
これらの集計は発育不全株3株を除いて行った。
DPS192iXは腸内細菌目細菌など発育の旺盛な菌種においては従来のドライプレート（栄研化学）とほぼ同等の成績が得られることが報告されている8)。しかし，CLSI M45 3rd Editionに掲載されている栄養要求性の厳しい菌種における薬剤感受性試験に関する評価は十分ではないことから，今回，DPS192iXを用いてA. urinaeの薬剤感受性検査の検討を行った。
本検討におけるA. urinae（臨床分離株，n = 35）の±1 EAは94.3%であったものの，CTRXでは±1 EA 85.7%，LZDでは±1 EA 88.6%とISO20776-2やFDAの基準を下回った（Table 3）。また，±1 EAが90%を下回ったCTRXではBiasが−37%，LZDではBiasが+38%と基準である±30%を逸脱していた（Table 3）。感受性プレートのウェルの形状の違いやウェルの容量が50 μLであることがウェル中での菌集塊の形成過程に差を生じA. urinaeの発育に影響を及ぼした可能性が考えられたが，詳細は不明である。また，全体のCAは97.1%であり，LVFXでは14.3%（5株），CPFXでは8.6%（3株）のMiEが見られたものの，VMEやMEはなく，概ね良好な結果が得られた。本検討において，CPFXのMiEは8.6%（3株），LVFXのMiEは14.3%（5株）と他の抗菌薬と比べ，比較的高値であった。A. urinaeのCPFXやLVFXの薬剤感受性測定時にはトレーリング発育がみられる株が存在するという報告4)もあるが，本検討ではトレーリング発育は確認されなかった。これらの要因としても前述した感受性プレートのウェルの形状やウェルの容量が考えられたが，直接的な要因は明らかにできなかった。
本検討において，A. urinaeを対象としたDPS192iXの薬剤感受性試験は全体としては良好な成績を示したが，CTRXやLZD，LVFXなど一部の抗菌薬については判定に注意を要することが示唆された。また，本検討の制限事項として，検討に用いた菌株数が少ないことが挙げられるため，A. urinaeにおけるDPS192iXを用いた薬剤感受性試験はさらなる検討が必要であると考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
