Abstract
過ヨウ素酸メセナミン銀染色は，腎臓の病理組織学的な観察をする上で重要な染色の一つである。しかし，切片厚や銀反応時間の曖昧さなどから，染色性にバラツキが生じやすい染色法とされる。今回我々は，本染色におけるメセナミン銀反応中の経時的変化および経時的変化を利用した反応終点と有用性について検討した。対象には腎パラフィンブロックを用い，2 μm厚で薄切した。銀液の加温は攪拌効果と反応時間短縮のためにマイクロウェーブ，マイクロウェーブを使わない方法としてパラフィン溶融器を使用した。反応温度は，銀反応過程を観察しやすい45℃と本染色に一般的である65℃を用いた。染色法にはチオセミカルバジドを用いた過ヨウ素酸メセナミン銀染色に従い，メセナミン銀染色における経時的染色性の変化と反応終点について，顕微鏡下での視覚的評価を行った。銀反応の経時的な変化はメサンギウム基質に次いで糸球体基底膜，尿細管刷子縁の順に黒色呈色反応が進んだ。反応終点は糸球体基底膜，メサンギウム基質が黒色を呈し，同時に尿細管刷子縁が一本の線状に茶褐色または茶色変化を示した時点を終点とすることで良好な染色性が得られ，染色の再現性が向上した。
Translated Abstract
Periodic acid–methenamine silver (PAM) staining is often used for the histopathological examination of kidney tissues. However, this technique has low reproducibility, especially with thick sections, as the silver reaction is difficult to control. Therefore, we attempted to improve the staining technique by changing the sequence of the methenamine silver reaction, the actual conditions, and the endpoint of the method. We then examined the effects of these changes on staining quality. The typical target thickness of formalin-fixed paraffin-embedded kidney sections is 2 μm. Slides are placed in a heated silver solution and microwaved to achieve a stirring effect and shorten the reaction time. The silver reaction can be easily controlled at 45°C, although the reaction temperature typically reaches 65°C. The application of thiosemicarbazide after PAM staining is extremely useful in microscopy. At high temperatures, the methenamine silver reaction clearly shows the mesangium, glomerular basement membrane (GBM), and renal tubular brush border (RTBB) because of their different color tones. Optimal staining resulted in black staining of the GBM, but brown staining of the RTBB. In conclusion, optimal visualization with reproducible results is obtained by using thiosemicarbazide at high temperatures after PAM staining compared with conventional silver staining.
I はじめに
過ヨウ素酸メセナミン銀（Periodic Acid-Methenamine silver；以下，PAM）染色は，腎臓の糸球体基底膜（glomerular basement membrane；以下，GBM）病変を観察する際に，HE，PAS，AZAN，マッソン・トリクローム染色（Masson-trichrome）と共に行われる重要な染色法の一つである。本染色は，過ヨウ素酸により，組織内多糖類及び多糖体蛋白の1，2グリコールをアルデヒド化して，メセナミン銀錯塩イオンが還元して黒色を呈する染色法である1)。GBMのスパイク形成，二重化，メサンギウム基質（mesangium；以下，MES）の変化を観察するのに適した染色法であり，良好なPAM染色を行うことが病理診断を行う上で重要である2)。
しかし，本染色は薄い切片を使用するため，切片厚や鍍銀反応時間のバラツキが染色結果に影響を及ぼすため，一定の染色性を得にくい染色法とされる。本染色の再現性向上には，鍍銀反応の見極めを安定化させることが重要である。
腎臓におけるPAM染色は，GBMが黒色へと呈色した反応点を反応終点としているが，次の手順である塩化金による調色や，チオ硫酸ナトリウムによる定着により鍍銀反応時に黒色を呈していたものが，茶色や薄い黒色という具合に不完全な仕上がりとなることがある。このように，反応の終点を見極める際の不安定さが，本染色性の染まりが不安定になる原因となっている。
今回我々は，メセナミン銀による鍍銀反応終点の決定が重要と考え，腎糸球体の観察におけるPAM染色の再現性向上を目的として検討を行った。また，検討結果から導いた反応終点を用いて，再現性向上の有無についても検討した。
II 材料と方法
1． 材料
薄切切片は，組織の大きさを確保するため，剖検腎を用いた。固定には10%中性緩衝ホルマリンを用い，パラフィンブロックを作製した。2 μm厚で薄切した後，20分割し，分割した薄切片をそれぞれ別のスライドガラスに貼り付けた。
2． 検討条件
鍍銀反応の際の加温方法には当院で日常的に使用しているマイクロウェーブ（microwave；以下MW）（MI77型マイクロウェーブ：東屋機械）とMWを用いない方法としてパラフィン溶融器（パラフィンオーブンPM-401：サクラファインテックジャパン）を用いた。鍍銀反応の温度には反応が緩徐に進み，銀反応過程が観察しやすい45℃と鍍銀反応に一般的である65℃を用いた3)。MWでは加温開始直後に切片を銀液に浸けた。パラフィン溶融器では銀液調整後30分予備加温を行い，ホウ砂・ゼラチンを添加直後に，銀液に浸した。
なお，染色手順はTable 1に示すチオセミカルバジドを用いた林ら4),5)の変法に従った。メセナミン銀液は精製水90 mLにヘキサメチレンテトラミン（関東化学）1.5 gを溶解して，5%硝酸銀（和光純薬）を5 mL添加して攪拌，白濁消失後，5%ホウ砂（和光純薬）を5 mL加えた処方を用いた。これに加え，パラフィン溶融機を用いた65℃での鍍銀反応には1%ゼラチン水溶液を0.2 mL非特異的銀反応防止のために添加した3)。
Table 1 今回の検討に用いたPAM染色の手順
| 1． |
脱パラフィン |
| 2． |
水洗 |
| 3． |
0.5%過ヨウ素酸…10分 |
| 4． |
水洗…5分 |
| 5． |
0.5%チオセミカルバジド…5分 |
| 6． |
水洗 精製水で洗う |
| 7． |
メセナミン銀…45℃又は65℃にて加温 |
| 8． |
軽く水洗後精製水で洗う |
| 9． |
0.2%塩化金…5分 |
| 10． |
水洗 精製水で洗う |
| 11． |
2%チオ硫酸ナトリウム…2分 |
| 12． |
水洗 精製水で洗う |
| 13． |
ヘマトキシリン…5分 |
| 14． |
水洗…5分 |
| 15． |
エオジン…3分 |
| 16． |
脱水・透徹・封入 |
45℃，MWを用いた方法と65℃，パラフィン溶融器を用いた方法の2種類の方法で鍍銀反応を行った。GBM，MES，近位尿細管刷子縁（renal tubular brush border；以下，RTBB）について鍍銀反応開始15分後から，5分おきに黒色を呈するまで，顕微鏡下で観察した。
2） 鍍銀反応における反応終点の検討
検討1の結果を受けて，銀反応には銀反応過程が観察しやすい45℃，MWを用いた方法を用いた。
経時的に鍍銀反応終点を複数設定して，顕微鏡下で糸球体を撮影した。
それぞれのPAM染色完了標本の染色性を比較して，最適な反応終点を求めた。その際，PAM染色完了標本においてGBMが全周性に黒色を示した切片を最適な染色標本とした。その時の鍍銀反応終点の撮影画像についてGBMの黒色程度，MES，RTBBの呈色の程度を分析した。
3） 反応終点の利用による染色性向上の有無
従来のGBMのみの，呈色程度による反応終点（従来法）と検討2より導き出したGBM，MES，RTBBを組み合わせた反応終点（本法）を用いて，5名の病理技師によりPAM染色を行い，染色性を比較した。
比較方法は下記に示す染色性を点数化して評価した。強拡大（400×）において1つの糸球体のGBMを観察して黒色程度が黒色部分なし（0点）50%未満が黒色（1点）50～79%が黒色（2点）80～100%が黒色（3点）またはGBMの観察が困難なほどの過反応（観察困難）とした（Figure 1）。
III 結果
1． メセナミン銀液反応中の腎臓組織切片の経時的色調変化の観察
1） MWを用いた45℃での鍍銀反応
MESでは反応開始から15～20分で黄褐色変化，25～30分で茶褐色変化，50～55分で黒色変化を示した。
GBMでは反応開始から20～25分で黄褐色変化，30～35分で茶褐色変化，60～65分で黒色変化を示した。
RTBBでは反応開始から30～35分で黄褐色変化，40～45分で茶褐色変化，60～65分で一本の線状に茶褐色変化を示した。
2） パラフィン溶融器を用いた65℃での鍍銀反応
MESでは反応開始から15～20分で黄褐色変化，25～30分で茶褐色変化，40～45分で黒色変化を示した。
GBMでは20～25分で黄褐色変化，30～35分で茶褐色変化，45～50分で黒色変化を示した。
RTBBでは30～35分で黄褐色変化，40～45分で茶褐色変化，50分で一本の線状に茶褐色変化を示した（Table 2, Figure 2）。
Table 2 メセナミン銀液反応中の腎臓組織切片の経時的色調変化
|
反応条件 |
黄褐色 |
茶褐色 |
黒色 |
| MES |
45℃ MW |
15～20 |
25～30 |
50～ |
| 65℃溶融器 |
15～20 |
25～30 |
40～ |
| GBM |
45℃ MW |
20～25 |
30～35 |
60～ |
| 65℃溶融器 |
20～25 |
30～35 |
45～ |
| RTBB |
45℃ MW |
30～35 |
40～45 |
80～ |
| 65℃溶融器 |
30～35 |
40～45 |
70～ |
鍍銀反応呈色の黒色化の順番はMES→GBM→RTBBであった。RTBBが黒色化するまで反応を進めるとGBM，MESが過染となるため，RTBBを反応終点の見極めに使用した。45℃，MWを用いた方法では，反応開始から約60～65分でGBMおよびMESが黒色を呈し，RTBBが1本の線状に茶褐色～茶色を呈した時点で反応を止めた場合，最良の反応終点となった（Figure 3）。
3． 反応終点の利用による染色性向上の有無
65℃，パラフィン溶融器の条件ではA，Bの2名45℃，MWの条件ではC，D，Eの3名に染色性の向上がみられた（Table 3）。
Table 3 反応終点の利用による染色性向上の有無
| 実施技師 |
終点／加温温度 |
強拡大にて
GBM黒色程度
|
| A |
従来法/45℃ |
3 |
| 本法/45℃ |
3 |
| 従来法/65℃ |
2 |
| 本法/65℃ |
3 |
| B |
従来法/45℃ |
2 |
| 本法/45℃ |
2 |
| 従来法/65℃ |
1 |
| 本法/65℃ |
3 |
| C |
従来法/45℃ |
観察困難 |
| 本法/45℃ |
2 |
| 従来法/65℃ |
3 |
| 本法/65℃ |
2 |
| D |
従来法/45℃ |
2 |
| 本法/45℃ |
3 |
| 従来法/65℃ |
3 |
| 本法/65℃ |
3 |
| E |
従来法/45℃ |
2 |
| 本法/45℃ |
3 |
| 従来法/65℃ |
3 |
| 本法/65℃ |
3 |
IV 考察
PAM染色はJones6)により腎GBMの染色法として考案され，現在においてもGBMの観察には欠かすことのできない重要な染色のひとつであり，薄切厚とメセナミン銀による鍍銀反応が重要な手技とされる。PAM染色における薄切は通常のHE標本などと比べ，薄く切ることが重要であり7)，これは腎GBMの肥厚や棘形成，二重化といった所見を観察するために，GBMをできるだけ垂直断で観察したい4)という理由から可能な限り薄い切片を作ることが必要とされる7)。
メセナミン銀による鍍銀反応は，酸化により生じたアルデヒド基によりメセナミン銀錯体を還元して黒色を呈する反応であり，染色方法については様々な報告がされている3)～5)。
Jones法や矢島変法8)は銀反応時間が長いため，非特異的銀鏡反応がみられ，染色手技に熟練を要する方法である。林ら4),5)のチオセミカルバジドを用いて，還元性を向上させ，反応時間を短縮する方法や，ゼラチンを添加する方法，ホウ砂を反応直前に添加する方法3)などの改良により非特異的銀鏡反応を抑制することが可能となった。
しかしながら，鍍銀反応における反応終点は個人の感覚により決めているのが現状であり，染色術者や施設間によりばらつきがある。このように，感覚的に決めている反応終点を目安となる呈色変化に変えることにより，本染色の再現性向上が可能と考えた。検討1において，メセナミン銀液中の経時的色調変化の観察を行った。いずれの反応条件においても，MESは25～30分，GBMでは30～35分，RTBBでは40～45分で茶褐色変化を示した。GBM黒色変化までの反応時間は65℃，パラフィン溶融器条件では45～50分であったのに対し，45℃，MW条件では60～65分であった。磯崎9)による，メセナミン銀反応が二段階である，という報告は今回の経時的変化に一致している。茶褐色変化までは過ヨウ素酸による酸化で変化した部位に，メセナミン銀液中の銀イオンや銀アンモニア錯体が吸着した色調変化と考えられ，黒色変化は加温され生成された，アルデヒドにより銀の核が還元された反応だと考えられる。そのため茶褐色変化から黒色変化までの反応時間は温度が高く，アルデヒドを生成する速度の速い65℃での反応のほうが45℃での反応に比べ，時間を要しなかったと考えられる。
反応開始からGBMに次いでRTBBが反応することからRTBBを指標の一つとすることで鍍銀反応のコントロールを可能にすると考え，検討2を行った。
GBMが黒色変化した時点のみを反応終点に用いて反応を行うと反応不足である染色結果となった（Figure 3A'）。これは鍍銀以後の調色，定着により黒色成分である銀単体の成分が減少するためと考えられる。GBMが黒色変化を示し，同時にRTBBが黒色を示す反応終点ではMESが不明瞭に観察され，反応過剰である染色結果となった（Figure 3C'）。
これはGBMが特異的に素早く還元され，黒色化するのに対し10)，RTBBはチオセミカルバジドのみの還元作用により1)黒色化までに時間を要しその間に，GBMの緻密層のみならず，外透明層や内透明層まで黒色化したためと考えられる2)。
GBMが黒色変化を示し，同時にRTBBが一本の線状に茶褐色～茶色変化を示す時点を反応終点とすることで最良の結果が得られた（Figure 3B'）。
RTBBを反応終点の目安に用いるのは，山田の報告10)とも一致する。尿細管に病変がある場合にはRTBBを指標とすることは困難であるが，膜性腎症のような尿細管傷害を受けることが稀な糸球体病変を有する場合にはRTBBを指標と用いることができるため有用であると考えられる。
RTBBを指標とできない症例には，動脈の平滑筋細胞膜が黒色に染色されて籠の目状構造が明瞭となる反応終点を用いる阿部の報告2)は有用である。
だが，MESの主要な細胞は平滑筋細胞と類似したミクロフィラメントを持つ細胞であり11)，GBMが黒色を呈するより前に，黒色を示し始めるため注意が必要であると考えられる。
検討3の結果から45℃，MW条件ではC，D，Eの3名の染色性が向上した。Cの術者は従来法では観察困難，本法では2点となり反応過剰傾向にあった染色性が改善した。65℃，パラフィン溶融器条件ではA，Bの2名の染色性が向上した。Aの術者は従来法では2点，本法では3点，Bの術者では従来法では1点，本法では3点であり，反応不足傾向にあった染色性が改善された。
しかし，Bの術者が45℃，MW条件で従来法2点，本法2点で再現性に差がないこと，Cの術者が65℃，パラフィン溶融器条件で従来法3点，本法2点と再現性が低下していることなどから反応終点にRTBB以外の更なる詳細な条件設定が必要だと考えられる。
今回の検討から鍍銀反応中の経時的変化の理解が鏡検すべきタイミングの把握につながり，反応中の確認作業時に室温下にさらす機会を減らすことができ，本染色の効率化および染色の再現性が向上した。
本検討は順天堂大学医学部医学系研究等倫理委員会による承認を受けている（研究課題番号：U20-0073）。
本検討内容は第70回日本臨床医学検査学会にて発表した。
COI開示
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
文献
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