2024 Volume 73 Issue 4 Pages 674-683
薬剤感受性検査は適切な抗菌薬治療を実施するために重要な検査であるが，栄養要求の厳しい一部の菌種ではその実施は困難な場合がある。今回我々は，Corynebacterium属，Nocardia属，迅速発育抗酸菌群（RGM）および嫌気性菌など複数の菌種についてClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）に準拠したドライプレートDP1R（栄研化学）の性能評価を多施設共同で実施した。評価方法としてATCC株を用いて5回同時測定と5日間測定の計10回測定を7施設にて実施し，各株について合計70回の測定の結果から複数施設における同時再現性と日差再現性について検証した。また，臨床分離株を用いた感受性調査として，Corynebacterium属38株，Nocardia属34株，RGM 67株および嫌気性菌33株について実施した。今回検証したDP1Rは，複数施設における同時再現性，日差再現性においても許容範囲内であると思われ，十分使用可能な性能を備えたプレートであることが示唆された。DP1Rは複数菌種を対象としてCLSI準拠方法で検査が実施できるため，精度保証の観点からも有用である。DP1Rを用いた新たな検査方法で実施された薬剤感受性検査の結果は，適切な抗菌薬治療の選択に大きく貢献できるものと期待される。
Antimicrobial susceptibility testing is an important test for determining appropriate antimicrobial therapy. This study, based on the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), measures the antimicrobial susceptibility of various bacterial species including Corynebacterium, Nocardia, Rapidly Growing Mycobacteria (RGM), and sophisticated anaerobes . We fabricated a custom panel dry plate DP1R (Eiken Chemical Co., Ltd.) which allows concentration measurement, and conducted performance evaluations in collaboration with other institutions. The ATCC strain was used as the evaluation method, and a total of 10 measurements, 5 simultaneous measurements over 5 days, were conducted at 7 facilities to investigate the convergence of MIC values. In addition, 38 Corynebacterium isolates, 34 Nocardia isolates, 67 RGM isolates, and 33 anaerobic isolates were tested for MIC values using clinical isolates. As a result, the DP1R tested this time was considered to be within the acceptable range. Simultaneous reproducibility and inter-day reproducibility across multiple facilities are also good, and it can be seen that the plate performance is sufficient for use. It is also useful from an accuracy assurance standpoint because it can test multiple bacterial species using a CLSI-compliant method. The results of antimicrobial susceptibility testing using a new testing method with DP1R are expected to greatly contribute greatly to the selection of appropriate antimicrobial a treatment.
本邦におけるCorynebacterium属，Nocardia属，迅速発育抗酸菌群（rapidly growing mycobacteria; RGM）および嫌気性菌などの栄養要求の厳しい菌種の薬剤感受性検査は，普段使用されている自動測定機器で測定が困難な場合が多いため，自施設での適切な実施率は低い可能性がある。われわれは2019年度日臨技近畿支部微生物部門研修会において，「栄養要求の厳しい菌種における薬剤感受性検査」をテーマとした実技研修会を実施した。その際に，複数の菌属（種）を対象としたCLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）に準拠した推奨ブレイクポイント近辺濃度の測定を可能とするオーダーパネルのドライプレート（栄研化学）を作製し，これを使用した研修会を実施した。このたび，その経験を基に新規作製されたドライプレート‘栄研’DP1R（以下DP1R，栄研化学）の日常検査への導入を目的とし，各種菌株を用いた本プレートの性能評価を多施設共同で検討した。
4菌種の標準株としてCorynebacterium striatum ATCC 6940，Mycobacterium peregrinum ATCC 700686，Nocardia nova ATCC BAA-2227，Bacteroides fragilis ATCC 25285を使用し，DP1Rにて微量液体希釈法を用いた薬剤感受性検査を実施した。測定は，近畿地区の7医療施設において，同時再現性として5回の同時測定を，日差再現性として5日間の別日測定を実施し，各標準菌株について計70回の測定を実施した。これらの複数施設における同時再現性と日差再現性について検証し，DP1Rパネルの性能を評価した。CLSIにて管理限界値が設定されている薬剤においては限界値内を許容範囲とし，未設定菌種や薬剤，および測定濃度が管理限界値外となる薬剤においては，7施設によるMIC測定の中央値±1管を許容範囲と設定し，その割合を算出した。尚，7施設には各菌種に対するCLSIドキュメントに基づいた接種菌量や判定時間，判定方法などのプロトコールについて共有した（Table 1）。
| 工程 | 条件 | Corynebacterium属 | 嫌気性菌 | Nocardia 属 | 迅速発育抗酸菌（RGM） |
|---|---|---|---|---|---|
| 前培養 | 培地 | 血寒M58 | 血寒M58 | 血寒M58 | 血寒M58 |
| 環境 | 好気培養 | 嫌気培養 | 好気培養 | 好気培養 | |
| 湿度 | 35 ± 2℃ | 35 ± 2℃ | 35 ± 2℃ | 28 ± 2℃ | |
| 時間 | 20～24時間 | 24～48時間 | 2日間～ | 2日間～ | |
| 菌液調整濃度 | 濃度 | McF 1.0 | McF 2.0 | McF 0.5 | McF 0.5 |
| 使用培地 | 滅菌生理食塩水 | 嫌気性菌用ABCMブロス | 滅菌生理食塩水 | 滅菌生理食塩水 | |
| 接種菌量 | 添加量 | 25 μL | 25 μL | 60 μL | 60 μL |
| 使用培地 | MHB | 感受性用ブルセラブロス | MHB | MHB | |
| （サプリメント添加） | |||||
| プレート培養 | 環境 | 好気培養 | 嫌気培養 | 好気培養 | 好気環境 |
| 温度 | 35℃ | 35 ± 1℃ | 35 ± 2℃ | 30 ± 2℃ | |
| 判定時間 | 24～48時間 | 46～48時間 | 48時間～5日間 | 48時間～5日間 | |
| 判定方法 | 発育陽性：1 mm以上の発育または沈殿物2個以上の発育 発育陰性：沈殿物なしまたは沈殿物1 mm以下が1個以下 ST：80%発育抑制。 |
発育陽性：1 mm以上の発育または沈殿物2個以上の発育 発育陰性：沈殿物なしまたは沈殿物1 mm以下が1個以下 ST：80%発育抑制。 |
発育陽性：明らかな発育 発育陰性：発育なし ST：80%発育抑制 |
発育陽性：明らかな発育 発育陰性：発育なし ST：80%発育抑制 CAM：最大14日間培養 |
|
| 備考 | 24時間でβラクタム系抗菌薬が感性であれば48時間まで培養を延長して確認。 | 48時間で十分な発育があれば判定し，以後最長5日まで延長して判定。 | マクロライド系抗菌薬に感性を示した菌種は，全菌種14日まで延長培養を実施。 | ||
血寒M58：ポアメディア®羊血液寒天培地M58，MHB：Mueller-Hinton Broth，ST：Sulfamethoxazole/Trimethoprim，CAM：clarithromycin，サプリメント：ストレプトヘモサプリメント
近畿地区7医療施設で臨床分離された保存菌株168株（Corynebacterium属38株，Nocardia属30株，RGM67株，および嫌気性菌群としてBacteroides fragilis group 33株）を使用し，DP1Rを用いて微量液体希釈法にてMIC値を測定した（Table 2）。判定方法としてCLSIで“S”と判定されるカテゴリーに含まれるMICを示した全菌株数に対する割合を“%S”（%S: percentage of susceptible isolates）とした。菌種同定にはMALDI Biotyper®（ブルカージャパン株式会社）（MBT compass 4.1）を用いた同定を実施した。Mycobacterium abscessus complexの亜種同定については，KANEKA DNA Chromatography MABC/erm (41)（カネカ株式会社）を用いて遺伝子学的同定を実施した。
| 菌種 | No. |
|---|---|
| Corynebacterium striatum | 16 |
| Corynebacterium pseudodiphtheriticum | 5 |
| Corynebacterium propinquum | 5 |
| Corynebacterium amycolatum | 3 |
| Corynebacterium aurimucosum | 3 |
| Corynebacterium accolens | 2 |
| Corynebacterium afermentans | 1 |
| Corynebacterium urealyticum | 1 |
| Corynebacterium resistens | 1 |
| Corynebacterium riegelii | 1 |
| Nocardia cyriatigeorgica | 6 |
| Nocardia nova complex | 5 |
| Nocardia asteroides complex | 2 |
| Nocardia farcinica | 3 |
| Nocardia brasiliensis | 1 |
| Nocardia concava | 1 |
| Nocardia mexicana | 1 |
| Nocardia araonensis | 1 |
| Nocardia vinacea | 1 |
| Nocardia sp. | 13 |
| Bacteroides fragilis | 23 |
| Bacteroides thetaiotaomicron | 5 |
| Bacteroides vulgatus | 2 |
| Bacteroides ovatus | 1 |
| Parabacteroides distasonis | 1 |
| Parabacteroides goldsteinii | 1 |
| Mycobacterium abscessus | 26 |
| Mycobacterium fortuitum | 11 |
| Mycobacterium chelonae | 10 |
| Mycobacterium massiliense | 8 |
| Mycobacterium mageritense | 2 |
| Mycobacterium peregrinum | 2 |
| Mycobacterium sp. (RGM） | 8 |
薬剤感受性検査は，ドライプレート‘DP1R’を用いて実施し，結果の判定は各菌種に応じたCLSIドキュメントに準拠して実施した（Table 2）。DP1Rに含まれる抗菌薬は，penicillin G（PCG），ampicillin（ABPC），sulbactam/ampicillin（SBT/ABPC），clavlanic acid/amoxicillin（CVA/AMPC），tazobactum/piperacillin（TAZ/PIPC），cefmetazol（CMZ）cefotax（CTX），ceftriaxone（CTRX），imipenem（IPM），meropenem（MEPM），amikacin（AMK），tobracin（TOB），azithromycin（AZM），clarithromycin（CAM），clindamycin（CLDM），levofloxacin（LVFX），moxifloxacin（MFLX），metronidazole（MNZ），Vancomycine（VCM），Linezolid（LZD），Minomycine（MINO），およびSulfamethoxazole/Trimethoprim（ST）であり，これらの22薬剤から各菌種に対応した抗菌薬について薬剤感受性検査を実施した。
4． 各菌種におけるDP1Rの測定手順 1） Corynebacterium属CLSI M-451)に準拠してCorynebacterium属に対する薬剤感受性検査を実施した（Table 1）。前培養としてポアメディア®羊血液寒天培地M58（以下，血寒M58，栄研化学）を用いて20～24時間の好気培養を行った。次に，滅菌生理食塩水にMcF 1.0の濁度で調製した菌液25 μLを，馬溶血液（ストレプトヘモサプリメント，栄研化学）を含有したMueller-Hinton Broth（以下MHB，栄研化学）12 mLに加えたものを培養液としてプレートに接種した。プレートは好気条件（35℃ ± 2℃）にて24～48時間の培養を行った。判定方法はドライプレートの添付文書に従い，1 mm以上の発育または2個以上の発育があったものを発育陽性とし，沈殿物なし，または1 mm以下の沈殿物が1個以下の場合を発育陰性とした。STは80%以上発育が阻止されたウエルを発育陰性とした。感受性判定基準もCLSI M-45に従った。
2） 嫌気性菌CLSI M-112)に準拠して嫌気性菌に対する薬剤感受性検査を実施した（Table 1）。前培養として血寒M58を用いて24～48時間の嫌気培養を行った。次に，嫌気性菌用ABCMブロス（栄研化学）にMcF 2.0の濁度で調製した菌液25 μLを感受性ブルセラブロス（栄研化学）12 mLに加えたものを培養液としてプレートに接種した。プレートは嫌気条件（35℃ ± 1℃）にて46～48時間の培養を行った。判定方法は，1 mm以上の発育または2個以上の発育があったものを発育陽性とし，沈殿物なし，または沈殿物1 mm以下が1個以下のものを発育陰性とした。感受性判定基準はCLSI M100-S313)に従った。
3） Nocardia属CLSI M-244)に準拠してNocardia属に対する薬剤感受性検査を実施した（Table 1）。前培養として血寒M58を用いて2日以上の好気培養を行った。次に，滅菌生理食塩水にMcF 0.5の濁度で調製した菌液60 μLをMHB 12 mLに加えたものを培養液としてプレートに接種した。プレートは好気条件（35℃ ± 2℃）にて48時間の培養を行った。判定方法はCLSI M-244)に準拠し，明らかな発育があれば陽性とした。また，48時間で十分な発育があれば判定し，以降最長5日間まで培養して判定した。また，STは80%発育抑制されたものを発育陰性とした。感受性判定基準はCLSI M-625)に従い実施した。
4） RGM群CLSI M-244)に準拠してRGMに対する薬剤感受性検査を実施した（Table 1）。前培養として血寒M58を用いて48時間の好気培養を行った。次に，滅菌生理食塩水にMcF 0.5の濁度で調製した菌液60 μLをMHB 12 mLに加えたものを培養液としてプレートに接種した。プレートは好気条件（30℃ ± 2℃）にて48時間～5日の培養を行った。判定方法は，明らかな発育を認めたものは発育陽性とし，明らかな発育が認められないものを発育なしとした。また，CAMにおいては5日以内に感性（susceptible; S）と判定された場合には，14日間延長培養にて耐性誘導結果を確認し，STは80%発育抑制されたものを発育陰性とした。感受性判定基準はCLSI M-625)に従い実施した。
C. striatum ATCC 6940の測定結果は，同時測定では全薬剤が100%許容範囲内に収束し，別日測定ではMEPMが94.3%，LVFXが97.1%を示したが，他の薬剤は100%の許容範囲内であり（Table 3），同時再現性および日差再現性は共に高い一致率を示した。
| Antibiotics | Range | 再現性試験 | 結果MIC値（株数） | 中央値 | 完全一致率（%） | 1管差以内 一致率（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| PCG | 0.12–2 | A | ≤ 0.12（5），0.25（30） | 0.25 | 85.7 | 100 |
| B | ≤ 0.12（8），0.25（27） | 0.25 | 77.1 | 100 | ||
| ABPC | 0.25–2 | A | 0.25（5），0.5（24），1（6） | 0.5 | 68.6 | 100 |
| B | 0.25（5），0.5（22），1（8） | 0.5 | 62.9 | 100 | ||
| CMZ | 4–32 | A | ≤ 4（35） | ≤ 4 | 100 | 100 |
| B | ≤ 4（35） | ≤ 4 | 100 | 100 | ||
| CTX | 1–32 | A | ≤ 1（35） | ≤ 1 | 100 | 100 |
| B | ≤ 1（31），2（4） | ≤ 1 | 88.6 | 100 | ||
| CTRX | 1–32 | A | ≤ 1（5），2（30） | 2 | 85.7 | 100 |
| B | ≤ 1（5），2（29），4（1） | 2 | 82.9 | 100 | ||
| IPM | 2–16 | A | ≤ 2（35） | ≤ 2 | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（35） | ≤ 2 | 100 | 100 | ||
| MEPM | 0.12–16 | A | ≤ 0.12（28），0.25（7） | ≤ 0.12 | 80 | 100 |
| B | ≤ 0.12（31），0.25（2），0.5（2） | ≤ 0.12 | 88.6 | 94.3 | ||
| AMK | 4–32 | A | ≤ 4（35） | ≤ 4 | 100 | 100 |
| B | ≤ 4（35） | ≤ 4 | 100 | 100 | ||
| TOB | 1–8 | A | ≤ 1（35） | ≤ 1 | 100 | 100 |
| B | ≤ 1（35） | ≤ 1 | 100 | 100 | ||
| CAM | 0.5–4 | A | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 | ||
| CLDM | 0.5–4 | A | ≤ 0.5（20），1（15） | ≤ 0.5 | 57.1 | 100 |
| B | ≤ 0.5（12），1（21），2（2） | 1 | 60 | 100 | ||
| LVFX | 0.5–4 | A | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（32），1（2），2（1） | ≤ 0.5 | 91.4 | 97.1 | ||
| MINO | 0.5–4 | A | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 | ||
| VCM | 0.5–4 | A | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（35） | ≤ 0.5 | 100 | 100 | ||
| LZD | 2–16 | A | ≤ 2（35） | ≤ 2 | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（35） | ≤ 2 | 100 | 100 | ||
| ST | 9.5/0.5–38/2 | A | ≤ 9.5/0.5（10），19/1（18），38/2（7） | 19/1 | 51.4 | 100 |
| 38/2 | B | ≤ 9.5/0.5（5），19/1（21），38/2（9） | 19/1 | 60 | 100 |
A：同時再現性評価（同時測定），B：日差再現性評価（別日測定），下線付きMIC値は一管差範囲外，MIC値：μg/mL
B. fragilis ATCC 25285の測定結果は，同時測定ではSBT/ABPCの94.3%が管理限界値内を示し，他の薬剤はすべて許容範囲内に100%収束した。別日測定ではMNZが97.1%の管理限界値であり，他の薬剤はすべて許容内に100%収束した（Table 4）。同時再現性および日差再現性は共に高い一致率を示した。
| Antibiotics | Range | 管理限界 | 再現性試験 | 結果MIC値（株数） | 1管差以内 一致率（%） |
管理限界値内 割合（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| PCG | 0.12–2 | 8–32 | A | > 2（35） | 100 | NA |
| B | > 2（35） | 100 | NA | |||
| CVA/AMPC | 2/4–16/8 | 0.125/0.25–0.5/1 | A | ≤ 4/2（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 4/2（35） | 100 | NA | |||
| SBT/ABPC | 1/2–8/16 | 0.25/0.5–1/2 | A | ≤ 1/2（33），2/4（1），4/8（1） | 97.1 | 94.3 |
| B | ≤ 1/2（35） | 100 | 100 | |||
| TAZ/PIPC | 4/8–4/64 | 0.03/4–0.25/4 | A | ≤ 4/8（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 4/8（35） | 100 | NA | |||
| IPM | 2–16 | 0.03–0.25 | A | ≤ 2（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 2（35） | 100 | NA | |||
| MEPM | 0.12–16 | 0.03–0.25 | A | ≤ 0.12（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.12（35） | 100 | 100 | |||
| CLDM | 0.5–4 | 0.5–2 | A | ≤ 0.5（30），1（5） | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（22），1（13） | 100 | 100 | |||
| MFLX | 0.5–4 | 0.125–0.5 | A | ≤ 0.5（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（35） | 100 | 100 | |||
| LZD | 2–16 | 2–8 | A | ≤ 2（15），4（20） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（4），4（31） | 100 | 100 | |||
| MNZ | 2–16 | 0.25–2 | A | ≤ 2（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（34），> 16（1） | 97.1 | 97.1 |
A：同時再現性評価（同時測定），B：日差再現性評価（別日測定），下線付きMIC値は管理限界値外，NA，not applicable，MIC値：μg/mL
N. nova ATCC BAA-2227の測定結果は（Table 5）に示した。同時測定ではCTRXの許容内割合が40%と低値となったが，2施設はすべて範囲内，3施設はすべて範囲外，2施設は範囲内外が混在との結果であり，結果に大きな施設間差の偏りを認めた。CVA/AMPCとMINOの範囲内割合は85.7%，TOBで97.1%，その他の薬剤では100%を示した。別日測定では，CTRXとCVA/AMPCが45.7%，MINOが71.4%と低い割合であったが，こちらも範囲内施設と範囲外施設に同様の施設間差の傾向を認めた。IPM，CAM，LZDおよびST合剤では100%範囲内であった。
| Antibiotics | Range | 管理限界値 | 再現性試験 | 測定値（株数） | 1管差以内 一致率（%） |
管理限界値内 割合（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CVA/AMPC | 2/4–16/8 | 8/4–128/64 | A | ≤ 4/2（5），8/4（7），16/8（2），> 16/8（21） | 65.7 | 85.7 |
| B | ≤ 4/2（19），8/4（4），16/8（1），> 16/8（11） | 65.7 | 45.7 | |||
| CTRX | 1–32 | 2–16 | A | ≤ 1（21），2（3），4（11） | 68.5 | 40 |
| B | ≤ 1（19），2（2），4（12），8（2） | 60 | 45.7 | |||
| IPM | 2–16 | 0.25–2 | A | ≤ 2（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（35） | 100 | 100 | |||
| AMK | 4–32 | ≤ 1 | A | ≤ 4（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 4（35） | 100 | NA | |||
| TOB | 1–8 | 4–64 | A | 2（1），4（5），8（6），≥ 8（23） | 82.9 | 97.1 |
| B | ≤ 1（1），2（1），4（8），8（8），≥ 8（17） | 94.2 | 94.3 | |||
| CAM | 0.5–4 | 0.03–0.25 | A | ≤ 0.5（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 0.5（35） | 100 | NA | |||
| MFLX | 0.5–4 | 1–8 | A | 1（5），2（7），4（23） | 85.7 | 100 |
| B | ≤ 0.5（1），1（9），2（9），4（16） | 97.1 | 97.1 | |||
| LZD | 2–16 | 0.5–2 | A | ≤ 2（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（35） | 100 | 100 | |||
| MINO | 0.5–4 | 1–8 | A | ≤ 0.5（5），1（2），2（18），4（10） | 85.7 | 85.7 |
| B | ≤ 0.5（10），1（8），2（14），4（3） | 91.4 | 71.4 | |||
| ST | 9.5/0.5–38/2 | 2.4/0.12–38/2 | A | ≤ 9.5/0.5（30），19/1（5） | 100 | 100 |
| B | ≤ 9.5/0.5（35） | 100 | 100 |
A：同時再現性評価（同時測定），B：日差再現性評価（別日測定），下線付きMIC値は管理限界値外，NA，not applicable，MIC値：μg/mL
M. peregrinum ATCC 700686については，同時測定ではMEPMにて74.3%，TOBにて65.7%を示し，IPM，AMK，CAM，MFLX，LZDでは100%範囲内に収束した。別日測定ではMEPMとTOBでは74.3%，MINOが94.3%，STが97.1%であり，その他は100%範囲内に収束した（Table 6）。
| Antibiotics | Range | 管理限界値 | 再現性試験 | 測定値（株数） | 1管差以内一致率（%） | 管理限界値内割合（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| IPM | 2–16 | 2–16 | A | ≤ 2（33），4（2） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（34），8（1） | 100 | 100 | |||
| MEPM | 0.12–16 | 2–16 | A | ≤ 0.12（4），0.25（1），1（3），2（13），4（11），8（1），16（2） | 77.1 | 74.3 |
| B | ≤ 0.12（5），0.25（1），0.5（1），1（1），2（13），4（11），8（3） | 71.4 | 77.1 | |||
| AMK | 4–32 | ≤ 1–4 | A | ≤ 4（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 4（35） | 100 | 100 | |||
| TOB | 1–8 | 2–8 | A | ≤ 1（12），2（8），4（15） | 65.7 | 65.7 |
| B | ≤ 1（9），2（10），4（14），8（2） | 77.1 | 74.3 | |||
| CAM | 0.5–4 | ≤ 0.06–0.5 | A | ≤ 0.5（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（35） | 100 | 100 | |||
| MFLX | 0.5–4 | ≤ 0.06–0.25 | A | ≤ 0.5（35） | 100 | NA |
| B | ≤ 0.5（35） | 100 | NA | |||
| LZD | 2–16 | 1–8 | A | ≤ 2（26），4（9） | 100 | 100 |
| B | ≤ 2（28），4（7） | 100 | 100 | |||
| MINO | 0.5–4 | 0.12–0.5 | A | ≤ 0.5（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 0.5（33），1（1），2（1） | 97.1 | 94.3 | |||
| ST | 9.5/0.5–38/2 | ≤ 4.8/0.25–38/2 | A | ≤ 9.5/0.5（35） | 100 | 100 |
| B | ≤ 9.5/0.5（28），19/1（6），> 38/2（1） | 97.1 | 97.1 |
A：同時再現性評価（同時測定），B：日差再現性評価（別日測定），下線付きMIC値は管理限界値外，NA，not applicable，MIC値：μg/mL
臨床分離株を用いた測定結果について，各菌種の測定結果およびMIC50，MIC90および%Sを算出した（Table 7）。%Sにおいて100%を示した薬剤は，Corynebacterium属ではVCMとLZD，嫌気性菌ではMNZのみ，Nocardia属ではAMKとLZD，RGMで100%を示した薬剤は認められなかった。
| Organism | Antibiotics | Range | BP | MIC50 | MIC90 | %S |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium spp. | PCG | 0.12–2 | 0.12 | ≤ 0.12 | > 2 | 50 |
| ABPC | 0.25–2 | — | 0.5 | > 2 | NA | |
| CMZ | 4–32 | — | ≤ 4 | > 32 | NA | |
| CTX | 1–32 | 1 | 2 | > 32 | 58 | |
| CTRX | 1–32 | 1 | ≤ 1 | > 32 | 45 | |
| IPM | 2–16 | — | ≤ 2 | > 16 | NA | |
| MEPM | 0.12–16 | 0.25 | ≤ 0.12 | > 16 | 58 | |
| AMK | 4–32 | — | ≤ 4 | 8 | NA | |
| TOB | 1–8 | — | ≤ 1 | > 8 | NA | |
| CAM | 0.5–4 | 0.5* | > 4 | > 4 | 21 | |
| CLDM | 0.5–4 | 0.5 | > 4 | > 4 | 16 | |
| LVFX | 0.5–4 | 0.5* | > 4 | > 4 | 32 | |
| MINO | 0.5–4 | 4* | ≤ 0.5 | 2 | 97 | |
| VCM | 0.5–4 | 2 | ≤ 0.5 | ≤ 0.5 | 100 | |
| LZD | 2–16 | 2 | ≤ 2 | ≤ 2 | 100 | |
| ST | 9.5/0.5–38/2 | 38/2 | 19/1 | > 38/2 | 66 | |
| Bacteroides fragilis group | PCG | 0.12–2 | 0.5 | > 2 | > 2 | 0 |
| ABPC | 0.25–2 | 0.5 | > 2 | > 2 | 0 | |
| CVA/AMPC | 4/2–16/8 | 4/2 | ≤ 4/2 | 16/8 | 79 | |
| SBT/ABPC | 1/2–8/16 | 4/8 | ≤ 1/2 | > 8/16 | 79 | |
| TAZ/PIPC | 4/8–4/64 | 4/16 | ≤ 4/8 | > 4/64 | 88 | |
| CMZ | 4–32 | 16 | 16 | 32 | 64 | |
| CTX | 1–32 | 16 | 16 | > 32 | 24 | |
| CTRX | 1–32 | 16 | 32 | > 32 | 30 | |
| IPM | 2–16 | 4 | ≤ 2 | 8 | 88 | |
| MEPM | 0.12–16 | 4 | 0.25 | 16 | 85 | |
| CLDM | 0.5–4 | 2 | 1 | 4 | 45 | |
| MFLX | 0.5–4 | 2 | ≤ 0.5 | 4 | 76 | |
| MINO* | 0.5–4 | 4 | 2 | 4 | 52 | |
| MNZ | 2–16 | 8 | ≤ 2 | ≤ 2 | 100 | |
| Nocardia spp. | CVA/AMPC | 2/4–16/8 | 4/8 | 4/8 | > 16/8 | 59 |
| CMZ | 4–32 | — | 16 | 32 | NA | |
| CTRX | 1–32 | 8 | 4 | 32 | 82 | |
| CTX | 1–32 | — | 2 | > 32 | NA | |
| IPM | 2–16 | 4 | ≤ 2 | > 16 | 85 | |
| MEPM | 0.12–16 | — | 1 | 4 | NA | |
| AMK | 4–32 | 16 | ≤ 4 | ≤ 4 | 100 | |
| TOB | 1–8 | 2 | ≤ 1 | > 8 | 56 | |
| CAM | 0.5–4 | 2 | > 4 | > 4 | 48 | |
| LVFX* | 0.5–4 | — | 4 | > 4 | 26 | |
| MLFX | 0.5–4 | 1 | 2 | 4 | 44 | |
| MINO | 0.5–4 | 1 | 1 | 4 | 56 | |
| LZD | 2–16 | 8 | ≤ 2 | 4 | 100 | |
| ST | 9.5/0.5–38/2 | 38/2 | ≤ 9.5/0.5 | 38/2 | 91 | |
| RGM | CMZ | 4–32 | — | 16 | 32 | NA |
| IPM | 2–16 | 4 | 4 | 16 | 63 | |
| MEPM | 0.12–16 | 4 | > 16 | > 16 | 28 | |
| AMK | 4–32 | 16 | ≤ 4 | 16 | 97 | |
| TOB | 1–8 | 2 | 4 | > 8 | 31 | |
| CAM | 0.5–4 | 2 | ≤ 0.5 | > 4 | 64 | |
| LVFX* | 0.5–4 | 2 | > 4 | > 4 | 31 | |
| MLFX | 0.5–4 | 1 | 2 | > 4 | 45 | |
| MINO | 0.5–4 | 1 | > 4 | > 4 | 19 | |
| LZD | 2–16 | 8 | 4 | 16 | 87 | |
| ST | 9.5/0.5–38/2 | 38/2 | > 38/2 | > 38/2 | 33 |
%S, percentage of susceptible isolates; NA, not applicable; RGM, Rapidly growing mycobacteria.
※同系統薬剤のBPに基づいて判定可能，MIC値：μg/mL
本邦における薬剤感受性検査は，主要な菌種においては自動測定機器の普及により自動化や標準化が進んでいる。しかしながら，栄養要求の厳しい菌種や，検出が稀な菌種では，エビデンスに基づく正しい手順が実施されているとは言い難い状況である。その一因として，このような菌種に準拠した薬剤パネル等が入手困難であったことが挙げられる。今研究で実施したDP1Rの検討は，このような状況の改善の一助となることを目的として行った。
各種ATCC株を用いた評価では，C. striatum ATCC 6940とB. fragilis ATCC 25285では高い一致率を示した。これまでのわが国におけるCorynebacterium属を対象としたCLSI準拠の薬剤感受性パネルはライサス（島津ダイグノスティクス）の専用試薬として市販されていたパネルのみであった。DP1Rを用いることで，専用機器がなくてもエビデンスに基づいたCorynebacterium属薬剤感受性検査の実施が可能となるものと思われる。Corynebacterium属の薬剤感受性検査を実施する条件としては，本菌種が原因菌となるカテーテル感染，創部感染および尿路感染など様々なケースが想定されるが，薬剤感受性パターンは菌種により異なるため，検査を実施してみないと有効な薬剤推定が難しい菌種である6)。今回C. striatum ATCC 6940での検証結果は高い一致率を示したことから，臨床へ結果報告にするに十分使用可能なパネルであると思われた。B. fragilis ATCC 25285の測定結果も管理限界値内に収束しており，DP1Rは嫌気性菌に対しても十分使用可能と思われる。嫌気性菌を対象としたCLSIでの薬剤感受性検査実施の推奨菌種は，Bacteroides属とParabacteroides属のみ対象となっているため，今研究での臨床分離株の調査はこれらの菌種に限定して実施したが，特に問題は認められなかった。
N. nova ATCC BAA-2227およびM. peregrinum ATCC 700686に対する管理限界値による評価では，薬剤によっては概ね高い一致率を示した成績であったが，一部の薬剤にて管理限界値外を示す割合が高くなる結果となった。Nocardia属とRGMのMIC値に誤差が生じた原因として，技師間差や施設間差を生じやすい作業の関与が推定された。しかし，ATCC株に対して管理限界値外を示した施設は限局しており，多くは管理限界値より低値を示す結果であった。これは，溶解が困難なラフ型コロニーの菌液調整手技や，発育が不十分な段階で早期判定がばらつきの一因となっている可能性がある。すなわち，菌液の調製手順や判定方法の基準の順守など，検査手順について十分かつ適切なトレーニングが必要であると思われた。特に，正確な菌液調製は重要なポイントとなるが，Nocardia属とRGMでは溶解が困難なコロニーも散見されるため，CLSI-M24に記載されているガラスビーズを用いたコロニーの破砕により菌液を作成することが有用である。また，MIC値の読み取りでは菌種や薬剤ごとに判定基準を遵守する必要があり，薬剤によっては判定の困難さゆえに技師間差を生む可能性がある。例えば，STの判定では80%阻止濃度が判定基準になるため，80%付近の判定は困難となる。IA60F（栄研化学）などの専用機器は，画像処理を活用したMIC値測定や，発育画像の保存による後日判定確認などを可能にするため，判定時の技師間差の減少に寄与すると予想され，これらの問題の解決策として選択肢の1つと考える。
抗酸菌に対する薬剤感受性検査については，測定薬剤や検査手順は各菌種に対応した方法で実施する必要がある4)。近年RGM感染症は増加傾向で注目されており，本邦でも薬剤感受性検査に関する報告がされている7)。DP1Rを用いることで，CLSIに準拠した方法でRGMの薬剤感受性検査を実施することが可能となる。RGMにおけるCAM誘導耐性については23s rRNA遺伝子変異型とerm遺伝子による誘導耐性型がある。変異型は3～5日でCAM耐性となるが，誘導耐性型はMIC ≥ 16 μg/mLになる時点または14日培養による判定が必要である5)。CAMの薬剤感受性結果にて5日以内でSと判定されたものを14日間延長培養した結果は，M. abscessus groupでは40.7%（27株中11株）が耐性を示し，それ以外の菌種では4.5%（22株中1株）のみ耐性となった。CAMの薬剤感受性検査は，CLSIの勧告のとおり5日以内の培養だけではvery major errorを起こす可能性があるため，Sを示す場合には14日間培養は必須であることが検証された。M. abscessus groupでは，M. abscessus subsp. abscessusやM. abscessus subsp. bolletiiがCAM耐性の可能性が高く，M. abscessus subsp. massilienseはほぼ感性となることが報告されており，亜種間によって異なることが知られている。M. abscessus groupの亜種間の正確な菌種同定は質量分析装置でも難しい場合があり，erm遺伝子の無保有や無機能などデータが十分でない菌種や，他の要因での耐性となる場合もある。以上に加え，CAMはガイドライン等でも推奨されているRGM感染症治療に適応した重要な薬剤であることも踏まえると8)，CAMの延長培養にて正しい結果を報告することは極めて重要である。測定プレートの種類が異なるものの，青野ら9)によるCLSI準拠9薬剤を用いた薬剤感受性測定の多施設評価では，MIC値がすべて基準範囲に収束した施設は52.2%に留まったと報告されている。そのため，ばらつきや施設間差が生じやすい菌種の薬剤感受性検査を導入する際には，正確な薬剤感受性検査を実施するためのトレーニングやサーベイランスが極めて重要であり，正確な薬剤感受性検査を実施できる体制を構築することが必要と考える。
今回検証したDP1Rは，複数施設における同時再現性および日差再現性ともに許容範囲内であると判断し，日常検査の使用に十分に適応した有益なプレートであると考える。さらに，このプレートは，一般に薬剤感受性試験が困難とされる複数の菌種を対象としてCLSIに準拠した検査が実施できる点，5枚包装であり有効期限内での使用が容易である点などから試薬管理や精度管理における大きな利点がある。以上より，DP1Rを活用した薬剤感受性検査の実施は，抗菌薬適正使用に大きく寄与できるものと考える。
本研究は代表施設として公立那賀病院倫理委員会の承認（No. 00035）を得て実施した。
本研究の実施に使用したドライプレートDP1R，およびブロス等の測定試薬一式は，栄研化学株式会社より提供をうけた。
本研究に際し貴重なご助言，およびご指導を賜りました京都橘大学の中村竜也先生，住友病院の幸福知己先生に深謝致します。
